动物基因工程

基因工程概况基因工程概况

在漫长的生物进化过程中，基因重组从来没有停止过。在自然力量和人类的干预下，通过基因重组、基因突变、基因转移等途径，生物界无止境的进化，不断使物种趋向完善，也出现了今天各具特色的繁多物种，有的能耐高温，有的不怕严寒，有的适应干旱的沙漠，有的能在高盐度海滩上或海水中不断生繁，有的能固定大气中的氮元素.......种种生物的特殊性状成为今天定向改造生物，创造新物种的丰富遗传资源。基因工程概况基因工程概况基因工程概况基因工程概况基因工程概况基因工程概况能否把这些植物的特点集中在一种植物上？基因工程概况物种间存在生殖隔离创造新物种种间杂交基因工程基因工程最突出优点：可以打破物种之间的界限，使遗传信息进行相互重组和转移一、基因工程的概念及其发展

基因工程就是应用人工方法把生物特定的遗传物质（DNA）分离出来，按照人们的设计，将遗传物质进行体外切割、拼接和重组，然后将重组的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品质；或者使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（蛋白质）的技术。基因工程概况1、基因工程的概念一、基因工程的概念及其发展基因工程概况2、基因工程的理论依据01不同基因具有相同的物质基础02基因是可以切割的

除病毒外，所有基因都是具有遗传功能的特定核甘酸序列的DNA片段，并且所有生物的DNA组成和基本结构都是一致的

基因呈直线排列在DNA链上，除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列（内含子）3.基因是可以转移的自然情况下即存在着基因转移的现象，如跳跃基因，减数分裂时等位基因之间的转移（或交换）。4.多肽与基因之间存在对应关系可以保证基因转移后，其产物不变。5.遗传密码是通用的可以保证产物的正确表达。6.基因通过复制把遗传信息传递给下一代保证转基因生物的稳定性。基因工程概况一、基因工程的概念及其发展一、基因工程的概念及其发展基因工程概况3、基因工程的发展史：（1）基因工程的准备和问世1944年，Avery(埃佛里)阐明了DNA是遗传信息的携带者

——肺炎链球菌转化实验；1953年，Watson和Crick提出了DNA的双螺旋结构模型，阐明了DNA的半保留复制模式；1958年，Crick提出了遗传信息传递从DNA到RNA再到蛋白质的中心法则；1961年，美籍印裔科学家Khorana(霍拉纳)和美国科学家Nirenberg(尼伦伯格)破译了遗传密码，揭开了DNA编码的遗传信息是如何传递给蛋白质的秘密。——理论准备基因工程概况一、基因工程的概念及其发展1970年前后，限制性核酸内切酶和DNA连接酶等被发现内森斯、史密斯1972年，发现质粒是承载外源DNA片段进入宿主细胞的理想载体，病毒、噬菌体的DNA（或RNA）也可改建成载体——技术准备1972年，Berg（博耶）首先进行了DNA体外重组技术1973年，Cohen（科恩）等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化标志着生物技术的核心技术——基因工程诞生

基因工程概况基因工程概况内森斯和史密斯是美国生物学家，1978年诺贝尔生理学及医学奖得主，他们发现了限止性核酸内切酶。内森斯(1928-)史密斯(1931-)基因工程概况美国科学家科恩和博耶合作于1970年把外源DNA插入细菌质粒，得到了功能性表达，为重组DNA技术的迅速发展打下了良好的基础。他们两人被称为“基因工程”的创始人。

博耶(1936-）科恩(1935-)一、基因工程的概念及其发展基因工程概况3、基因工程的发展史：（2）基因工程的迅速发展1978年首次在大肠杆菌中产生由人工合成基因表达的人胰岛素。1982年美、英批准使用第一例基因工程药物——胰岛素。1980年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物——转基因小鼠1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物―转基因烟草基因药物：已上市的有50种左右，上百种药物正在进行临床试验基因工程概况转基因植物：

1986年首次批准转基因烟草进行田间试验。

1994年，转基因番茄被批准商品化生产，成为第一个上市的转基因产品。

至2000年，共批准10313例转基因作物进入田间试验。

据统计，转基因至少在120种植物中获得成功，涉及性状包括抗虫、抗病毒、抗细茵、抗真菌、抗除草剂、抗逆境、品质改良，以及提高产量潜力等。

转基因作物种植面积持续增加，至2005，已达9000万公顷，种植转基因作物的国家达到21个。基因工程概况基因工程概况我们国家：已经有6种转基因植物被批准进入商品化生产，包括我国自己培育的耐储存番茄（1997）、抗虫棉（1997）、观赏植物矮牵牛（1997）、抗病毒甜椒（1998）、抗病毒番茄（1998），以及美国孟三都公司培育的抗虫棉（1997）。在上述转基因作物中，种植面积最大的是抗虫棉，到2000年底止，国产抗虫棉累计推广面积达37万公顷，减少农药用量80％，创造效益7.7亿元人民币。基因工程概况转基因动物：

已获得转生长激素基因鱼、转生长激素基因猪和抗猪瘟病转基因猪等。采用动物乳腺生物反应器技术生产的抗胰蛋白酶因子、C蛋白、凝血酶Ⅲ、葡萄糖苷酶和乳转铁蛋白等产品也已陆续上市，年产值约10亿美元。

1995年开始大量投资开发体细胞克隆技术，研发重点是生产干细胞，用于组织修补等治疗性目的。我国在转基因鱼研究上处于国际领先地位，已生产出生产性能优良的转基因鱼。同时已较好地建立了动物乳腺生物反应器和体细胞克隆技术平台。基因工程概况基因工程概况构基因工程概况

20世纪八九十年代：基因工程基础研究趋向成熟，应用研究初露锋芒。21世纪：将是基因工程应用研究的鼎盛时期，农、林、牧、渔、医的很多产品上都会打上基因工程的标记。DNA重组技术及步骤DNA重组含义DNA重组

DNA重组是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作过程。WatsonandCrick1923年创立DNA双螺旋结构模型DNA重组含义01供体02受体03载体DNA重组技术三大基本元件DNA重组含义DNA重组与DNA杂交的区别

DNA杂交是在两条单链之间进行；DNA重组是在双链DNA片段之间进行的。DNA重组含义自然界的DNA重组

例如：减数分裂；病毒侵染。DNA重组的用途01创造超自然的物种DNA重组含义

基因在不同物质之间的转移，可创造出自然界无法产生的物种。02扩大生产有用物质

如生长素、胰岛素等转移到大肠杆菌中，大量生产，降低成本，满足需要。DNA重组的用途01用于理论研究DNA重组含义

如用于基因功能的分析、研究，基因调控等。02用于疾病防治基因治疗的基本步骤:培养病人的细胞。从正常人的细胞中取出正常基因。将此正常基因转到病人的细胞中，随着病人细胞的分裂，正常基因就有机会整合到病人细胞的基因组中。把整合后的细胞挑选出来，注入病人体内，疾病就会得到治疗或根治。基因的概念及其结构1、基因概念及其发展2、基因的结构3、基因工程的操作步骤基因的概念及其结构1、基因概念及其发展

基因概念经过了一个历史发展过程，并正在继续发展和逐渐完善之中。基因的概念及其结构018年豌豆杂交试验02提出：遗传因子概念03总结：两大遗传定律1、基因的概念及其发展1865年奥地利孟德尔基因的概念及其结构1、基因的概念及其发展1909年丹麦约翰逊基因遗传因子基因的概念及其结构1、基因的概念及其发展1910年美国摩尔根遗传因子

基因是携带生物遗传信息的结构单位，具有控制特定性状、突变和发生交换的功能。

基因位于染色体上并呈线性排列的“念珠模型”，提出连锁互换规律。基因的概念及其结构1、基因的概念及其发展1941年比德尔、泰特姆

通过对红色面包霉营养缺陷型的研究，提出“一个基因一个酶”假设，指出生物体的代谢反应是通过一个基因决定一种特定的酶实现的。

泰特姆，EL比德尔，G.W.基因产物：mRNA、tRNA、rRNA基因的概念及其结构1、基因的概念及其发展

1944年，美国的埃弗雷、麦克利奥特及麦克卡蒂肺炎双球菌转化实验，并把SIII型的DNA，RNA、Pr，夹膜提取物分别加入RII型培养基，发现只有DNA使少量RII型转化为SIII型，并能稳定的遗传下去。说明引起转化的物质是DNA。埃弗雷，O.T基因的概念及其结构1、基因的概念及其发展噬菌体侵染大肠杆菌实验

1952年，Hershey(赫尔希)和Chase（蔡斯）等用放射性同位素标记。32P标记T2噬菌体的DNA（DNA中无S。）35S标记T2噬菌体的Pr（Pr中无P）。

证明：DNA是遗传物质，基因的化学本质是DNA。基因的概念及其结构1、基因的概念及其发展1966年尼龙伯格、霍拉纳

破译遗传密码，即核酸链上3个相连的核苷酸决定一种氨基酸。

至此，人们对基因概念的认识逐渐清晰。尼龙伯格基因的概念及其结构1、基因概念及其发展基因：是控制生物性状的遗传物质的功能和结构单位，是有遗传效应的DNA片段。举例：不同生物的基因数目。

种类基因组大小（bp）基因数目

支原体1.0×106750

噬菌体T41.6×105200

大肠杆菌4.2×1062350

酵母1.3×1076100

果蝇1.4×1088750

人3.3×10965000-80000每个基因有特定的脱氧核苷酸排列顺序，它代表着遗传信息如何理解基因的概念？1、基因是控制生物性状的结构和功能的基本单位。生物的特定的基因决定生物特定的性状。2、基因是有遗传效应的DNA片段，每个DNA分子上有许多个基因。所谓遗传效应是指具备发育、表现出某性状的信息。3、基因位于染色体上呈线形排列，染色体是基因的载体。4、基因的脱氧核苷酸的排列顺序包含着遗传信息，对于某个基因来说其脱氧核苷酸的排列顺序是固定不变的，而不同的基因的脱氧核苷酸的排列顺序又是不同的。5、线粒体和叶绿体中的DNA分子上也有基因。6、一个基因有两条单链，但只有其中一条含有遗传信息。基因的概念及其结构1、基因的概念及其发展基因的概念及其结构2、基因的结构基因的结构（原核细胞）非编码区非编码区编码区编码区下游编码区上游

RNA聚合酶结合位点

调控遗传信息的表达5’末端3’末端RNA聚合酶能够识别调控序列中的启动子（结合位点），并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。基因的概念及其结构2、基因的结构外显子:编码区非编码区非编码区与RNA聚酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游

能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA内含子:基因的结构（真核细胞）基因的概念及其结构2、基因的结构人类珠蛋白基因结构图内含子1（I1）内含子2（I2）外显子3（E3）105146外显子2

（E2）311045

3

转录起始点TATA框RNA聚合酶结合决定转录起始点CAAT框RNA聚合酶结合控制转录频率外显子1（E1）130AATAAA

回文顺序GC框GC框转录终止信号-30～-25-80～-70-100～-80GC框：调节转录的活动。CAAT框增强子尾部区结构基因编码区非编码区调控区外显子：具有编码意义内含子：无编码意义（5'GT、

3'AG；GT-AG法则）前导区启动子终止子TATA框mRNA裂解信号(AATAAA)加尾识别信号回文结构基因的概念及其结构3、基因工程的操作步骤（1）获取目的基因（2）克隆载体的选择与构建（3）目的基因与载体的连接重组（4）重组DNA导入受体细胞（5）克隆子的筛选和重组子的鉴定细菌细胞取出质粒取出DNA用限制酶切断DNA用连接酶连接目的基因限制酶连接酶将重组DNA分子导入受体细胞重组的质粒增殖目的基因产物目的基因产物质粒DNA基因的概念及其结构3、基因工程的操作步骤1.分：分离目的基因2.切：对目的基因和载体适当切割3.接：目的基因与载体连接4.转：重组DNA转入受体菌5.筛：筛选出含有重组体的受菌体基因的概念及其结构3、基因工程的操作步骤①②③④⑤⑥①从细胞中分离出DNA②限制酶截取DNA片段③分离大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因⑦重组体的筛选基因的概念及其结构3、基因工程的操作步骤基因工程流程示意图

供体细胞分离载体分子外源DNA酶切外源基因连接受体细胞DNA重组分子鉴定与表达工程菌或细胞培养转化与扩增重组产物分离纯化蛋白表达产物工程菌或细胞重组转化子目的基因的获取目的基因的获取

在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因，称为目的基因。目的基因一般是结构基因，也就是能够转录和翻译出蛋白质的基因。选用怎样的目的基因是基因工程设计必须优先考虑的问题，如何分离获得目的基因是基因工程操作的重要技术之一。1、目的已基因的来源目的基因的获取

目的基因来源非常广泛，主要来源于各种生物。它们染色体基因组中蕴藏着大量的基因。生物种类基因数目（万个）人3~4

拟南芥2.55

果蝇1.36

水稻5

蠕虫1.78

流感病毒0.178

单个基因在基因组中所占比例极其微小，加上复杂的基因间序列，所以，对单个目的基因分离如同大海捞针。2、分离目的基因的途径目的基因的获取获取目的基因的途径有四种主要方法酶切直接分离法化学合成法基因组文库或cDNA文库法PCR扩增法2、分离目的基因的途径目的基因的获取（1）限制性内切核酸酶的定义、分类①定义：

是一类以环形或线形双链DNA为底物，能识别DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具有3’－OH和5’－P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+2、分离目的基因的途径目的基因的获取提到的限制性内切酶都是指II型酶目前发现的限制性内切核酸酶有3000多种，可分为：I型限制性内切酶：兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体，它可以在识别位点很远的地方任意切割DNA链。II型限制性内切酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链，产生确定的限制片段，是三类限制性内切酶中唯一用于基因工程操作的酶。III型限制性内切酶：在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列，它们很少能产生完全切割的片段。②分类2、分离目的基因的途径目的基因的获取（2）限制性内切核酸酶的作用机制识别序列

左右互补对称，称为回文序列

每种限制性内切核酸酶都有相应的识别序列（4-8bp）

EcoRⅠ的识别序列为：GAATTCHindIII的识别序列为：AAGCTT CTTAAGTTCGAABamHI的识别序列为：GGATCCSau3A的识别序列为：GATCCCTAGGCTAG

MaeIII的识别序列为：GTNACDraⅡ的识别序列为：PuGGNCCPyCANTGPyCCNGGPu

识别序列可以以5’-3’走向的单链DNA表示。如HindIII的识别序列可以写为：AAGCTT2、分离目的基因的途径目的基因的获取（2）限制性内切核酸酶的作用机制识别序列

左右互补对称，称为回文序列

有的限制性内切核酸酶可识别两种以上的核苷酸序列AccⅠ即可识别GTATAC，又可识别GTCGAC；DdecⅠ识别的序列：CTAAG，CTTAG，CTGAG，CTCAG

2、分离目的基因的途径目的基因的获取（2）限制性内切核酸酶的作用机制（b）酶切位点DNA在限制性内切核酸酶的作用下，多聚核甘酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为酶切位点，可用↓表示，有平端切口和粘断切口之分。GTCCAGGCCTAGGATCCG+GACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTG2、分离目的基因的途径目的基因的获取（3）同功异源酶（同裂酶）来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶，也称同裂酶。BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ2、分离目的基因的途径目的基因的获取（4）同尾酶：

有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)BamHⅠBgIⅡ

GGATCCCCTAGG

AGATCTTCTAGAGCCTAG

GATCCG++ATCTAG

GATCTA2、分离目的基因的途径目的基因的获取（4）同尾酶：

有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)BamHⅠBgIⅡ

GGATCCCCTAGG

AGATCTTCTAGAGCCTAG

GATCCG++ATCTAG

GATCTA目的基因的获取2、分离目的基因的途径反应底物：环状或线状的双链DNA分子或片段内切酶：根据分离目的基因序列选择合适内切酶反应缓冲液：通常含MgCl2、NaCl、Tris.Cl、巯基乙醇，由厂家提供最适反应温度：大多为37℃。反应时间：因酶切目的而定。（5）限制性内切核酸酶的反应体系：

目的基因的获取2、分离目的基因的途径用MspI限制性内切酶进行单酶切，10μL酶切反应体系如下：PCR产物4μL10×Buffer1μL0.1％BSA1μLMspI0.5μL(5.0U)ddH2O3.5μL

Totalvolume10μL将样品混匀后离心，在56℃恒温箱温育酶切4~6h，2.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，在凝胶成像系统上拍照，以便分析统计基因型和片段大小。AGAAAGAAAAGGAAAAGGMaker

251bp154bp97bp250bp100bp①单酶切：是用一种限制性内切核酸酶酶切DNA样品②双酶切：用两种不同的限制性内切核酸酶酶切同一种DNA分子。③部分酶切指选用的限制性内切核酸酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的酶切。目的基因的获取2、分离目的基因的途径（6）限制性内切核酸酶酶切DNA的方法

导致部分酶切的原因有：底物DNA纯度低，识别序列甲基化，酶用量不足，反应时间不够以及反应缓冲液和温度不适宜等。

根据需要创造部分酶切条件，以获得需要的DNA片段。目的基因的获取2、分离目的基因的途径目的基因的获取2、利用PCR直接扩增目的基因（1）PCR法定向扩增目的基因的基本原理由穆里斯等人于1988年发明，并于1993年获得若贝尔化学奖。目的基因的获取2、利用PCR直接扩增目的基因①以DNA片段作模板，在90℃高温下，分开成为单链DNA。

②以DNA

小段寡聚核苷酸做引物，在50℃的温度下，找到可以配对的正链和负链，形成互补结合③在70℃高温下，合成一条与模板

DNA单链（正链或负链）互补结合的DNA新链。

④以上三个步骤周而复始，即反应体系的温度从90oC-50oC-75oC，目的基因的量不断增加反应体系中经历：变性——复性——延伸——循环。结果：目的基因的量成指数形式扩增（2n)高温的作用是？引物是怎样获得的？四种脱氧核苷三磷酸（4XdNTP)酶

高温DNA聚合酶（Taq酶、原料（2）PCR的过程目的基因的获取2、利用PCR直接扩增目的基因目的基因的获取2、利用PCR直接扩增目的基因（3）耐高温的DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶(TaqDNApolyase)

是一种耐高热聚合酶，可耐95℃高温，作用温度72℃。从极度嗜热栖热水生菌（Thermusaquaticus）中提取。主要用于PCR扩增。此外，还有Pwo、TthDNA聚合酶利用PCR直接扩增目的基因(4)PCR引物目的基因的获取

引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导与模板DNA互补DNA链的合成的一种脱氧核苷酸寡聚体。其3’末端具有游离的—OH。(5)PCR扩增反应体系（见下表）目的基因的获取2、利用PCR直接扩增目的基因PCR反应混合液成分加入体积（μl）最终浓度双蒸馏水53.510×反应缓冲液10.0[1×]Mg2+1.5mmol/LK+50mmol/L4×dNTPs(各1.25mmol/L)16.0各200μmol/Lλ-DNA模板（全长48.5kD）10.01ng/次引物1,2（各25bp,20μmol/L）5.01.0μmol/L（100pmol）Taq聚合酶储存液0.52U/100μl总体积（pH8.3）100.0

石蜡油50～100.0

扩增条件：94℃60s，37～60℃60s，72℃120s，共25～30个循环。引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)目的基因的获取PCR扩增反应体系总体积为15μL，各成分需要量见表3-3。表3-3PCR反应体系优化结果Table3-3TheReactionMixofPCRReaction

ComponentsVolume(μL)DNA50ng/μL1theupstreamprimer（10µM）0.3thedownstreamprimer（10µM）0.3GoldenDNAPolymerase（2.5U/μL）0.152×ReactionMix7.35ddH2O5.9Total153.PCR反应条件95℃预变性5min94℃变性30sX℃退火30s×30-35C72℃延伸30s~50s72℃延伸10min4℃保存注：X℃-退火温度因引物不同而不同，延伸时间按扩增片断的大小和酶的活性而定，一般以1000Kb/min为标准。4.扩增结果检测取2μLPCR产物加0.5μL6´溴酚蓝上样缓冲液，上样于1.5%琼脂糖凝胶（含0.05%EB），5V/cm电压电泳1h，在凝胶成像仪上观察扩增结果，并拍照。2、利用PCR直接扩增目的基因目的基因的获取2、利用PCR直接扩增目的基因（5）PCR扩增结果检测PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小为438bp，与预期大小一致。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测针对PRKAA1基因exon7序列设计A12引物，用该引物进行DNA扩增，凝胶电泳检测，产物片段大小为342bp，长度符合预期大小，条带质量完好

PRKAA1基因exon7PCR扩增检测结果

牛PRKAA2exon9PCR扩增产物检测结果目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因（1）基因文库某一生物部分基因的集合叫该生物的亚基因组文库。某一生物全部基因的集合叫该生物的基因文库。目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因基因文库（genelibrary)：某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。外源DNA片断、载体、宿主目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因基因组DNA文库的类型：质粒文库，（﹤10kb）噬菌体文库，（0-23kb）粘粒文库，（~45kb）人工染色体文库，（又称大片段基因组DNA文库，100kb—1Mb）目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因（2）cDNA文库的构建

某种生物的基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在受体菌克隆子群体中，这样的群体称为cDNA文库。如果此群体中只贮存该基因组部分cDNA，则称为部分cDNA文库。①由于较高等生物在特定发育阶段或特定器官得以表达的基因有所不同，所以用特定发育阶段或特定器官的材料构建的cDNA文库通常是部分cDNA文库。②cDNA文库的一个克隆子包含一个基因的全部编码序列，不含内含子、转录启动子、终止子等元件。③cDNA文库中贮存某种基因概率的大小，同总mRNA中这种基因的mRNA的拷贝数（丰度）相关。高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总mRNA的22%中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总mRNA的49%低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总mRNA的29%目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因cDNA文库的构建：第一，细胞总RNA的提取和mRNA分离；

第二，第一链cDNA合成；

第三，第二链cDNA合成；

第四，双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因插目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因（3）从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因序列已知，制备核酸探针，分子杂交，找到目的基因。a.根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选。目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因（3）从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因b.根据目的基因特异性表达进行分离目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因基因组DNA文库与cDNA文库的比较：目的基因的获取3、通过建基因组文库或cDNA文库分离目的基因1）cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。2）cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。3）在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。目的基因的获取4、化学合成法目的基因的获取4、化学合成法目的基因的获取4、化学合成法目的基因的获取上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%。4、化学合成法基因工程载体基因工程载体构建基因工程载体构建

2.3基因克隆载体（二）基因克隆载体（二）基因工程载体构建（二）病毒（噬菌体）克隆载体病毒：主要由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的合成系统进行DNA（或RNA）复制和壳蛋白的合成，实现病毒颗粒的增殖。

根据这些性质构建了一系列分别适用于不同生物的病毒克隆载体，把感染细菌的病毒专门称为噬菌体，由此构建的载体则称为噬菌体载体。基因工程载体构建基因工程载体构建（1）λ噬菌体克隆载体基因工程载体构建

①λDNA构建克隆载体的依据：A、λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感染能力。B、λDNA在噬菌体中以线状双链DNA分子存在，全长48502bp。其左右两端各有12个核苷酸组成的5’凸出粘性末端，而且两者的核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，粘性末端连接成为环状DNA分子，此末端称为cos位点。基因工程载体构建基因工程载体构建基因工程载体构建

C、λ噬菌体能包装原λDNA长度的75%－105%，约36.4－51.5kb。并且λDNA上约有20kb的区域对λ噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或者被外源DNA片段取代。基因工程载体构建

②构建λ噬菌体克隆载体的策略是：A、用合适的限制性内切核酸酶切去λDNA上的部分或全部非必需区，相应保留这种酶的1个或2个识别位点作为克隆位点，并用点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的这种酶的识别序列失效，避免外源DNA片段插人必需区B、在非必需区组入选择标记基因C、构建的λDNA载体不应小于36.4kb基因工程载体构建

③用λDNA作载体比用质粒作载体的优点：A、可容纳较大的外源DNA片段（15－23kb，质粒一般<10kb）B、λDNA进入细菌细胞容易，不象质粒载体那样需要采用化学介导法才能进入细菌细胞C、由于λ噬菌体能裂解宿主细胞，因而不管是提取λ载体DNA或重组λDNA，或是提取重组λDNA中外源基因产物都比较容易D、用λ载体组建的DNA或cDNA文库易于长期保存基因工程载体构建

（2）柯斯质粒cosmid（粘性质粒）λ噬菌体载体的局限：A、本身必须大于36.4kb，限制了允许克隆的外源DNA片段B、构建的λ噬菌体载体，只要保留λDNA两端不少于280bp，并含有cos位点以及与包装相关的核苷酸序列，当插入外源DNA片段后总长大于36.4kb，小于51kb，这样的重组λDNA分子就能进行有效包装和转导受体细胞。基因工程载体构建

能否将λ噬菌体载体的上述部分同质粒载体的复制起始位点、克隆位点和选择标记基因等一起构建形成载体？Cosmid载体

由带cos位点的λDNA片段与质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等构建而成载体。Cosmid质粒载体可插入45kb长的外源DNA，主要用于DNA文库的构建基因工程载体构建

Cosmid载体示意图已用于构建植物载体的病毒有：双链DNA病毒：花椰菜花叶病毒(CaMV)，单链DNA病毒蕃茄金黄花叶病毒（TGMV）、非洲木薯花叶病毒（ACMV）、玉米线条病毒（MSV）、小麦矮缩病毒（WDV）RNA病毒：雀麦草花叶病毒（BMV）、大麦条纹花叶病毒（BSMV）、蕃茄丛矮病毒（TBSV）、马铃薯X病毒（PVX）、烟草花叶病毒（TMV）、烟草蚀刻病毒（TEV）、李痘病毒（PPV）等基因工程载体构建2、植物病毒克隆载体基因工程载体构建2、植物病毒克隆载体构建植物病毒克隆载体的基本策略是：对病毒DNA（包括RNA反转录的DNA）进行加工，消除其对植物的致病性，保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，使携带的目的基因导入植物细胞。目前应用最多的植物病毒克隆载体是：利用CaMV（花椰菜花叶病毒）构建的含35S启动子的一系列高效表达载体，这些载体能启动目的基因在植物细胞（或蓝藻细胞）中进行高效表达。基因工程载体构建2、植物病毒克隆载体

构建植物病毒克隆载体的基本策略是：对病毒DNA（包括RNA反转录的DNA）进行加工，消除其对植物的致病性，保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，使携带的目的基因导入植物细胞。

目前应用最多的植物病毒克隆载体是：利用CaMV（花椰菜花叶病毒）构建的含35S启动子的一系列高效表达载体，这些载体能启动目的基因在植物细胞（或蓝藻细胞）中进行高效表达。基因工程载体构建基因工程载体构建3、动物病毒克隆载体

目前用于构建克隆载体的动物病毒主要有：痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒、猿猴空泡病毒和反转录病毒等由痘苗病毒构建的克隆载体：痘苗病毒基因组：线形双链DNA分子，长度因毒株不同而异，在180－200kb之间,两端为10kb左右的倒置重复序列，与病毒毒力和宿主范围有关，其中70bp是痘苗病毒复制所必需的，尤其是20bp（ATTTAGTGTCTAGAAAAAAT）特别重要。痘苗病毒能感染人、猪、牛、鼠、兔、猴、羊等脊椎动物基因工程载体构建3、动物病毒克隆载体

在外源目的基因和报告基因两端组装痘苗病毒的TK或HA基因，作为同源重组的DNA片段。特点：表达产物的天然性较好的免疫原性插入量大宿主细胞广泛可进行翻译后修饰利用痘苗病毒载体系统表达的外源基因在动物中可提供保护性免疫反应基因工程载体构建（四）人工染色体克隆载体背景：其他载体承载片段小，限制了对具有庞大和复杂的人和高等动植物基因组研究，适应结构基因组学、功能基因组学、基因组计划研究需要。概念：人工染色体指能在宿主细胞中稳定复制，并准确传递给子细胞的人工构建的染色体，能承载100kb以上的DNA大片段，因此又称为大DNA片段克隆载体。类型：线性和环形人工染色体载体特点：能容纳长达1000kb，甚至3000kb的外源DNA片段，主要用于构建基因组文库，也可用于基因治疗和基因功能鉴定。人工染色体载体的用途：构建高等生物基因组文库的有效载体系统；克隆和转移包括多种元件在内的完整基因或基因簇；作为研究基因表达调控和染色体功能的重要工具；是建立HAC动物模型的重要手段；人类基因治疗方面发挥重要作用。

基因工程载体构建载体名称受体细胞结构插入片断TAC（TrasformatincompetentArtificialChromosome）E.coli环状100-2000kbBIBAC（binbaryBacterialArtificialChromosome）E.coli环状100-2000kbBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbYAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kbHAC(HumanArtificialChromosome)动物细胞线性染色体〉1000kb目前常用的人工染色体载体包括：1、酵母人工染色体（YAC）2、细菌人工染色体（BAC）基因工程载体构建1、酵母人工染色体（YAC）

将含有酵母染色体的DNA端粒（TEL）、DNA复制起点（ARS）和着丝粒（CEN）以及必要的选择标记(HisA4和Trp1）基因和多克隆位点（MCS）的DNA片段克隆到pBR322中，构建成YAC载体YAC载体的装载量为200-500kb基因工程载体构建YAC载体的缺陷

（1）在YAC载体的插入片段会出现缺失和基因重排的现象（2）容易形成嵌合体（3）YAC染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆基因工程载体构建2、细菌人工染色体（BAC）

是基于大肠杆菌的F质粒构建的、高通量低拷贝的质粒载体。每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子的严谨型控制的复制子oriS，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB,和parC）各种类型的BAC在大肠杆菌受体菌中只能维持单一拷贝

基因工程载体构建BAC载体主要适用于克隆大型基因簇结构构建动植物基因文库基因工程载体构建（6）表达型质粒载体

主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。表达载体的结构01普通载体元件基因工程载体构建

复制起始点ORI、选择标记、多克隆位点MCS02大肠杆菌操纵子元件

阻遏基因I操纵基因O启动基因P核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。基因工程载体构建基因工程载体构建②表达载体的类型

启动子类型：诱导启动子、组织特异性启动子诱导型表达载体：在特殊的诱导条件下才有转录活性或较高转录活性。二价金属离子诱导启动子、红光、热、旱组织特异性表达载体：只有在一定的组织中才能调控下游基因有效表达。乳腺、肿瘤、神经、花药、种子基因工程载体构建基因工程载体构建基因工程载体构建基因受体细胞进不去在基因工程操作过程中，为什么需要载体?基因受体细胞即使进入不能稳定维持载体一、载体的定义：

通过不同途径能将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞，并在其中得以稳定维持的DNA分子称为载体（vectors）。

基因工程载体构建二、载体的功能：

1、运送外源基因高效转入受体细胞2、为外源基因提供复制能力和整合能力3、为外源基因的扩增和表达提供必要条件三、作为基因克隆载体必须具备的条件：基因工程载体构建（1）必须有供外源DNA片段插入的克隆位点（2）能携带外源DNA片段（基因）进入受体细胞，进行自我复制（3）具有用于选择克隆子的标记基因（4）必须是安全的（5）载体DNA分子应尽可能小（6）载体中应该含有能促进外源DNA表达的调控区抗药性基因（apr、cmr、smr、kanr、tcr）β-半乳糖苷酶基因（lacZ’）报告基因（gus）绿色荧光蛋白（gfp）四、载体的发展阶段基因工程载体构建

构建载体的主要材料：最早质粒DNA、病毒或噬菌体DNA，现在染色体DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA数量：上千种（1973年科恩构建的第一个质粒载体pSC101）第一阶段：以质粒、λ噬菌体、柯斯质粒（黏粒）载体为主，特点在宿主细胞内稳定遗传，易分离，转化效率高，但克隆容量有限，＜45kb第二阶段：载体容量扩大，100kb～几个Mb，YAC、BAC、PAC、HAC/MAC第三阶段：BIBAC、TAC（可转化人工染色体），较大的克隆容量，具有转化植物的功能载体的种类和特征基因工程载体构建载体名称受体细胞结构插入片断举例质粒*E.coli环状〈8kbpUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，Λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒5.载体的分类依据载体的生物来源分为：DNA重组含义

病毒载体非病毒载体按照导入的受体生物分为：

大肠杆菌载体、酵母载体、植物载体‘动物载体根据载体的用途分为：克隆载体克隆载体表达载体基因工程载体构建（一）质粒载体是一种存在于宿主细胞染色体之外的裸露DNA分子。多存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。1、质粒（plasmid）基因工程载体构建（1）质粒的基本特性1)自主复制性2)保持相对独立的拷贝数3)分子小4)可转移性5)携带遗传标记

野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：抗生素、抗抗生素、抗重金属、产生细菌毒素等。对DNA重组分子的筛选具有重要意义。

resistancetransferfactor

（RTF耐药性传递因子)—编码性菌毛。质粒DNA的转移和复制基因工程载体构建（2）质粒载体的构建①天然质粒的局限性分子量大，拷贝数低第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子大小9.1kb。有多个限制性酶切位点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。基因工程载体构建（2）质粒载体的构建筛选标志不理想ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。

可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞。colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。

唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。具有复制起点（ORI）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA片断，且插入后不影响复制功能。具有较小的分子量和较高的拷贝数。基因工程载体构建（2）质粒载体的构建基因工程载体构建（3）构建质粒载体的指导思想删除不必要的DNA区域。减少限制性内切酶酶切位点。加入易于检出的选择性标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。关于质粒安全性能的改造。改造或增加基因表达的调控序列。基因工程载体构建2、经典的大肠杆菌质粒载体（1）pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。类型天然质粒，属低拷贝型。长度9.09kb。选择标记四环素抗性Tetr基因工程载体构建克隆位点6个克隆位点：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3个位于选择标记Tetr的内部）（2）pBR322：

F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。基因工程载体构建①元件来源pSP2124质粒的Ampr基因复制起点oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点Ampr基因Tetr基因pSC101的Tetr基因基因工程载体构建②长度③选择标记基因④克隆位点4363bp氨苄青霉素和四环素抗性。其中9个会导致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3个会导致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24个克隆位点。基因工程载体构建克隆位点基因工程载体构建pBR322的优点双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞

在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。基因工程载体构建pBR322的优点外源基因

BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因

PstITet中存活但在Amp中死亡分子小，克隆能力大

载体越小越好。>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。基因工程载体构建自然界的DNA重组

高拷贝数安全

失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。基因工程载体构建（3）pUC系列

UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19基因工程载体构建元件来源复制起点pBR322的ori但其上失去了克隆位点。Ampr基因lacZ的启动子大肠杆菌lacZ’基因大肠杆菌lacZ的

-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。pBR322的Ampr基因基因工程载体构建②长度约2.7kb③克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。基因工程载体构建克隆位点基因工程载体构建克隆位点pUC18/19多克隆位点方向相反，便于一个DNA片段以正反两个方向组入载体，保证DNA片段中基因的信息与质粒载体信息链连接，进行有效表达。基因工程载体构建克隆位点基因工程载体构建选择标记Ampicillin抗性和lacZ的

肽互补（蓝白斑）相结合。蓝白斑选择原理：X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）基因工程载体构建半乳糖苷酶X-gal显色反应

-半乳糖苷酶能把无色的化合物X-gal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝

-半乳糖苷酶基因工程载体构建lacZ的α肽互补

-半乳糖苷酶能把无色的化合物X-gal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。C端大部分C端大部分C端大部分C端大部分

-肽（lacZ’

）：

-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.N端的11-41aaN端的11-41aaN端的11-41aaN端的11-41aa4聚体基因工程载体构建受体菌lacZ突变（lacZ∆M15）

受体菌基因组的

-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失

肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解X-gal

受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a基因工程载体构建载体lacZ’与α互补pUC质粒载体上的lacZ’

编码

肽与这个缺失突变的

-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解X-gal。产生蓝色物质。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’受体菌lacZ∆基因工程载体构建α互补的插入失活

pUC载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。

lacZ’5’3’

肽移码突变lacZ’5’3’

肽不互补互补MCS外源DNA基因工程载体构建IPTG的诱导作用IPTG（异丙基--D-硫代半乳糖苷）是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’

肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，不能产生

肽！基因工程载体构建IPTG诱导的结果MCS无插入时，MCS有插入时，?通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。基因工程载体构建IPTG诱导的结果无质粒的受体菌

-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；无抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养无菌斑生长质粒转化的受体菌

-半乳糖苷酶的缺失被载体产物

互补，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有蓝色菌斑生长带外源DNA插入的质粒转化的受体菌载体产物失活，不能互补

-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有白色菌斑生长基因工程载体构建IPTG诱导的结果基因工程载体构建pUC系列载体的优点更小的分子量：如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。选择方便X-gal显色、抗菌素双重直接选择。克隆便利具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。测序方便基因工程载体构建3.穿梭质粒载体（1）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。（shuttleplasmidvectors）基因工程载体构建（2）常用的穿梭质粒载体大肠杆菌

枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌

酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌

动物细胞穿梭载体E.coli选择标记Yeast复制起点E.coli复制起点Yeast选择标记MCS基因工程载体构建（3）穿梭载体的优点②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。③可以自如地在两种不同宿主细胞之间来回转移基因。克隆、构建表达E.coliAnimalcell①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达基因工程载体构建4、农杆菌Ti质粒载体——植物的克隆载体致癌农杆菌含有的一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，该质粒会引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤），故称此质粒为Ti质粒（tumorinducingplasmid）

Ti质粒是一种双链环状DNA分子，大小约200kb，但是能进入植物细胞的只有约25kb，称为T-DNA（transferDNA）。

T-DNA左右两边界（LB,RB）各有一个25bp长的正向重复序列（LTS和RTS），是转移和整合不可缺少的序列，并且已证实T-DNA只要保留两端边界序列，中间的序列不同程度被任何一个外源DNA片段所替换，仍可转移整合到植物基因组中。基因工程载体构建4、农杆菌Ti质粒载体——植物的克隆载体完整的Ti质粒必须具有五个主要功能区域：（1）T-DNA：LB与RB间序列，整合到植物基因组（2）质粒转移区(PT)：调控Ti质粒在农杆菌间转移（3）冠瘿碱代谢区(opine)（4）复制原点（ori）（5）毒性区（Vir）：激活T-DNA转移基因工程载体构建5、酵母2μm质粒载体酵母的特点：（1）最简单的单细胞异养真核生物，可像细菌一样进行基因操作（2）能够在廉价的培养基上生长（3）可进行高密度发酵（4）具有对外源基因翻译后进行蛋白质加工和修饰的功能（5）都存在一种质粒，即2μm质粒

一般也构建成穿梭质粒载体，即含有2μm质粒的复制起始位点和大肠杆菌源质粒的复制起始位点。目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞

在目的基因与载体连接成重组DNA分子后，下面重要的工作是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆（cloning）。由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同，宿主细胞不同、将重组DNA分子导入宿主细胞的具体方法也不相同。一、受体细胞（receptorcell）目的基因导入受体细胞

又称为宿主细胞或寄主细胞（hostcell）等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。分为原核受体细胞（主要是大肠杆菌）、真核受体细胞（最主要是酵母菌）、动物细胞和昆虫细胞。一、受体细胞（receptorcell）目的基因导入受体细胞

作为基因工程的宿主细胞必须具备的条件：

便于重组DNA分子导入；能使重组DNA分子稳定存在；便于便于重组体的筛选；遗传稳定性高，易于扩大培养；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；利于外源基因蛋白产物高效表达。一、受体细胞（receptorcell）目的基因导入受体细胞原核生物受体细胞优点大多数原核细胞无坚硬细胞壁便于外源DNA的进入。没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。一、受体细胞（receptorcell）目的基因导入受体细胞原核生物受体细胞缺点原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物不稳定。一、受体细胞（receptorcell）目的基因导入受体细胞至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。大肠杆菌受体细胞优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。一、受体细胞（receptorcell）目的基因导入受体细胞枯草杆菌受体细胞优点枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。一、受体细胞（receptorcell）目的基因导入受体细胞蓝细菌（蓝藻）蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，能进行光合作用，又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，典型原核生物。蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：基因组原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测。细胞壁属G－，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好