酶联免疫吸附测定技术

酶联免疫吸附测定技术

（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA）1酶联免疫吸附测定技术5/9/2024

复杂生物体系中生命物质的化学测量是揭示生命奥秘的重要手段，在食品检验、疾病诊断和预防的过程中也日益凸现其重要作用。

经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、简单的吸光光度法）是以简单离子或分子为检测对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂且待测物浓度较低的测试条件则往往无能为力。2酶联免疫吸附测定技术5/9/2024

于是，一系列针对生物体系中化学成分的测量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。3酶联免疫吸附测定技术5/9/2024免疫酶技术（immunoenzymatictechnique）是继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫（RIA）分析技术之后，1971年Engvall和Perlmann又发展起来的一种新技术。是利用酶的高效催化和放大作用与特异性免疫反应结合而建立的一种标记免疫技术。4酶联免疫吸附测定技术5/9/2024免疫酶技术的原理是用酶标记的抗原（或抗体）用于免疫反应，并以相应的底物被酶分解的显色反应对样品中的抗体（或抗原）进行定位、定性和定量的分析和鉴定。5酶联免疫吸附测定技术5/9/2024免疫酶技术酶免疫组织化学技术(enzymeimmunohistochemicaltechnique)酶免疫测定技术(enzymeimmunoassay，EIA)均相酶免疫测定法(homogenousenzymeimmunoassay)非均相酶免疫测定法(heterogeneousenzymeimmunoassay)

是在检测过程中抗原抗体反应后，无需分离结合和游离酶标记物，直接根据反应前后酶活性的改变进行待测物质的测定的分析方法，主要用于药物和小分子物质的检测，主要形式为酶放大免疫测定法(Enzymemultipliedimmunoassay)。

需经过结合的标记物和游离的标记物的分离才能测定，分离的方法主要通过固相载体吸附后清洗未结合的游离标记物，主要形式是酶联免疫吸附测定法(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)6酶联免疫吸附测定技术5/9/2024

ELISA现在已成为目前生物技术领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。目前，该项技术已在医学、兽医学、法医学上得到广泛的应用，大多数传染病都有ELISA检测方法。

7酶联免疫吸附测定技术5/9/2024抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的高效性2024/5/98一、ELISA基本原理和过程将抗原（抗体）固相化，与酶标记的相应抗体（抗原）结合后，加入该酶作用的底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。8酶联免疫吸附测定技术5/9/2024ELISA基本原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。E9酶联免疫吸附测定技术5/9/2024Y

①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）

Y②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）10酶联免疫吸附测定技术5/9/202411酶联免疫吸附测定技术5/9/2024包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化。抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定。酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色。（二）ELISA基本实验过程12酶联免疫吸附测定技术5/9/2024底物显色定性或定量的分析包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234ELISA基本过程2024/5/91313酶联免疫吸附测定技术5/9/2024加样本微量反应孔包被好的抗体14酶联免疫吸附测定技术5/9/2024振荡、洗板待测项目（抗原）15酶联免疫吸附测定技术5/9/2024加入酶标记的抗原V16酶联免疫吸附测定技术5/9/2024V酶标记物轻链螯合剂辣根过氧化物酶重链17酶联免疫吸附测定技术5/9/2024振荡、洗板V18酶联免疫吸附测定技术5/9/2024加入底物显色液HHHHHHHHHHHHHH19酶联免疫吸附测定技术5/9/202420酶联免疫吸附测定技术5/9/202421酶联免疫吸附测定技术5/9/2024三、酶联免疫吸附试验的特点

（一）灵敏度高（二）特异性强（三）简便、快速（四）重复性好（五）自动化程度高，适合大批量标准化检测（六）安全

二、ELISA的特点22酶联免疫吸附测定技术5/9/2024特点一：灵敏性

该测定法的灵敏度来自作为标记的酶。酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml。

23酶联免疫吸附测定技术5/9/2024特点二：特异性

其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。

例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAg），虽来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。24酶联免疫吸附测定技术5/9/2024

酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物，是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应。三、酶及其底物25酶联免疫吸附测定技术5/9/2024酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶(HRP)邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶（AP）

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

26酶联免疫吸附测定技术5/9/2024肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。各组各人独立观察记录。测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长，以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔OD值2倍为阳性。四、ELISA结果的判定27酶联免疫吸附测定技术5/9/2024结果的判定空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅待检样品孔显色明显空白对照28酶联免疫吸附测定技术5/9/2024定量方法：标准曲线待检样本29酶联免疫吸附测定技术5/9/2024

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）五、ELISA的类型和操作步骤30酶联免疫吸附测定技术5/9/2024ELISA的类型和操作步骤（一）直接法（二）间接法（三）双抗体夹心法（四）竞争法（五）捕获法测IgM抗体（六）ABS-ELISA根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。31酶联免疫吸附测定技术5/9/2024（一）直接ELISA（检测抗体）酶标一抗

直接法是将抗体经过纯化，再用一种易于识别的示踪剂标记，然后使其直接与抗原结合，通过检测抗体上的标记物来测定相应抗原。

在直接检测法中应用标记的一抗可减少操作步骤，且不易出现背景问题，但敏感性低于间接法，而且所用的每一种抗体都必须分别进行标记。32酶联免疫吸附测定技术5/9/2024（二）间接法（检测抗体）方法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗抗体或二抗，加底物显色。间接法其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。优点：其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体建立检测相应抗体的方法。检测抗体最常用的方法，常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定。

33酶联免疫吸附测定技术5/9/2024间接法34酶联免疫吸附测定技术5/9/20242024/5/93535酶联免疫吸附测定技术5/9/202436酶联免疫吸附测定技术5/9/2024洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+2024/5/937YHLO专业培训37酶联免疫吸附测定技术5/9/2024洗涤洗涤间接法测抗体YEYYYEYYYEYYEYYEYYEYY+38酶联免疫吸附测定技术5/9/2024（三）双抗体夹心法（检测抗原）方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色。应用：是检测抗原最常用的方法，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原（乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG）。39酶联免疫吸附测定技术5/9/2024双抗体夹心法40酶联免疫吸附测定技术5/9/2024洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY2024/5/941YHLO专业培训41酶联免疫吸附测定技术5/9/2024（四）竞争法（检测抗原、抗体）方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检抗原竞争与包被抗体结合加底物显色。

42酶联免疫吸附测定技术5/9/2024竞争法（检测抗原）应用：此法可用于抗原和半抗原的定量测定，小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。43酶联免疫吸附测定技术5/9/2024washTMB标准HBcAg标准酶标HBcAbwash待检HBcAb

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb，HBcAb；竞争法（检测抗体）44酶联免疫吸附测定技术5/9/2024洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE2024/5/945YHLO专业培训45酶联免疫吸附测定技术5/9/2024用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合分别洗涤除去未结合的成分加底物显色分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量竞争法46酶联免疫吸附测定技术5/9/2024对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。竞争法47酶联免疫吸附测定技术5/9/2024（四）捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和非特异性IgM，以及特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定，因此测定IgM抗本多用捕获法。其原理是先用抗人IgM（μ链）抗体包被固相载体，使血清中所有IgM(包括特异性与非特异性IgM)均固定在固相上，经洗涤去除IgG后，再测定特异性IgM。应用：此方法目前主要用于检测各类早期感染的特异性抗体IgM,如病原体急性感染诊断中的IgM型抗体、甲型肝炎HAV-IgM抗体、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体。48酶联免疫吸附测定技术5/9/2024捕获法测IgM抗体1.将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。2.加入稀释的血清标本：血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤。3.加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。4.加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。5.加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。49酶联免疫吸附测定技术5/9/2024捕获法

原理：抗人IgMμ链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色

2024/5/95050酶联免疫吸附测定技术5/9/2024洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色2024/5/951YHLO专业培训51酶联免疫吸附测定技术5/9/2024（五）ABS-ELISA52酶联免疫吸附测定技术5/9/2024五、酶联免疫分析技术的设备1、加样器2、洗板机3、孵育箱4、加速仪5、酶免分析仪6、数据分析方法7、结果报告系统2024/5/953YHLO专业培训53酶联免疫吸附测定技术5/9/2024六、ELISA的应用ELISA在其他领域测中的应用ELISA在疾病诊断中的作用54酶联免疫吸附测定技术5/9/2024病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒等

蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标记物非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定……ELISA在疾病诊断中的作用55酶联免疫吸附测定技术5/9/2024

ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒

ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体ELISA在疾病诊断中的作用

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2024/5/960YHLO专业培训YHLO专业培训60酶联免疫吸附测定技术5/9/2024应用酶联免疫分析的产品

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