GBT 34656-2017 海洋沉积物间隙生物调查规范

海洋沉积物间隙生物调查规范2017-10-14发布2017-10-14实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布I 引言 2规范性引用文件 13术语和定义 14一般规定 24.1技术设计 24.2调查的基本要求 24.3采样 34.4样品分析 34.5资料整理的基本要求 44.6调查成果 44.7资料归档 54.8质量计划和质量控制 55沉积物调查 5.1方法概述 55.2技术要求 55.3样品采集和保存 65.4理化因子的测定 65.5沉积物年龄的测定 65.6沉积物重金属、有机污染物和油类的测定 65.7沉积物粒度的测定 65.8沉积物矿物组分的分析 65.9近海沉积物底质类型的划分 65.10深海沉积物类型的划分 75.11沉积物生物组分调查 75.12资料整理 76悬浮体调查 6.1方法概述 76.2技术要求 76.3悬浮体质量浓度测量 86.4悬浮体现场粒度和体积浓度测量 86.5颗粒有机碳和有机氮测定 96.6资料整理 7有孔虫调查 7.1方法概述 Ⅱ7.2技术要求 7.3有孔虫样品的采集和保存 7.4工具和试剂 7.5有孔虫样品的处理和分析 7.6资料整理 8介形虫调查 8.1方法概述 8.2技术要求 8.3介形虫样品的采集和保存 8.4工具和试剂 8.5介形虫样品的处理和分析 8.6资料整理 9放射虫调查 9.1方法概述 9.2技术要求 9.3放射虫样品的采集和保存 9.4工具和试剂 9.5放射虫样品的处理和分析 9.6资料整理 10沉积硅藻调查 10.1方法概述 10.2技术要求 10.3沉积硅藻样品的采集和保存 10.4工具和试剂 10.5沉积硅藻样品的处理和分析 10.6资料整理 11颗石藻调查 11.1方法概述 11.2技术要求 11.3颗石藻样品的采集和保存 11.4工具和试剂 11.5颗石藻样品的处理和分析 11.6资料整理 12沉积孢粉调查 12.1方法概述 12.2技术要求 12.3沉积孢粉样品的采集和保存 12.4工具和试剂 12.5沉积孢粉样品的处理和分析 12.6资料整理 13底栖病毒调查 Ⅲ13.1方法概述 13.2技术要求 13.3底栖病毒样品的采集和保存 13.4工具和试剂 13.5底栖病毒样品的处理和分析 13.6资料整理 14底栖微生物调查 14.1方法概述 14.2技术要求 14.3底栖微生物样品的采集和保存 14.4工具和试剂 14.5底栖微生物样品的处理和分析 14.6资料整理 15底栖微藻调查 15.1方法概述 15.2技术要求 15.3底栖微藻样品的采集和保存 15.4工具和试剂 15.5底栖微藻样品的处理和分析 15.6资料整理 16底栖原生动物调查 16.1方法概述 16.2技术要求 16.3底栖原生动物样品的采集和保存 16.4工具和试剂 16.5底栖原生动物样品的处理和分析 16.6资料整理 17小型底栖后生动物调查 17.1方法概述 17.2技术要求 17.3潮间带和浅海取样 17.4深海取样 17.5小型底栖后生动物样品的处理和分析 17.6资料整理 附录A(资料性附录)沉积物生物群落的几个主要类群图 附录B(资料性附录)沉积物间隙生物调查的几种分层取样设备图 附录C(资料性附录)样品标签和几种采样记录表 附录D(资料性附录)几种镜检记录表 附录E(规范性附录)常用群落参数的计算 附录F(规范性附录)沉积物三角图解分类图 附录G(规范性附录)水体测量标准观测层次表 附录H(资料性附录)沉积遗壳处理的冲样记录表 附录I(规范性附录)颗石藻调查的几个特征分级表 附录J(规范性附录)沉积物病毒荧光显微镜计数流程图 附录K(规范性附录)微型底栖生物调查的几种取样设备图 附录L(规范性附录)微型底栖生物调查的过滤装置和滤膜筐图 附录M(规范性附录)微型底栖生物调查的几个技术流程图 附录N(规范性附录)各种溶液的配方和配制 参考文献 图A.1微型底栖生物的几个主要类群图 图A.2小型底栖后生动物的几个主要类群图 图B.1推式定量分层取样器图 图B.2摇杆式定量分层取样器图 图E.1微型底栖生物的生物体积计算公式图 图F.1谢帕德(Shepard)碎屑沉积物三角图解分类图 图F.2福克(Folk)等碎屑沉积物三角图解分类图 图F.3深海沉积物三角图解分类图 图J.1沉积物病毒计数流程图 图K.1VanVeen抓斗式采泥器图 图K.2TFO采泥器图 图K.3沉积物捕获器图 图L.1真空过滤系统图 图L.2滤膜筐图 图M.1底栖微藻和细菌样品的截取和过筛技术流程图 图M.2底栖微藻和细菌荧光染色技术流程图 图M.3Ludox离心分离技术流程图 图M.4定量蛋白银染色(QPS)技术流程图 图M.5变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术流程图 图M.6克隆文库技术流程图 表1有孔虫PCR扩增引物 表2底栖微生物PCR扩增引物 表3底栖微生物高通量测序扩增引物 40表4实时荧光定量PCR扩增引物 表C.2采样记录表 表C.3小型底栖后生动物取样记录表 表D.1底栖病毒、细菌荧光显微镜计数记录表 表D.2底栖病毒、细菌流式细胞仪测定记录表 表D.3微小型底栖动物镜检记录表 V表D.4小型底栖后生动物计数表 表E.1生物量转换系数表 表G.1水体测量标准观测层次表 表H.1冲样记录表 表I.1颗石保存特征分级表 表I.2沉积物中所有颗石藻相对丰度特征分级表 表N.1f/2培养液的配制表 表N.2SWIⅡ培养基的配制表 表N.3底栖原生动物调查DGGE中的不同浓度的变性溶液配制表 表N.4裂解缓冲液的配制表 VⅡ本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家海洋局提出。本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本标准起草单位：中国科学院海洋研究所、同济大学、中国地质调查局青岛海洋地质研究所、国家海洋局第一海洋研究所、国家海洋局第二海洋研究所、国家海洋局第三海洋研究所、中国科学院南海海洋研究所、中国地质大学(北京)、中国科学院南京地质古生物研究所、中国海洋大学。海洋沉积物间隙生物在三域生物分类系统中涵盖了六个“界”的生命形式：古菌界、细菌界、原生动深海底栖生态系统中数量最多、功能最复杂的生命类群，是维持底栖生命体系运行的物质基础和能流关键。海洋沉积物间隙生物通过常规的海洋调查手段不易获得，本标准的制定是为了填补国家标准GB/T12763《海洋调查规范》中缺乏有关沉积生命体系调查的规定。为适应现代海洋科技的发展，完善我国海洋调查内容，国家海洋局组织开展了国家标准《海洋沉积物间隙生物调查规范》的制定，为海洋生物多样性，海洋战略性生物资源的发掘利用，深海资源环境综合探测，生态环境监测与评估、保护和管理提供理论根据和技术支撑。1海洋沉积物间隙生物调查规范本标准确定了海洋沉积物间隙生物调查的基本要求，确立了对沉积物、悬浮体、有孔虫、介形虫、放物、小型底栖后生动物等调查的一般规定和方法。本标准适用于海岸带、浅海和深海等近海和远海不同底栖生境的海洋调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T12763.1海洋调查规范第1部分：总则GB/T12763.4海洋调查规范第4部分：海水化学要素调查GB/T12763.6海洋调查规范第6部分：海洋生物调查GB/T12763.8海洋调查规范第8部分：海洋地质地球物理调查GB17378.4海洋监测规范第4部分：海水分析3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。海洋沉积物marinesediment在地壳表层地质作用下由母岩(岩浆岩、变质岩、先成的沉积岩)的风化产物、生物来源物质、火山物质、宇宙物质等原始物质经过搬运、沉降或沉淀等作用，在海岸带或海底基底上呈松散状未固结的堆积物。沉积岩sedimentaryrock是组成岩石圈的三大类岩石(另外两种是岩浆岩、变质岩)之一，它是在地表表层的条件下，由母岩(或任何先成岩石)的风化产物、生物来源物质、火山物质、宇宙物质等原始物质经过搬运作用、沉积作用和沉积后成岩作用而形成的岩石。栖息或沉积于沉积物颗粒之间空隙中的所有的底栖生命形式。注：包括海洋微体生物(marinemicroorganism)、底栖病毒(benthicvirus)、微型底栖生物(microbenthos)、微型和小型底栖后生动物(micro-andmeiobenthicmetazoa)等。从个体大小上，海洋沉积物间隙生物涵盖粒径小于0.2μm的毫微微型(femto-级),0.2μm～2μm的超微型(pico-级)、2μm～20μm的微型(nano-级)和大于20μm的微小型(micro-级)的单细胞底栖生物和小型(meio-级)底栖后生动物。2微型底栖生物microbenthos生活于沉积物表面和底内的，被0.2μm滤膜截留的所有的单细胞原核、真核微型生物。注：主要包括底栖细菌(benthicbacteria)、底栖微藻(benthicmicroalgae)及底栖原生动物(benthicprotozoa)等，几个主要类群参见图A.1。从个体大小上，微型底栖生物涵盖粒径小于2μm的超微型(pico-级)、2μm～20μm的微型(nano-级)和大于20μm的微小型(micro-级)的底栖生物。底栖原生动物benthicprotozoa生活史的全部或大部分时间与沉积物或水体的基质相关联的动物性单细胞真核生物。注：包括异养鞭毛虫(heterotrophicflagellate)、纤毛虫(ciliate)和肉足虫(sarcodina)等。海洋微体生物marinemicroorganism沉积物调查和海洋地质调查所涉及的微体古生物，也包括各类群的现生种类。底栖微生物benthicmirobes栖息于水域基底表面或底内的一群个体微小、结构简单、生理类型多样的单细胞或多细胞的低等生物，包括属于原核生物类的细菌、古菌和属于真核生物类的真菌等。小型底栖后生动物metazoanmeiobenthos;metazoanmeiofauna生活于沉积物表面和底内的、分选时能通过500μm孔径网筛而被42μm或31μm孔径网筛所阻留收集的小型后生动物以及大型后生动物的幼体等。几个主要类群(参见图A.2)。4一般规定4.1技术设计根据调查任务进行技术设计，内容包括调查断面、站位、项目、内容、方法、时间、次数、专业配置、人员素质、船只、器材设备、预期成果和调查计划编制等。调查计划编制的要求见GB/T12763.1中的相关章条。4.2调查的基本要求4.2.1调查项目底栖微藻、底栖原生动物、小型底栖后生动物，可根据任务书酌情增减或根据合同书、调查计划自拟。4.2.2辅助参数海洋调查时，应视需要确定与其有关的辅助观测项目，可根据任务书或合同书、调查计划自拟。4.2.3采样方法与适用范围适用于沉积物、有孔虫、介形虫、放射虫、沉积硅藻、颗石藻、沉积孢粉、底栖病毒、底栖微生物、底栖3微藻、底栖原生动物、小型底栖后生动物调查项目的采样。适用于有孔虫、介形虫、放射虫、原生动物等调查项目的样品的辅助采集。适用于悬浮体调查等项目的水样采集。使用调查项目规定的采样器采样，严守操作程序，注意采样器的工作状态。表层样、柱状样和岩心样的采集按任务要求取样和处理，并根据调查任务的实验要求设计分层采样(几种分层设备参见图B.1~图B.2)。发现异常应重新采样。使用专业规定的网具采样，严格起、落网速度，准确判断网具到达预定水层。拖网时注意工作状态是否正常，遇异常情况应立即采取有效措施。起网后认真冲洗网具，收集样品，特别是粘附在网衣和网底管套筛绢上的生物样品，严禁标本挟带。使用调查项目规定的采水器采水，入水前应检查采水器的球盖是否打开，出水嘴是否关闭，准确放至预定水层，严守停滞时间。按要求取样、处理。应满足GB/T12763.1和本标准有关规定的具体要求处理。各调查项目应按GB/T12763.1和本标准的有关规定记录。样品采集和测定记录表的格式参见附遇异常现象或新发现，除记录外还应现场拍照或录像。4.4样品分析各调查项目采得的样品应按GB/T12763.1和本标准有关规定的具体要求处理。需要测定的样品，应按本标准相应调查项目的要求进行。4.4.3样品的处理和保存需要现场分层、固定或染色的样品，应按本标准相应调查项目的要求进行。分析、测量、鉴定后的样品，可依资料分析、应用程序和学术价值高低，确定全部或部分保留。保留样品应按各专业的要求保管。44.4.4样品的鉴定和计数主要生物种类，一般应鉴定到种，并按本标准相应专业的要求计数。通过显微镜检测等设备对样品进行观察和分析，镜检时结果记录于表格(参见表D.1～表D.4)。4.4.5样品的数据分析数据分析的主要内容包括测定沉积物间隙生物主要类群的构成、丰度和优势类群的种类组成等。丰度以个体丰度(abundance)或相对丰度(relativeabundance)表示。借助统计学软件进行数据分析，常用群落参数的计算见附录E,微型底栖生物的生物体积计算公式见图E.1,生物量转换系数见表E.1。4.5资料整理的基本要求鉴定、计数及测定结果按本标准各调查要素所规定的公式和格式进行计算、统计。按GB/T12763.1和本标准的有关规定，并参考GB/T12763.7的有关要求，填写各类报表。有关数据资料形成后，根据本标准各调查要素的要求绘制各式图表。每航次海上调查完成后，首席科学家应按GB/T12763.1有关规定组织编写航次报告。按GB/T12763.1和本标准的有关规定进行资料归档、验收和成果鉴定。包括沉积物样品、岩样、生物样、水样、现场描述记录、导航定位记录及各种记录表等。这些调查的第一手资料，是调查的初级成果。对调查获得的数据经室内处理、分析与计算，按成图比例尺要求，编制基础图件。调查报告的内容包括：a)前言，介绍调查任务的来源、目的和任务，调查海区的范围和地理位置、调查项目内容和工作b)海上调查及资料整理，陈述海上调查的工作方法、调查站位层次设计、原始资料质量、资料整理5方法、成果资料准确度等；c)调查结果，包括沉积物类型、悬浮体浓度、生物主要类群的构成、丰度和分布特点等；d)调查资料的分析，包括资料分析方法及其依据、各要素的分布特征、规律和综合分析等；e)结论和工作建议。4.7资料归档调查资料归档的内容包括：a)调查任务书或合同书、委托书等；b)课题论证报告、技术设计、方案报告及其审批意见；c)课题调查实施计划、站位表等；e)计算、分析整理的成果数据报表及说明；f)各种图表、图件(包括底图)、照片及文字说明；g)航次报告、专题总结报告；h)调查报告及成果验收书；i)课题成员及经费结算表。资料归档、档案质量与成果验收的相关要求见GB/T12763.1的相关规定。4.8质量计划和质量控制执行单位应撰写质量计划书，内容包括引用标准和文件、调查任务概况、质量目标、执行单位组织机构及岗位职责、质量计划保证措施。质量控制措施主要包括以下几个方面：a)建立质量控制体系：任务执行单位除接受主管部门和技术监督机构的监督外，还应自行核对和质量检查；制定质量控制制度，明确质量控制职责和质量监督、检查程序，严格执行质量控制规定；b)实施全过程质量控制：下达调查任务应有明确的质量要求；对已有的文献、资料应进行具体质现场记录；海上调查结束后，应对原始资料、样品进行核对；对样品的分析、鉴定和资料的整理、c)实行全员质量控制：调查人员应具备相关职业技能，在调查人员的职责中都应有质量要求。5沉积物调查5.1方法概述主要包括对沉积物特征、底质类型的划分、沉积物理化因子的测定、沉积物粒度分析等，以获取沉积物间隙生物调查的底质环境的基本信息。测定按GB/T12763.8沉积物粒度分析的规定执行。5.2技术要求技术要求主要包括以下方面：a)根据工作任务确定定性和定量分析；b)样品不应混样和污染；c)调查要素包括沉积物粒度、沉积物类型、沉积物生物组分等。65.3样品采集和保存应按GB/T12763.1、GB/T12763.6和GB/T12763.8的具体要求，采集海底表层沉积物、柱状样或未扰动的钻孔岩心样，开展样品的现场描述和有关理化因子的现场测定。依据工作任务对样品进行现场密封、冷藏或冷冻保存。用于沉积物理化因子和粒度测定的样品，应对表层沉积物样品进行采集或者按照实验室要求对柱状样或钻孔岩心进行深度分层采集。采集的样品用聚乙烯密封袋分装密封，并在相应的样品袋上标记样品站位、取样时间以及站位坐标等相关信息。pH值、Eh值、温度以及Fe³+/Fe²+比值等相关参数应在现场进行测定，用于实验室测定其他理化因子的样品应放于一20℃冰箱内保存，回到实验室，实验测试条件准备完毕后应立即测定。5.4理化因子的测定根据调查要求，环境因子的测定应包括含水量(%),总有机碳(%),叶绿素a(Chla)和脱镁叶绿素a(Pha),pH值、Eh值、温度以及Fe³+/Fe²+比值等。所测定的要素可根据调查任务要求酌情增减。5.5沉积物年龄的测定根据调查任务的要求，可酌情开展柱状样或钻孔岩心的沉积年龄测定。柱状样或钻孔岩心顶部的沉积物，按GB/T12763.8的具体要求，根据任务需要选择开展210Pb、137Cs测年，钻孔岩心可开展C测年、光释光测年和古地磁年代测定。5.6沉积物重金属、有机污染物和油类的测定调查按GB/T12763.4和GB17378.4的规定执行。测定的要素可根据调查任务和海区的具体情况酌情增减。5.7沉积物粒度的测定有关沉积物粒度的测定按GB/T12763.8沉积物粒度分析的规定执行，并可按该标准计算沉积物粒度参数。5.8沉积物矿物组分的分析根据调查任务的要求，可酌情开展沉积物碎屑矿物和黏土矿物组分的分析，按GB/T12763.8底质矿物鉴定的规定执行。5.9近海沉积物底质类型的划分根据调查任务的需要，沉积物分类和命名采用谢帕德(Shepard)或者福克(Folk)等的沉积物三角图解法划分(见图F.1～图F.2)。a)谢帕德的沉积物三角图解法将沉积物划分为：粘土、砂质粘土、粉砂质粘土、粘土质砂、粘土质粉砂、砂、粉砂质砂、砂质粉砂、粉砂9种类型，划分依据按GB/T12763.8沉积物粒度分析的规定执行；b)福克等碎屑沉积物分类法，包括含砾和无砾两种沉积物分类法，其中含砾沉积物的三角图解法c)无砾沉积物三角图解法可划分为10个类型：砂、粉砂质砂、泥质砂、粘土质砂、砂质粉砂、砂质7d)除了上述划分之外，应按照粒度分析结果，明确所分析的沉积物中所含砾石、砂、粉砂及粘土粒级组分的百分含量。5.10深海沉积物类型的划分深海沉积物的类型和命名采用深海沉积物三角图解分类法划分(见图F.3),划分依据按GB/T12763.8沉积物粒度分析的规定执行。5.11沉积物生物组分调查主要包括对样品中的有孔虫、介形虫、放射虫、孢粉、钙质超微化石(颗石藻等)的鉴定和分析。生物遗壳的测定依据按GB/T12763.8有关沉积物古生物鉴定的规定执行。其他沉积生物碎屑如鱼石、鱼耳石、轮藻、珊瑚、苔藓虫、翼足类等的样品制片和鉴定分析，按GB/T12763.8有关沉积物古生物鉴定的规定执行。技术要求主要包括以下方面：a)根据工作任务确定定性和定量分析；b)样品不应混样和污染；c)个体丰度以个每克干样，或个每50克干样或个每10平方厘米表示；d)调查要素包括测定主要类群的组成、丰度、优势种等。5.11.3样品采集和保存应按GB/T12763.1、GB/T12763.6和GB/T12763.8的具体要求，采集沉积物柱状样和未扰动的芯样。依据工作任务进行现场密封、冷藏或冷冻保存。5.12资料整理沉积物调查的资料整理应满足本标准的有关规定。6悬浮体调查6.1方法概述通过现场仪器观测、水样过滤和实验室分析，调查与海洋沉积过程有关的悬浮颗粒等海洋环境要素，获得海水中悬浮体浓度分布、粒度组成、颗粒有机碳、有机氮等的含量和分布，以了解海域水动力条件、海洋沉积物来源和沉积特征。6.2技术要求技术要求包括以下方面：a)测站布设：调查海区应具有代表性，推荐以大面站断面、连续站的方式进行观测，每断面不少于3个站位，同一断面站位尽可能短时间内完成；b)观测层位：根据水深确定观测层次，在水深小于20m的海域可以酌情减少(见表G.1)。8GB/T34656—20176.3悬浮体质量浓度测量测量准确度误差范围应小于2%。测量仪器包括如下：a)采水器：采用采水体积与过滤量相当的采水器；c)真空过滤装置；d)称量天平：悬浮体浓度大于5mg/L的海域，可采用称量精度为10-'g/g的分析天平；悬浮体浓度不超过5mg/L的海域，建议选用称量精度为10-5g/g的电子分析天平。实验室分析的工作程序如下：a)将滤膜40℃烘干至恒重，然后在分析天平上称空滤膜重量，并将称量过的滤膜放入清洁的、编b)现场将海水样品过滤到滤膜上，记录下通过滤膜的海水体积；待滤膜上海水被抽干后，用去离子水冲洗滤膜2次，洗去盐分；c)将抽干的滤膜放回原滤膜盒内，冷冻保存于—20℃冰柜中以待其他用途分析；d)在实验室内将带有悬浮体样品的滤膜在冷冻干燥机中干燥至恒重，用电子分析天平再次称量出带样品滤膜的总重量；e)将20%的样品加空白校正膜，平行进行滤膜的空白校正；f)按式(1)计算悬浮颗粒物浓度(SPM),按式(2)计算空白校正滤膜校正值(△W);W——水样滤膜的质量，单位为毫克(mg);△W——空白校正滤膜校正值，单位为毫克(mg);V——过滤海水的体积，单位为升(L)。…………W₀——过滤后空白校正滤膜重量，单位为毫克(mW,——过滤前空白校正滤膜重量，单位为毫克(mg);n——空白校正滤膜个数。g)取滤膜上的悬浮体样品，在实验室激光粒度仪中测量样品粒度。6.4悬浮体现场粒度和体积浓度测量技术要求包括如下：9a)粒度测量范围：根据海域特征可选择1.25μm～250μm或2μm～500μm量程的仪器测量；b)测量分辨率：32个粒级；c)测量准确度：误差范围应小于2%。现场水下激光粒度仪。测量要求包括如下方面：a)每年对现场激光粒度仪进行校准，每次下水作业前应做背景值测试；b)测量时避免作业船螺旋桨搅动水体等干扰，仪器入水测量倾角按仪器使用说明要求进行；c)激光粒度仪浸入海水表层后，应停留3min～5min,使探头温度与海水温度平衡；仪器按各站的要求匀速下放，下放过程中自动记录每个间隔层的现场粒度；下放到位后，再匀速收回并同上做相同自动记录，每次下放和上升各记录一个剖面的深度、粒级分布和体积浓度数据；d)测量资料用原始格式和ASCⅡ格式贮存，包括背景测试文件和剖面数据文件；由仪器下放过程记录的深度和粒级分布给出该站位的粒级分布剖面；仪器上升过程的粒级分布剖面用于校核。6.5颗粒有机碳和有机氮测定采用干式燃烧法测量颗粒有机碳和氮。高温条件下(900℃~1000℃)有机碳转化为CO₂,氮氧化物转化为N₂。用热传导方式可以测得两种气体。其中颗粒有机碳(POC)单位为μg/L,颗粒氮(PN)单位是pg/L。6.5.2调查仪器与试剂调查仪器与试剂包括如下：a)采水器：采用采水体积与过滤量相当的采水器；b)滤膜：推荐玻璃纤维(GF/F)或者石英纤维滤膜，孔径不超过0.7μm;c)元素分析设备：在高温灼烧条件下，用TCD气相色谱方法检测CO。和N₂;d)电子天平分析：称量精度为10-⁵g/g;e)浓盐酸(试剂级),乙酰苯胺(试剂级)或EDTA(试剂级)。现场取样包括如下工作程序：a)滤膜预处理：在马福炉内500℃条件下高温灼烧5h,冷却后用电子天平称重；b)将采水器中的海水全部过滤到滤膜上，并用蒸馏水洗去滤膜上的多余盐分，置于一40℃深冷环境中密封保存；c)用高温灼烧过的铝箔包裹、储存滤膜。样品分析方法包括如下程序：a)推荐将滤膜置于闪烁管内，在65℃环境下熔化干燥12h;闪烁管预先用酸清洗干净，并经高温处理(450℃条件下高温灼烧2h);b)将干燥的滤膜置于充满HCl气体的干燥器内12h;c)随后重复步骤a),干燥悬浮颗粒样品；d)建议将滤膜样品封存于预处理的镍管中(850℃,1h),准备上机测试；e)每20个～40个样品应进行1次标准化测试，以检验分析设备的漂移与误差；大约每10个样品需要做1次空白样测试。悬浮体调查的资料整理应满足本标准的有关规定。7有孔虫调查7.1方法概述通过对有孔虫的活体和遗壳进行采集、处理、保存、鉴定和分析等，了解调查海区有孔虫在沉积物中的分布和保存状况，以反映该区域的水文和环境变化。7.2技术要求技术要求包括以下方面：a)根据工作任务确定采样方式，并预先设计采样流程。其中，表层取样要求是海底表层0cm~2cm的样品，柱状取样的分层按照每2cm的间隔，或者按照任务要求；b)不同海区沉积物中有孔虫丰度相差较大，可根据任务需要确定采样量。一般在河口近岸地区，沉积物取样推荐20g～50g干样，陆坡至深海沉积物取样推荐2g～10g干样；c)确保样品不产生混样和污染，并认真填写、记录站位和样品信息；d)将壳径大于0.15mm的有孔虫镜检，一般对于浮游有孔虫建议鉴定到种，对于底栖有孔虫的优势种类应鉴定到种，其他可鉴定到属或归为生态类别(例如，瓶虫类),注意记录有孔虫的磨损、破碎和溶蚀现象等保存情况；e)有孔虫群落统计时，如全样中大于0.15mm的壳体不足300个则计数全样；若壳体数量太多时，可利用分样器或对角线分样法划分样品计数分样，每个分样样品鉴定统计建议不少于300个有孔虫；建议浮游有孔虫分样壳体数量镜检约300个，底栖有孔虫分样壳体镜检约150个；f)对各鉴定种类的统计最后需换算为相对丰度，以百分含量(%)表示；或根据任务要求换算成绝对丰度，单位以个每克干样表示；对于表层沉积样品，也可以采用个每平方厘米表示。7.3有孔虫样品的采集和保存根据不同的海底沉积物类型，有孔虫标本获取和处理方法主要分为两类：a)河口近岸浅水型：沉积物以陆源碎屑为主，沉积速率快，有孔虫含量少。样品用蒸馏水或自来水加少量六偏磷酸钠浸泡，使之分散，加上适量的过氧化氢去除有机质，加热使之充分反应，然后用0.063mm孔径的网筛冲洗干净；样品烘干后，可选择四氯化碳进行浮选，浮选时需充分搅拌使有孔虫壳体悬浮，并迅速将悬浮物倒入0.063mm的滤纸进行过滤，便可获得纯净的有孔虫标本；b)陆坡及深海型：沉积物中陆源碎屑相对少，沉积物颗粒细，沉积速率较慢，有孔虫含量多。样品用蒸馏水或自来水浸泡分散，经过0.063mm孔径网筛的水洗，之后烘干便可直接用于有孔虫标本的制作。7.3.2沉积遗壳的采集和保存采集有孔虫遗壳样品，需要沉积物采样工具(如箱式采样器、多管采样器、重力采样器等)并在海洋调查船上进行。样品应冷藏保存，也可以根据工作任务需要，在现场处理(如用虎红染色，以区分活体和遗壳)后，再密封冷藏(4℃)保存。7.3.3活体有孔虫的采集和保存对于活体有孔虫调查，采集表层沉积物(一般为沉积物表面0cm～2cm,但也可根据任务需求研究表层0cm～15cm的沉积物)进行酒精固定，样品以虎红溶液染色48h以内，再进行样品处理和分析，以区分活体和遗壳。用于分子鉴定的样品，需采集现场沉积物中的活体有孔虫，冷藏或超低温冷冻保存，回实验室进行处理和分析。7.4工具和试剂工具和试剂包括如下：b)网筛(孔径0.063mm,孔径0.15mm)、结晶皿(50mL、100mL)7.5有孔虫样品的处理和分析7.5.1沉积遗壳的处理和分析结晶皿或烧杯编号并称重编号并称重的工作程序如下：a)取结晶皿用清水洗净；b)将结晶皿于60℃干燥箱中烘干；c)将结晶皿编号并称重(精确到0.01g);d)在样品表格里记录结晶皿的重量和对应的样品号，填写冲样记录表(参见表H.1)。样品烘干称重的工作程序如下：a)取原始沉积物样品放入已称取重量的结晶皿中，并记录编号；b)称沉积物湿重；c)在60℃干燥箱中完全烘干，并称重，计算获得样品的干重。样品浸泡的工作程序如下：a)取出烘干的沉积物，加入蒸馏水或自来水，充分浸泡(1天～2天)使样品完全分散；b)有机质含量高的样品，以浓度为3%的双氧水浸泡样品2h后再进行冲洗(主要针对河口近岸沉积物，还可添加少量六偏磷酸钠使沉积物样品更加松散，但本步骤不适于深海沉积物和有孔虫活体研究)。冲样并烘干的工作程序如下：a)将样品完全转移至孔径为0.063mm的网筛中，用流水反复将样品冲洗干净；b)转移冲洗干净的样品至结晶皿中并编号；c)结晶皿于60℃恒温箱中烘干；d)烘干后的样品称重并记录为粗组分重量。浮选浓缩的工作程序如下(可选择进行，主要针对河口近岸沉积物):a)大烧杯编号与样品号对应；b)四氯化碳悬浮；c)完全干燥后，将沉积物残渣倒入结晶皿并编号；d)结晶皿镜检，将剩余沉积物残渣装袋并标记站位。装瓶封存的工作程序如下：a)将称重后的干燥样品分别过0.15mm网筛和0.063mm网筛；b)两组样品分别装瓶并贴上标签，注明样品层位及壳径信息。镜检制片和分析的工作程序如下：a)将大于0.15mm的样品进行镜检；b)随机挑选150个～300个壳体制标本片；c)根据工作任务的需要，进行分类鉴定和群落统计(包括种数、丰度、分异度及各类群比值等);d)对于河口近岸沉积物，根据工作任务的要求，可选择进行对0.063mm的样品进行鉴定统计；e)填写有孔虫鉴定统计表(可根据工作需要自行设计)。7.5.2活体有孔虫的分子鉴定采用针对有孔虫的特异性引物，扩增其18S核糖体DNA(18SribosomalDNA,18SrDNA)、内转录间隔(InternallyTranscribedSpacer,ITS)、28S核糖体DNA(28SribosomalDNA,28SrDNA)等基因片段，获得单个体有孔虫的核酸序列。设备和工具包括如下：a)仪器设备：体视显微镜、冰箱、水浴锅、高速离心机、聚合酶链式反应仪(PolymeraseChainRe-试剂包括如下：a)DNA提取试剂：脱氧胆酸钠(Nadeoxycholate,DOC)裂解缓冲液、胍盐裂解缓冲液、异丙醇、70%乙醇、1×TE缓冲液(Tris-EDTAbuffersolution,TE缓冲液)、Glycoblue(DNA共沉淀c)PCR产物纯化用试剂：琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、琼脂糖；d)DNA连接用试剂：DNA连接试剂盒(包括DNA连接酶、连接用载体、连接缓冲液)、双蒸水；e)克隆培养用试剂：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉、氨苄(终浓度0.1mg/mL)、感受态细胞、5-溴-4-氯-3-吲哚-βD-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosiGal)(最终浓度40μg/mL)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyr-f)1×TAE电泳缓冲液(Tris-acetate-EDTAbuffersolution,TAE缓冲液);.1DOC法(适用于壳表粗糙的钙质种类)DOC法提取有孔虫DNA的工作程序包括如下：a)用灭菌过滤海水将待测有孔虫壳体表面清洗干净；b)取一只洗净的有孔虫置于50μLDOC裂解液中，研磨；d)10000r/min离心5min;e)取上清液，即为靶DNA,DOC裂解液配方包括如下(总体积为1000μL):a)三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,TRIS]1M(pH8.5)100μLb)乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)0.5M(pH8.0)8μLc)DOC(Nadeoxycholate脱氧胆酸钠)10%100μLd)曲拉通X-100(Trito.2胍盐法(适用于壳表致密的钙质种类、玻璃质壳种类、砂质壳种类)胍盐法提取有孔虫DNA的工作程序包括如下：a)用灭菌过滤海水将待测有孔虫表面清洗干净，取一只洗净的有孔虫置于50μL胍盐裂解液中，必要时将其磨碎；b)60℃加热15min,或者室温过夜；c)8000r/min离心1min,将上清液转移至新的1.5mLEP管中；d)加入1μLGlycoblue(Glycoblue应置于冰上),混匀；f)使上述混合物在-20℃沉淀至少2h,或过夜；g)最大转速离心15min,移走上清液，注意不应扰动沉淀；h)用100μL70%酒精洗涤上述沉淀物；i)最大转速离心1min,移走上清液；j)将沉淀物真空干燥5min～10min,或者室温下干燥更长时间；k)用15μL～20μLTEBuffer溶解沉淀物，于4℃放置至少1h,或过夜，期间取出涡旋数次；1)提取物即为靶DNA,于-20℃保存。总体积为212mL,配制方法如下：a)100mL双蒸水；b)100g异硫氰酸胍；e)60℃~70℃加热10min,搅拌使其溶解；f)加入4.24gN-月桂酰肌氨酸钠；g)加入2.1mLβ-巯基乙醇；h)用双蒸水将总体积调至212mL,于4℃保存。扩增引物包括如下，如表1所示：基因基因片段扩增引物再扩增引物小亚基(SmallSubunit,SSU)s14-sBs14F3-newBs14F1-newB大亚基(LargeSubunit,LSU)2TA-L72TA-L1F2TA-L7ITS1+5.8S+ITS2s20-2TAICsBr-2TAIC引物碱基序列s14F3:5’ACGCAMGTGTGAAACTTG3'newB:5'TGCCTTGTTCGACTTCTC3’s14F1:5’AAGGGCACCACAAGAACGC3’2TA:5'CACATCAGCTCGAGTGAG3’L1F:5'ACTCTCTCTTTCACTCCC3’L7:5’GATGWGTCATTACCACC3’s20:5’TTGTACACACCGCCCGTC3’2TAIC:5'CTCACTCGAGCTGATGTG3’sBr:5'GTAGGTGAACCTGCAGAAGG3’注：某些有孔虫种类DNA序列的扩增需要进行巢式PCR,即分别用不同的引物、不同的PCR程序，进行2次PCR扩增。反应体系包括如下(总体积为25μL):c)DNA模板1μL～5μL;扩增反应程序包括如下：a)热盖开启105℃;b)95℃预变性60s;c)94℃变性30s;d)50℃退火30s;e)72℃延伸90s;f)重复步骤b)～d)共34次；h)终止于4℃。再扩增反应程序包括如下：a)热盖开启105℃;b)95℃预变性60s;c)94℃变性30s;d)52℃退火30s;f)重复步骤b)～d)共24次；g)72℃延伸3min;h)终止于4℃。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测PCR产物有无及扩增的DNA片段长度是否正确。PCR阳性产物克隆技术使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，将经过琼脂糖凝胶电泳分析结果为阳性的PCR产物进行纯化。将DNA连接试剂盒中的试剂，包括DNA连接酶、连接用载体、连接缓冲液置于冰上融解，按照试剂盒说明配制连接反应体系，于16℃连接反应过夜。以下操作建议在超净工作台中进行：a)开42℃水浴锅、超净工作台，取固体细菌基础培养基(Luria-Bertani,LB培养基)(含氨苄)放b)从一80℃冰箱取出感受态细胞，置于冰上融解；d)冰浴30min;e)42℃水浴热激90s;g)加入800μLLB液体培养基(不含氨苄);i)取20μL～50μL菌液均匀涂布在含有X-Gal、IPTG、氨苄的LB固体培养基平板上；j)放入37℃培养箱，培养10h～14h。阳性单克隆检测的工作程序如下：a)挑选白色菌落进行菌落PCR,PCR反应体系及反应程序按照.2和.3.2的规定；b)电泳检测，确认插入片段的长度是否正确；c)选取插入片段正确的单克隆，在1mL的LB液体培养基(含氨苄)中扩大培养10h后送其菌液进行测序。7.6资料整理有孔虫调查的资料整理应满足本标准的有关规定，群落分析的计算方法见附录E。8介形虫调查8.1方法概述通过对介形虫的活体和遗壳进行采集、处理和保存，以及鉴定分析等，了解调查海区介形虫在沉积物中的分布和保存状况，来反映该区域的水文和环境变化。8.2技术要求技术要求主要包括以下方面：a)根据工作任务确定采样方式，并预先设计采样流程。其中，表层取样要求是海底表层0cm~2cm的样品，柱状取样的分层按照每2cm的间隔，或者按照任务要求。b)不同海区沉积物中介形虫丰度相差较大，可根据任务需要确定采样量。一般在河口近岸地区，沉积物取样推荐20g～50g干样，陆坡至深海沉积物取样推荐2g～10g或20g干样。c)确保样品不产生混样和污染，并认真填写、记录站位和样品信息。d)介形虫的鉴定采用体视显微镜，一般介形虫优势种类鉴定到种，其他可鉴定到属，注意记录介形虫的磨损、破碎和溶蚀现象等保存情况。e)介形虫群落统计时，如全样中的壳体不足100个则计数全样；壳体数量太多时，可利用分样器或对角线分样法划分样品，每个分样样品鉴定统计推荐约100个介形虫。f)对各鉴定种类的统计最后需换算为相对丰度，以百分含量(%)表示；或根据任务要求换算成绝对丰度，单位以个每克干样表示；对于表层沉积样品，也可以采用个每平方厘米表示。8.3介形虫样品的采集和保存根据不同的海底沉积物类型，介形虫标本获取和处理方法主要分为两类：a)河口近岸浅水型：沉积物以陆源碎屑为主，沉积速率快，介形虫含量少。样品用蒸馏水或自来水加少量六偏磷酸钠浸泡，使之分散，加上适量的过氧化氢去除有机质，加热使之充分反应，然后用0.063mm的网筛冲洗干净，样品烘干后，可选择四氯化碳进行浮选，浮选时需充分搅拌使介形虫壳体悬浮，并迅速将悬浮物倒入0.063mm的滤纸进行过滤，便可获得干净的介形虫标本；b)陆坡及深海型：沉积物中陆源碎屑相对少，沉积物颗粒细，沉积速率较慢，介形虫含量较多。样品用蒸馏水或自来水浸泡分散，经过0.063mm孔径网筛的水洗，之后烘干便可直接用于介形虫标本的制作。8.3.2沉积遗壳的采集和保存采集介形虫遗壳样品，需要沉积物采样工具(如箱式采样器、多管采样器、重力采样器等)并在海洋调查船上进行。样品需要冷藏保存，也可以根据工作任务需要，在现场处理(如用虎红染色，以区分活体和遗壳)后，再密封冷藏(恒温为4℃)保存。8.3.3活体介形虫的采集和保存对于活体介形虫调查，对现场采集的表层沉积物(一般为表面0cm～2cm,但也可根据任务需求研究表面0cm～10cm的沉积物)进行酒精固定，样品以虎红染色48h以内，再进行样品处理和分析，以区分活体和遗壳。8.4工具和试剂工具和试剂包括如下：b)网筛(孔径0.063mm,孔径0.15mm)、结晶皿(50mL、100mL)8.5介形虫样品的处理和分析8.5.1结晶皿或烧杯编号并称重编号和称重的工作程序如下：a)取结晶皿用清水洗净；b)将结晶皿于60℃干燥箱中烘干；c)将结晶皿编号并称重(精确到0.01g);d)在样品表格里记录结晶皿的重量和对应的样品号，填写介形虫冲样记录表(参见表H.1)。8.5.2样品烘干称重样品烘干称重的工作程序如下：a)取原始沉积物样品放入已称取重量的结晶皿中，并记录编号；b)称沉积物湿重；c)在60℃干燥箱中完全烘干、称重，计算获得样品的干重。样品浸泡的工作程序如下：a)取出烘干的沉积物，加入蒸馏水或自来水，充分浸泡(1天～2天)使样品完全分散；b)有机质含量高的样品，以浓度为3%的双氧水浸泡样品2h后再进行冲洗(主要针对河口近岸沉积物，还可添加少量六偏磷酸钠使沉积物样品更加松散，但本步骤不适于深海沉积物和介形虫活体研究)。冲样并烘干的工作程序如下：a)将样品完全转移至孔径为0.063mm的网筛中，用流水反复将样品冲洗干净；b)转移冲洗干净的样品至结晶皿中并编号；c)结晶皿于60℃恒温箱中烘干；d)烘干后的样品称重并记录为粗组分重量。8.5.5浮选浓缩(可选择，主要针对河口近岸沉积物)浮选浓缩的工作程序如下：a)大烧杯编号与样品号对应；b)四氯化碳悬浮；c)完全干燥后，将沉积物残渣倒入结晶皿并编号；d)结晶皿镜检，将剩余沉积物残渣装袋并标记站位。装瓶封存的工作程序如下：a)将称重后的干燥样品分别过0.15mm网筛和0.063mm网筛；b)两组样品分别装瓶并贴上标签，注明样品层位及壳径信息。镜检计数的工作程序如下：a)将大于0.15mm的样品进行镜检；b)若标本量足够，随机挑选100个～200个壳体制标本片；若标本不足100个则全部挑选；c)根据工作任务的需要，进行分类鉴定和群落统计(包括种数、丰度、分异度等);d)对于河口近岸沉积物，根据工作任务，可选择进行对0.063mm的样品鉴定和统计；e)填写介形虫鉴定统计表(可根据工作需要自行设计)。8.6资料整理介形虫调查的资料整理应满足本标准的有关规定，群落分析的计算方法见附录E。9放射虫调查9.1方法概述调查浮游性放射虫沉积在相关海域沉积物中的保存状况，揭示该类动物群的埋藏丰度与组合特征。技术要求包括如下：a)表层取样要求是采集沉积物表层0cm～2cm的样品，柱状取样的分层按照每2cm的间隔，或者按照任务要求；b)陆架浅水型的分析样品取5g～10g,陆坡及深水型的分析样品推荐取1g～2g或5g;c)放射虫的标本鉴定在生物显微镜的透射光中进行，一般鉴定到种类，在不同的调查海区可各自选取约60个优势种或常见种进行种类鉴定，其他种类标本仅做数量统计；如任务要求统计种类多样性，则需鉴定每个分样中的全部种类；d)放射虫群落统计时，如全样中的壳体不足300个则计数全样；壳体数量太多时，可利用分样器或对角线分样法划分样品，每个分样样品鉴定统计不少于300个放射虫；e)对各鉴定种类的统计最后需换算为相对丰度，以百分含量(%)表示；或根据任务要求换算成绝对丰度，单位以个每克干样表示；对于表层沉积样品，也可以采用个每平方厘米表示。9.3放射虫样品的采集和保存根据不同的海底沉积物组成类型，放射虫标本获取的处理方法主要分为两类：a)陆架及浅水型：以陆源碎屑及各种钙质生物壳体为主，沉积速率较快，放射虫含量很少。样品用干净水加焦磷酸钠浸泡使之分散，加上适量的过氧化氢与盐酸去除有机质和钙质颗粒，加热使之充分反应，然后用0.063mm的网筛冲洗干净，样品烘干后为了去除部分粗颗粒，采用四氯化碳进行浮选，浮选时需充分搅拌使放射虫壳体悬浮，并迅速将悬浮物倒入0.063mm的筛绢或滤纸进行过滤，便可较为容易获取干净的放射虫标本；b)陆坡及深海型：陆源碎屑很少，尤其是沉积物颗粒较细，沉积速率较慢，放射虫标本含量较多。样品用干净水加少量焦磷酸钠浸泡分散，再加上适量的过氧化氢与盐酸(依钙质颗粒含量而定)去除有机质和钙质颗粒，直至停止反应，处理后的残余样品经过0.063mm孔径网筛的水洗，之后烘干便可直接用于标本薄片的制作。9.3.2沉积遗壳的采集和保存采集放射虫遗壳样品，海底表层样品采用箱式采样器、抓斗采泥器及柱状取样管的表层0cm~2cm样品。样品用塑料袋、塑料盒或玻璃瓶封存，保存在4℃的冷库中，或存放在一般的样品库中也影响不大。9.4工具和试剂工具和试剂包括如下：璃棒；b)试剂：焦磷酸钠、过氧化氢、盐酸、四氯化碳、酒精、中性树胶、二甲苯(用于稀释或清除残余树胶)。9.5放射虫样品的处理和分析样品前处理的工作程序如下：a)称取干样1g～2g或5g左右，放入300mL烧杯中，加入200mL干净水和0.5g～1g焦磷酸钠浸泡约10h;b)沉积物在水中被分散后，根据有机质含量加入适量的H₂O₂(30%,分析纯),置80℃水浴中，并充分浸泡一段时间，直至反应结束，期间注意控制加热的程度与时间，避免因溢出泡沫而丢失放射虫标本；c)根据钙质含量加入适量36%分析纯的HCl,等待约10min,或至反应结束；d)加入适量干净水，静置约5min,倒掉上层清液，如此重复2遍～3遍，以去除多余的HCl和H₂O₂,减少水体中的酸性含量；e)将烧杯置于超声波振荡器中，持续1min～2min,以除去放射虫表面粘附的粘土；f)用0.063mm铜筛冲洗样品，注意不应用过大的水力冲洗，以免标本的溢出；g)将0.063mm筛子中的剩余样品收集到小烧杯或器皿中沉淀、去水、烘干，以备制片。薄片的制作工作程序如下：a)干样制片法：取用每一个样品的全部(或按比例)标本，置于载玻片中央，滴上若干酒精使其分散，并用针形物协助均匀铺开，铺开的面积与盖玻片(一般为24mm×50mm)相同，稍后酒精全部挥发，或可在电热板上加速烘干，待标本中的水分完全去除后，滴加3滴～5滴中性树胶，再用盖玻片轻轻地覆上，使树胶慢慢扩散至完全遍布标本与盖玻片的区域。制片之前或之后需在载玻片上做好样品的编号标记；b)水样制片法：在标本中保存一定量的水，使用小吸管先均匀搅拌，再吸取一定比例的含水样均匀地置于载玻片上，分散面积与盖玻片面积相同，之后将载玻片放在电热板上烘干，其余的封片方法与上述相同；c)使用电热板加热或烘干的温度一般控制在60℃~80℃;d)制作好的标本薄片可让其自然干固，也可放在烘箱中一段时间(60℃~80℃,不宜过高，以免起泡),待树胶固结硬化后用二甲苯清洗(擦除)薄片上的多余树胶；e)将薄片贴上事先准备好的标签，注意与编号的一一对应。9.6资料整理放射虫调查的资料整理应满足本标准的有关规定，群落分析的计算方法见附录E。10沉积硅藻调查调查通过对硅藻遗壳进行采集、富集和统计鉴定，查明调查海区硅藻遗壳的分布状况、保存状况以及群落组成，进而反演调查海域的水文、气候和环境信息。技术要求包括如下：a)表层取样要求是沉积物表层0cm～2cm的样品，柱状取样的分层按照每2cm的间隔，或者按照任务要求；b)如果分析样品为湿样，取5g～10g;如果分析样品为干样，则取1g～5g;c)硅藻的标本鉴定在生物显微镜的透射光中进行，每个样品进行随机行数观察，建议鉴定到种或变型，否则鉴定到属。对于壳体不完整的个体，中心纲硅藻以一半以上完整，羽纹纲硅藻以纵沟一侧完整参与记数。在不同的调查海区可各自选取优势种或常见种进行鉴定(如任务要求统计种类多样性，则需鉴定每个样品中的全部种类),其他种类标本仅做数量统计；d)每个分样样品鉴定统计的个体数量要求大于300个，单位以个每克干样或个每平方厘米表示，如分析样品中的硅藻标本不足300个，则全部统计；对各鉴定种类的统计最后需换算为相对丰度。10.3沉积硅藻样品的采集和保存根据不同类型海底沉积物中硅藻含量的不同，硅藻标本的处理方法分为两类：a)陆架及浅水型：以陆源碎屑及各种钙质生物壳体为主，沉积速率较快，硅藻含量相对很少。硅藻标本获取的处理方法为样品用蒸馏水浸泡分散，再加上适量的过氧化氢与盐酸(依钙质颗粒含量而定)去除有机质和钙质颗粒，直至停止反应，再将处理好的样品置于比重约为2.4的溴化锌或其他重液中进行浮选，充分搅拌使硅藻样品悬浮，之后便可直接用于标本薄片的制作；b)陆坡及深海型：陆源碎屑很少，尤其是沉积物颗粒较细，沉积速率较慢，硅藻标本含量相对较多。硅藻标本获取的处理方法为样品用蒸馏水浸泡分散，再加上适量的过氧化氢与盐酸(依钙质颗粒含量而定)去除有机质和钙质颗粒，直至停止反应，之后便可直接用于标本薄片的制作。10.3.2沉积遗壳的采集和保存表层沉积物：用塑料刀或勺从采泥器中刮取刚采集的样品上部0cm～2cm的沉积物，代表表层样。通常情况下，取5g左右新鲜样品，装入聚乙烯袋中封存，贴上填写好站号及层位的标签，放入样品柱状沉积物：按照分析的精度，在每个层位取5g左右新鲜样品或1g干样，装入聚乙烯袋中封存，贴上填写好站号及层位的标签，放入样品箱中，置于阴凉处保存，备分析使用。通风橱。10.5沉积硅藻样品的处理和分析离心机法的工作程序如下：a)用长柄药匙取2g左右沉积物湿样，置于5mL试管底部，加入体积约三倍于样品的10%HCl去除钙质，至不冒气泡为止(具体时间视沉积物中的钙质含量决定);b)在2500r/min转速下离心分离5min,倒掉残余HCl并用蒸馏水清洗试管内部3次；c)洗净后加入30%H₂O₂3mL～4mL,在恒温60℃水浴锅中煮1h～2h去除有机质，至不冒气泡为止；d)在2500r/min转速下离心分离5min,倒掉H₂O₂,并用蒸馏水清洗试管内部3次。注：根据耗费时间的长短，有离心机法和静置沉淀法两种前处理程序。如果时间允许，建议少用离心机，用静置沉淀的方法分离沉积物与上清液。静置沉淀法的工作程序如下：a)取沉积物样品1g～2g,在装有硅藻样品的小烧杯中加入10%～15%的稀盐酸，待样品与盐酸完全反应后搅拌均匀并静置12h～24h;b)倒掉残余盐酸；加入蒸馏水，静置至少24h后，倒掉上清液，如此用蒸馏水重复清洗3次；c)加入浓度为30%的双氧水(H₂O₂),置于恒温水浴锅中(60℃)加热1h～2h;d)将样品从水浴锅中取出，同样用蒸馏水清洗3次。注：如果样品为干样，则宜取干样1g～5g,放入300mL烧杯中，加入200mL蒸馏水和0.5g～1g焦磷酸钠浸泡约10h,待沉积物分散后，再进行上述相关处理。玻片的制作工作程序如下：a)盖玻片在使用前先用10%～20%的稀HCl浸泡至少24h,然后再用酒精浸泡去除HCl,以备使用；b)用玻璃棒将处理好的硅藻液体均匀涂于盖玻片上，待盖玻片上的硅藻液体风干后，在载玻片上滴加1滴～2滴中性树脂，轻轻盖上涂好的盖玻片，避免产生气泡；c)制作好的标本玻片可让其自然风干，也可放在烘箱中加热48h(45℃~55℃,不宜过高，以免起泡);d)取出玻片，待玻片冷却后，在玻片上贴好已准备的标签，保存于样品盒中；e)每个样品制片两张，以备鉴定分析。将做好的玻片在×1000倍生物显微镜下进行硅藻的鉴定，计数在×400倍下进行。每个样品统计硅藻壳面数至少300粒(不包括硅藻休眠孢子和复大孢子)。计算出各硅藻种占各样品硅藻总数除硅藻休眠孢子和复大孢子外的相对百分含量，以便于进一步的数理统计分析。沉积硅藻调查的资料整理应满足本标准的有关规定，群落分析的计算方法见附录E。11颗石藻调查调查通过对沉积物中颗石藻取样分析和观察鉴定，进行年代地层学分析，推测沉积物的地层年代；对颗石藻群落特征分析，探讨其海洋学/古海洋学意义；对颗石藻保存特征分析，探讨沉积环境(含沉积物来源)或成岩作用。技术要求包括如下：a)取样质量：样品无污染和混样，采用一次性取样工具；b)取样深度或间隔：海底表层取0cm～2cm深度的样品，箱式、多管和柱状取样的分层按照每2cm～10cm的间隔，或者按照任务要求。对于保存一定沉积序列抓斗样，有条件可插管，然后按柱状样分层取样；c)取样量：陆架浅水型沉积物取5g～10g,陆坡及深水型沉积物取1g～2g,并换算成干重。推荐采样体积大于3cm³或重量大于5g,可满足制片前清理样品(刮去外层)、多次制片或扫描电镜样分析的需求；d)鉴定要求：优势类别鉴定到种或属；e)统计要求：每个样品至少观察5个视野(显微放大倍率1000倍),鉴定统计的个体数量要求大于300个。如分析样品中颗石粒个体不足300个，则至少观察统计100个视野；f)群落特征参数：包括种类数、优势种和常见种，计算相对丰度、分异度等。11.3颗石藻样品的采集和保存常见的沉积物取样方式主要有箱式、多管、抓斗、重力活塞以及钻探等方式，其中抓斗取样难以获得代表海底海水和沉积物交界的沉积物样品，少数情况可保存一定沉积序列。取样后，样品用密封式塑料袋(常用)、密封式塑料盒或玻璃瓶封存，有条件可保存在恒温为4℃的冷库中，或存放在常温样品库中保存。11.4工具和试剂工具和试剂包括如下：a)制片工具：烧杯(常用50mL,20mL),洗瓶，电热板，载玻片，盖玻片，大小号吸管，玻璃棒(大b)试剂与溶剂：蒸馏水，氨水(碱性缓冲液pH9左右配制：1L蒸馏水中加数滴氨水，摇匀，用试纸检验pH值),稀盐酸(10%)用于清洗容器和工具；c)封片介质：要求折射率低于或介于方解石之间，即1.658～1.486,中性树胶(或加拿大树胶),或光学胶水(该法需要配备紫外光照射),或冷杉胶；d)观察工具：主要为偏光显微镜(放大倍数200倍、400倍、1000倍),显微镜的反差装置视需要而定。有条件可用扫描电镜或透射电镜。11.5颗石藻样品的处理和分析颗石藻由于个体十分微小，很容易受到交叉污染，制样中注意以下事项：a)试验台洁净：用于制样的部分最好用一次性纸张覆盖，制完一个样品后更换，制样过程中应避免溶液飞溅；b)样品新鲜：宜刮去样品外表，使用里面样品；从样品袋中取样或刮样品表面时避免手接触样品，可用一次性手套或用一次性纸张隔离；c)制样容器和工具洁净：宜使用一次性工具(如牙签、纸张),多次使用的容器和工具需清洗并在稀盐酸(10%)中浸泡10min左右，最后冲洗干净。简单涂片法的工作程序如下：a)标记一个载片；b)刮取绿豆大小的新鲜沉积物，置于盖片/载片上；加一滴蒸馏水，用牙签来回涂抹成浓稠的沉积物悬浮液；c)用牙签在盖片/载片上薄薄地涂抹一层；涂片过程中可将粗颗粒用牙签赶到边缘并抛弃，然后置电热板(通常设定温度70℃~90℃)上快速干燥；d)取适量封片介质置于载片/盖片上，并将盖片盖在载片上，置于电热板上加热，压实和挤压排除介质中气泡，取下冷却；如使用罗兰德光学胶水(Norland),则用紫外光照射数分钟即可。其中第2步的替代方法为：b)取原样少许置于烧杯中加入适量缓冲后的蒸馏水浸泡分散，混合均匀后取1滴～2滴滴于盖片/载片上陆架浅海或深海重力流沉积样品中颗石含量很少，需要采用沉淀富集法，步骤如下：a)溶解和分散样品：取约1g样品，置于烧杯中加入适量缓冲液(pH9左右)浸泡后搅动分散；或置于超声波水池中震荡10s～15s,使样品散开，搅动均匀；b)分离粗碎屑物：搅动均匀后的样品溶液静置5min～10min左右，粗颗粒(砂)碎屑逐渐沉淀到烧杯底部，将上覆样品溶液倒入另一烧杯，抛弃底部粗碎屑物；c)分离粘土碎屑物：上覆样品溶液(烧杯加盖或覆盖纸张)静置15h～20h,倒弃上覆溶液(主要含粘土矿物),取底部沉淀物搅匀，制样。如样品中粘土粒级组分多，该步骤可重复2次~3次。该步骤也可用离心法，需要对代表性样品预实验，以确定分离粘土组分所需离心处理时的转速与时间。颗石藻调查的资料整理应满足本标准的有关规定，具体工作包括以下几个方面：a)颗石藻的分类鉴定：对颗石藻观察和鉴定的方法主要借助偏光显微镜，放大1000倍左右观察，一般鉴定到种或属，部分类别可鉴定到属。对于个体十分微小的物种，可借助扫描电镜等，放大10000倍以上观察鉴定；b)颗石藻保存特征分析：颗石藻保存特征指颗石藻个体是否遭受(化学溶蚀或物理破碎)破坏或次生结晶(重结晶)作用及程度的粗略定性和定量分级特征(见表I.1);沉积物中所有颗石粒相对丰度特征，即颗石粒个体占沉积物碎屑颗粒数量的百分比(见表I.2),参考Rothwell(1989)估计沉积物中矿物碎屑颗粒含量方法。均应观察10个以上视野(放大倍率1000倍),其中确定沉积物缺乏颗石粒的观察应统计100个视野；c)颗石藻类别丰度定量分析：有两个最低数量要求每个样品鉴定统计颗石藻个体数量大于300个；每个样品观察视野(1000倍)数大于5个，这5个视野宜分散在样品涂片中不同部位。对于颗石藻丰度很高样品，单个视野中颗石藻个体数接近或大于100个，可利用目镜中十字丝划分观察象限，对1/4视野中的颗石藻进行观察统计，同样至少统计5个视野中的1/4象限；对颗石藻十分稀少样品，至少统计100个视野；d)颗石藻类别丰度计算：对于海洋调查项目，推荐用相对丰度，分别计算每个类别个体总数占颗石藻总个体的百分比；e)另有多种半定量统计法(如Backman,1983等),可计算观察薄片中一定面积内生态或年代标志颗石藻类别的丰度。而定量分析的制片法(随机沉降法，如Beaufort,1991;Su,1996;或喷涂法，如Bollmann等，1999;小珠标准法，如Okada,1992),可估计单位重量样品中颗石藻类别的绝对丰度。这些方法多用