动物细胞工程

细胞工程概况细胞工程概况什么是细胞工程？细胞工程概况

应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。细胞工程的发展史细胞工程概况1665年，胡克利用显微镜第一次观察到了细胞1997年，“多莉”羊的诞生1839年，施旺提出“细胞学说”1940，Earle首创单个细胞克隆培养，建立小鼠结缔组织L细胞系1978年胚胎工程技术成功培育出世界首例试管婴儿细胞工程的发展史细胞工程概况动物细胞工程植物细胞工程微生物细胞工程细胞工程的分类粮食生产畜牧生产临床医学与药物科学研究细胞工程的应用动物细胞工程主要研究内容细胞工程概况动物细胞与组织培养细胞融合细胞核移植胚胎工程干细胞与组织工程转基因动物认识细胞细胞工程概况分类：原核细胞、真核细胞大小形态：体形极微，形态多样特点：动物细胞无细胞壁认识细胞细胞工程概况细胞膜磷脂双分子层、蛋白质及糖链构成细胞质

线粒体、内质网、高尔基体、核糖体、溶酶体、中心体等细胞核

核膜、染色质、核液和核仁细胞---周期细胞工程概况

细胞的繁殖是通过细胞的分裂来实现的，连续分裂的细胞从一次分裂完成时开始到下一次分裂完成时为止。分裂真核细胞有丝分裂减数分裂无丝分裂细胞—其他活动细胞工程概况分化死亡细胞坏死细胞凋亡课堂小结细胞工程概况细胞工程概况定义发展史分类应用动物细胞工程主要研究内容细胞分类形态结构基本活动动物组织、细胞培养细胞培养及其基本原理基本原理细胞培养及其基本原理

动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中让这些细胞生长和增殖。

细胞的增殖分化原理

原代培养和传代培养过程细胞培养条件细胞培养及其基本原理培养条件无菌无毒营养物质血清血浆

温度pH气体环境细胞培养分类：细胞培养及其基本原理原代细胞培养传代细胞培养根据细胞种类贴壁细胞培养半悬浮细胞培养悬浮细胞培养根据培养方式原代培养细胞培养及其基本原理取出动物组织块剪碎胰蛋白酶或EDTA等消化加入培养基培养传代培养

原代培养的细胞为正常的动物细胞，一般培养10代后不再增殖，死亡。传代培养细胞培养及其基本原理

当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传代。细胞株与细胞系细胞培养及其基本原理细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养细胞株细胞系随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖多数组织细胞固定在表面生长和分裂细胞复苏、冻存与运输细胞复苏细胞复苏、冻存与运输防止污染（无菌操作）解冻快速细胞冻存细胞复苏、冻存与运输对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗、消化1000rpm，5min密度为5×106/ml～1×107/ml；每管1～1.5ml；标明细胞的名称，冻存时间及操作者将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜。冻存液：10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清细胞的运输01充液法运输细胞复苏、冻存与运输

选用生长性状良好的细胞，当细胞贴壁长至1/2瓶底或接近连接成片时，去掉培养液，加入新鲜培养液至培养瓶颈部（保留少量空气），拧紧瓶盖。然后乙醇消毒瓶盖并用胶带将瓶口密封，瓶周围用棉花包裹，作防震防压处理，运送过程要注意保温。02冰冻法运输

1.使用制式液氮罐运输：将细胞冻存管放入制式的运送液氮罐中进行运输，在液氮罐搬运过程中，要防止液氮外漏。2.使用装有干冰的泡沫塑料盒运输。要迅速将细胞冻存管从液氮中取出转入干冰中，否则细胞将会以10～20℃/min的速度升温，而且绝不能让细胞温度高于-50℃。动物细胞大规模培养技术培养技术动物细胞大规模培养技术

指在人工条件下（设定ph、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。

贴壁培养、悬浮培养和固定化培养类型生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素、药物等应用中应用动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合

也称细胞杂交，是指在一定的条件下将两个或多个动物细胞融合为一个细胞的过程。动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。同核体：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞。异核体：来自不同基因型的杂交细胞。自发融合：同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并。诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。动物细胞融合原理动物细胞融合原理动物细胞融合原理原理：细胞膜具有一定的流动性诱导融合因素：生物方法（病毒）化学方法（聚乙二醇PEG）物理方法（离心，震动，电刺激）基因产物：mRNA、tRNA、rRNA动物细胞融合的具体步骤动物细胞融合的具体步骤动物细胞融合的具体步骤分贴壁和悬浮细胞两种。前者可直接将两亲本细胞混合培养，后者需制成一定浓度的细胞悬浮液。细胞准备细胞融合杂种细胞选择杂种细胞克隆加促融因子于将行融合的细胞之中，诱导融合。利用选择性培养基等，使亲本细胞死亡，而让杂种细胞存活。对选出的杂种细胞进行克隆（选择与纯化），经过培养，就能获得所需要的无性繁殖系。动物细胞融合技术应用动物细胞融合技术应用动物细胞融合技术应用细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段；利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。动物细胞融合与植物细胞杂交的比较动物细胞融合与植物细胞杂交的比较动物细胞融合植物细胞杂交融合原理细胞膜流动性细胞膜流动性，植物细胞全能型融合预处理用胰岛蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散后诱导细胞融合用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后诱导原生质体融合诱导方法灭活的病毒、电激、聚乙二醇电激、振动、离心、聚乙二醇结果杂交细胞杂交植株应用制备单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素等克服远缘杂交不亲和的障碍，扩展杂交亲本范围，培育新品种思考题：思考题：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活的病毒可以作为诱导剂吗？单克隆抗体制备获得抗体的传统方法

特点：效率低，纯度低，特异性差获得抗体的传统方法

将抗原反复注入动物体,然后从动物血清中提取抗体。

如何获得大量的、特异性强的抗体？抗原吞噬细胞摄取处理T细胞抗原呈递B细胞直接刺激浆细胞增殖、分化抗体产生从动物血清中分离淋巴因子获得抗体的传统方法单克隆抗体的原理及定义

将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖获得抗体的传统方法单克隆抗体的制备制备动物免疫细胞融合细胞筛选抗体检测克隆化单抗获得单克隆抗体的制备制备抗原免疫小鼠B淋巴细胞骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞细胞融合杂交瘤细胞单克隆抗体的制备制备置于选择培养基中培养B淋巴细胞培养数天后死亡缺乏相应营养物质，骨瘤细胞死亡多孔细胞培养，筛选单一杂交瘤细胞；进行单一抗体检测多种杂交瘤细胞筛选出所需细胞扩大培养体外培养腹水中提取体内培养培养液中提取单克隆抗体单克隆抗体的特点单克隆抗体的特点特点类型合成分泌细胞提取途径功能特性生产特点传统抗体体内的多种B淋巴细胞从血清中提取种类多样特异性差纯度低产量低单克隆抗体体外培养或移植到小鼠腹腔培养的单一杂交瘤细胞产生的细胞群从杂交瘤细胞的培养液或小鼠腹腔的腹水中提取种类单一特异性强纯度高产量高单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用应用疾病诊断疾病治疗载体药物：生物导弹课堂小结课堂小结制备单克隆抗体的原理每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。骨髓瘤细胞具有无限增殖的特性。制备单克隆抗体的过程动物免疫细胞融合细胞筛选抗体检测单抗获得课后思考为什么选用B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合？细胞核移植与克隆细胞核移植与克隆细胞核移植与克隆你知道小羊“多莉”吗？细胞核移植与克隆动物细胞核移植技术

动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。细胞核移植与克隆

动物细胞核具有全能性原理分类细胞分化程度低，恢复全能性容易胚胎细胞核移植细胞分化程度高，恢复全能性不容易体细胞核移植细胞核移植与克隆核移植技术的流程细胞核移植与克隆母绵羊A

乳腺细胞

（体细胞）

母绵羊B未受精的卵细胞母绵羊C“多莉”

新的卵细胞发育成早期胚胎去核卵细胞提取细胞核核移植胚胎移植MⅡ期卵母细胞取供体细胞传代培养10代以内的细胞融合方法：电刺激细胞核移植与克隆体细胞核移植技术的应用加速家畜遗传改良保护濒危物种生产医用蛋白质组织器官的移植认识胚胎发育和衰老过程研究疾病的发展历程细胞核移植与克隆课堂小结核移植概念分类过程应用胚胎细胞核移植体细胞核移植畜牧业医疗健康细胞核采集去核卵母细胞重组胚胎构建胚胎移植克隆动物细胞核移植与克隆课后思考用体细胞核移植方法生产的克隆动物，是否对体细胞供体动物进行了100%的复制？为什么？干细胞技术干细胞技术干细胞定义及分类干细胞技术

干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞,能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。分类按分化潜能分

按来源分胚胎干细胞成体干细胞全能干细胞多能干细胞单能干细胞胚胎干细胞（ES细胞）干细胞技术

胚胎干细胞（Embryonicstemcell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞）是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞。生物学特性全能性或多能性种系传递性体外遗传可操作性无限扩增(自我更新)面临问题干细胞技术来源问题（宗教、法律及文化背景）扩增变异技术普及成体干细胞干细胞技术

成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。生物学特性多能性迁移性可调控性广泛性相对容易获取不存在组织相容性致瘤风险很低，伦理学争议较少多向分化潜能优点分析分类干细胞技术成体干细胞造血干细胞骨髓间充质干细胞神经干细胞肝干细胞肠上皮干细胞肌肉卫星细胞胰腺干细胞视网膜干细胞诱导性多能干细胞（iPS）干细胞技术

诱导性多能干细胞(Inducedpluripotentstemcell