7-1第七章-食品微生物检验-菌落总数测定

第七章食品微生物检验第一节食品微生物

生境：指生物的个体、种群或群落生活地域的环境，包括必需的生存条件和其他对生物起作用的生态因素。生境是指生态学中环境的概念，生境又称栖息地。生境是由生物和非生物因子综合形成的，而描述一个生物群落的生境时通常只包括非生物的环境。一、食品生境特征丰富的营养物质：碳源、氮源、无机盐及维生素；

基质条件：水、pH、渗透压；天然防御结构/抑菌物质：鸡蛋：壳胶膜-蛋壳-壳膜-蛋白-蛋黄；贮存条件/环境条件：温度、气体。食品中微生物主要来自：土壤水空气人体活动二、食品中微生物来源和种类1、食品微生物来源及污染途径1）原料污染/原发性污染/一次污染a.土壤：土壤是微生物的天然培养基，它具备微生物正常发育所必须的一切条件。含有大量的微生物，细菌来自天然生活在土壤中的自养菌和腐物寄生菌以及随动物排泄物及其尸体进入土壤的细菌；b.空气：在冬春季节，更容易发生感冒等传染病，就是因为空气的传播；c.水：水也是微生物存在的天然环境，水中的细菌来自土壤、尘埃、污水、人畜排泄物及垃圾等；d.人与动物：人与动物自出生后，外界的微生物就逐渐进入人体。在正常人体皮肤、粘膜及外界相通的各种通道（如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道）等部位，都存在着微生物群。e.生产环境与食品用具。

2）继发性污染/二次污染:加工、运输、储存中污染

2、食品腐败变质/变败1）食品腐败变质/变败（foodspoilage）食品腐败变质，是指食品受到各种内外因素的影响，造成其原有化学性质或物理性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程。如鱼肉的腐臭、油脂的酸败、水果蔬菜的腐烂和粮食的霉变等。2）食品腐败变质/变败的原因食品中含有蛋白质，脂肪，碳水化合物，这些成份是微生物的生长基质，所以微生物在食品中能够生长繁殖。环境中无处不存在微生物，食物在生产、加工、运输、储存、销售过程中，很容易被微生物污染。只要温度适宜，微生物就会生长繁殖，分解食物中的营养素。这时食物中的蛋白质就被破坏了，食物会发出臭味和酸味，颜色也会发生变化从而造成食品变质。3）食品腐败与食品成分及微生物的关系（1）食品腐败变质是以食品本身的组成和性质为基础，在环境因素的影响下，主要由微生物的作用所引起的。是微生物、环境因素和食物本身三方面相互影响和综合作用的结果。（2）成分不同，引起食品变质的微生物种类也可能不同：

A.霉菌对蛋白质/脂肪/糖类的分解能力均强；B.少数细菌能分解蛋白质/脂肪，多数能分解单双糖,少数能分解多糖；

C.酵母除多数能利用单双糖外，其他均弱；

根据食品的成分可以推测引起食品变质的主要微生物类群。

2024/5/103、食品微生物种类引起食品变败的常见细菌假单胞菌属黄杆菌属产碱杆菌属芽胞杆菌属梭状芽胞杆菌引起食品变败的常见霉菌青霉曲霉镰刀菌根霉毛霉2024/5/104、食源性疾病(food-bornedisease)WHO定义——由于摄入食物中带有的各种致病因子而引起的感染性或中毒性疾病。食物是传播疾病的媒介，食物中的致病因子可分为生物性、化学性、物理性三类。生物性致病因子细菌及其毒素：包括食物中毒病原菌、肠道传染病病原菌和人畜共患病病原菌；霉菌及其毒素：如黄曲霉毒素、镰刀菌毒素等；病毒：如甲肝病毒；寄生虫及虫卵：蛔虫、绦虫、旋毛虫等。第二节卫生指示微生物一、微生物检验的目的

1、临床微生物检验：

1）为诊断提供病原学依据；

2）为治疗提供参考用药的信息。2、卫生微生物检验：通过指示微生物的检测，判断水、空气、食品、化妆品以及各类公共场所等的卫生状况。二、卫生指示微生物1、定义：是在常规卫生监测中，用以指示样品卫生状况及安全性的（非致病）微生物（或病毒）。2、指示微生物的类型1）一般卫生状况指示微生物最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌总数。意义：评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性。2）粪便污染指示微生物主要指大肠菌群，其他还有肠球菌、产气荚膜梭菌、噬菌体以及脊髓灰质炎病毒等。意义：标志着检品受过人、禽畜粪便的污染，同时也可表明有肠道致病菌存在的可能。3）致病菌（控制菌）食品、化妆品或药品等样品中规定一些不得检出的致病菌，包括某些特定环境不能检出的菌类例如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、溶血性链球菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、肉毒梭菌、破伤风芽胞杆菌等。意义：这些指示菌，在不同的样品中有不同的指示意义。主要内容：1.一般卫生状况指标菌检验：细菌菌落总数、霉菌和酵母菌2.粪便污染指标菌检验：大肠菌群、粪大肠菌群3.致病菌检验：沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、肉毒梭菌及肉毒毒素、产气荚膜梭菌、单核细胞增生李斯特氏菌、变形杆菌等。三、食品卫生微生物检验4.检测与检验检测（test）

对给定的产品、材料、设备、生物体、物理现象、工艺过程或服务，按规定程序确定一种或多种特性或性能的技术操作。

从定义可以看出，“检测”仅是一种技术操作，它只需要按规定程序的操作并提供所测结果。不需要给出所测数据合格与否的判定。

检验（inspection）

对实体的一个或多个特性进行诸如测量、检查、试验和度量，并将其结果与规定的要求进行比较，以确定每项特性的合格情况所进行的活动。

从定义可以看出，“检验”不仅提供数据，还须对规定要求进行比较后，作出合格与否的判定。第三节食品微生物学检验菌落总数测定一、菌落总数1、菌落的定义：菌落（colony）是由单个细菌（或其他微生物）细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群落。通常是细菌在固体培养基上（内）生长发育，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞的集团，称之为菌落。2、菌落总数的定义：食品微生物学检验菌落总数的测定(GB

4789.2—2016)是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。以菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）CFU/g（mL）来表示。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，36±1℃培养48±2h，水产品30±1℃培养72h±3h。能在平板计数琼脂培养基（PCA）上生长发育的细菌菌落总数。所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长

3、细菌总数

指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1

g或1

mL样品中的细菌总数来表示。4、菌落总数测定的卫生学意义1）菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等；2）菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据；3）食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。二、食品微生物学检验菌落总数测定(GB

4789.2—2016)（一）方法原理每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的培养条件（如培养温度、培养时间、pH、需氧性质等）满足其要求，才能分别将各种细菌培养出来。但在实际工作中，细菌菌落总数的测定一般都只用一种常用的方法去做，即国际标准规定的平板计数法，标准检验方法多用倾注培养法。倾注法所得结果只包括一群能在平板计数琼脂培养基（PCA）上生长的嗜中温需氧菌的菌落总数，并不表示样品中实际存在的所有细菌菌落总数。（二）设备和

材料1、

食品检样2、

培养基：平板计数琼脂培养基，无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液。3、

其它：无菌培养皿，无菌吸管（1ml，10ml），量筒，烧杯，酒精灯，天平，电炉，恒温培养箱等。

PCA与NA21（三）检验程序

1、检样；2、做几个适当倍数的稀释液；3、选择2~3个适宜稀释度各1mL,分别加入灭菌平皿内；4、平皿内倾注15～20mL平板计数琼脂培养基，混匀；5、36±1℃培养48±2小时或30±1℃培养72h±3h；6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量；7、计算菌落总数→报告；菌落总数测定操作流程（四）操作步骤1.样品的稀释1.1固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，放入于装有225mL磷酸盐缓冲稀释液或0.85％生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液；或放入于225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液。1.2液体样品：以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。固体样品称量用镊子取酒精棉消毒桌子、擦手，点燃酒精灯；打开稀释瓶盖，放在天平上，等显示屏上的数字稳定后，按“去皮”键，当数字显示为“0”时，开始称量。去皮键无菌取样样品均质用量筒量取225mL灭菌生理盐水至稀释瓶中。（注意：稀释瓶、带塞锥形瓶开盖前要过火，量筒、装有灭菌生理盐水的锥形瓶及其塞子应放在酒精灯周围15cm的范围内）1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0mL，沿管壁缓慢注于装有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

1.4另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

25g+225mL灭菌生理水10-1固体样品-1-1-2-2-3-3空白空白10-210-3灭菌生理水吹吸5次，吹吸5次，1mL1mL提示：样品加入稀释液管后，要先吹吸，后取1mL样液加入培养皿。10mL10-1吹吸50次，1mL1mL1.5根据对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在做10倍递增稀释的同时，吸取1.0mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别取1mL稀释液加入两个无菌平皿作空白对照。

1.6样品匀液移入平皿后，应及时将凉至46℃平板计数琼脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)注入平皿约15mL～20mL，并转动平皿使混合均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入加有1.0mL空白稀释液的无菌平皿内作对照。在培养皿上编号提示：培养皿上的标记为稀释倍数。固体样品：稀释倍数为10-1、10-2、10-3-1-1-2-2-3-3空白空白00-1对照空白对照：不加样品，只在平皿注入平板计数琼脂培养基，反应培养基中的杂质及污染情况稀释液对照：加1mL无菌稀释液，平皿注入平板计数琼脂培养基，反映稀释液是否受到污染样品对照：加1mL样品稀释液，平皿注入平板计数琼脂培养基，凝固后放冰箱，以区别样品中的杂质无菌操作对照：打开平板计数琼脂培养基平皿，并在空气中暴露30min，反应空气质量和操作技术。洁净级别标准超净工作台，要求100级；无菌室空间，要求1万级。332.培养2.1琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养箱内培养48h±2h。水产品采用30℃±1℃培养72h±3h(08，10,16新增)。

2.2琼脂凝固后，如果怀疑样品中含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），并在报告上记录该操作，待覆盖层凝固，翻转平板，按2.1条件进行操作。3菌落计数3.1可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录相应的菌落数量和稀释倍数。菌落计数以菌落形成单位（colonyformingunits,CFU）表示。

3.2平板菌落数的选择

选取菌落数在30CFU～300CFU个之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU个菌落的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板平均数。3.3其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2，代表全平板菌落数。3.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，即将每条链作为一个菌落计数。如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。平皿分4部分点数：求同一稀释度的平均菌落数：A1数+A2数

2（1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）中菌落总数结果。（见表例1）。（2）若有两个连续稀释度在适宜计数范围内（30～300个菌落）时，按如下公式计算：

N=∑C/(n1+0.1n2)d式中：

N—样品中菌落数；∑C—平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1—

第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2—

适宜范围菌落数的第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d—

稀释因子（第一稀释度）；4.结果与报告4.1菌落总数的计算方法：菌落计算公式有两个稀释度的菌落数在合适范围的情况下，使用菌落计算公式。39例一40例二41

（3）若所有平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例4）。（4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例5）若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。（5）若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例6）。（6）若所有稀释度的菌落数均不可计数，则以最高稀释倍数无法计数报告之（见表例7）。菌落总数测定实验结果图片展示

10-3

10-2

10-1稀释度选择及细菌总数报告方法（表7）

稀释液及菌落数

10-110-210-3

11,36516420

16，400

16，000或1.6×10422,7602954637，7503.1000或3.1×1032,8902716027，1003不可计4，650513513，000510，000或5.1×105427115270

270或2.7×1025无菌落

无菌落无菌落<1×10

<106不可计3051230，50031，000或3.1×10-3

稀释倍数

平均

菌落数例次细菌总数(CFU/g或ml)

报告方式(CFU/g或ml)菌落总数计算方法的选择:

菌落数报告结果1、30~300之间平均菌落数X稀释倍数2、在30~300之间(若有两个稀释度)

按新公式计算（旧标准：求比值>2取较小稀释倍数；<2取平均数）3、>300最高稀释度平均菌落数X最高稀释倍数4、<30最低稀释菌度平均落数X最低稀释倍数5、>300或<30取最接近的X稀释倍数

6、无法计数报告无法计数

（1）菌落数在100以内时，按“四舍五入”方式修约，采用两位有效数字报告。

（2）大于或等于100时，前第3位数字采用“四舍五入”方式修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”方式修约，采用两位有效数字。

（3）若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

（4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

（5）称重取样以CFU/g为单位报告，按体积取样的以CFU/mL为单位报告(表面取样以CFU/cm2报告)。4.2菌落计数的报告：4.3菌落计算公式的统计学依据47菌落计数的重复性要求（ISO4833:2003）48菌