结核分枝杆菌传统药敏试验方法

1传统的药敏实验

SJKim,TheUnion结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/20242药敏试验的目的耐药监测 -评估治疗方案 -选择有效的标准方案病例管理 -诊断耐药结核病(耐多药/广泛耐药结核病）-为个体病例(耐多药/广泛耐药结核病）选择有效的方案

结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/20243

问题

►

可靠性:技术重复性/临床反应预

测►

周转时间►操作可行性及可持续性►成本结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/20244基于标本的药敏检测系统直接法直接涂片法（涂片阳性）

优点:结果快;更好的反映耐药情况

缺点:大多数药敏试验不理想;接种量不容易标化/

可行性较差

-间接法

对结核分枝杆菌进行培养后进行药敏试验

优点:更好的控制接种量

缺点:结果延迟结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/20245以传统的生长检测为基础的药敏试验方法

以传统生长检测为基础的方法WHO（1963）的标准方法

绝对浓度法-Meissner

-标化接种量;药物浓度梯度抗性比率法-Mitchison-克服培养基中药物浓度变化的缺点

比例法-Canetti/Grosset

-

临界浓度比例,更好的控制接种量

[GCanetti/JGrosset,France;SFroman,USA;PHauduroy,Switzerland;MLangerova/LSula,Czechoslovakia;HTMahler(WHO);GMeissner,Germany;DAMitchison,England]结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/20246以快速培养生长检测为基础的药敏试验方法

快培生长系统观察显微镜下的微小菌落:-玻片培养;显微镜观察的药敏试验（MODS）代谢情况检测:

-CO2

产生量(放射BACTEC460;

色素变化

MB/Bact3D)-O2

消耗

(荧光产生

MGIT960)-TREK系统

(ESP培养系列

II)-微盘:

阿莫拉蓝试验(指示管)/TEMA-ATP产生,生物荧光试验

噬菌体检测:FASTPlaque;Bonxbox(LRP)结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/20247以检测基因突变为基础的快速药敏试验系统扩增目标区的DNA测序

聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术;-探针杂交:反向探针线性杂交方法;Hain

分枝杆菌药物抗性plus分子灯塔/信标:

GeneXpert系统是一个将样品准备、定量扩增和荧光检集于一身并自动进行核酸检测分析的系统;LAMP(Eiken)核酸环介导等温扩增技术高效液相色谱应用与扩增的DNA的突变检测结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/20248药敏试验的结果可靠性治疗结果的预测值-药敏试验的耐药标准试验可靠性-试验精确度&可重复性结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/20249药敏试验的校正

获得最相关的临床耐药标准▽

可能的敏感株的敏感级别▽在治疗反应变化方面测定敏感性水平▶从未接受过治疗的患者(PS)与至少接受5/6个月治疗的患者(PR)的标本菌株的敏感性进行比较

PS=>100菌株;PR=>50菌株CanttiG,etal.BullWHO1969;41:21-43.结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202410

可能敏感菌株/（可能无耐药性菌株）在不同药物浓度下的抑菌分布Minimalinhibitoryconcentrations(MIC)最小抑菌浓度FrequencyofstrainsClinicallysusceptiblestrains(PS)Breakpoint1SD3SD结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202411

不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布

FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)Breakpoint*Technicalvariation(inoculum/media/drugconcent.)Clinicallysusceptiblestrains(PS)Clinicallyresistantstrains(PR)结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202412

不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)PSPR2mcg/mlBreakpoint13.1as“R”75.811.1as“S”结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202413

可能敏感/可能耐药菌株对利福平的最小抑菌浓度的累积分布（此试验采用L-J培养基用绝对浓度法）85.8结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202414

不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布

FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)Breakpoint*InoculumvariationClinicallysusceptiblestrains(PS)Clinicallyresistantstrains(PR)结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202415

可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星敏感性分析采用L-J培养基Donotquotethisdata!(n=81)(n=111)结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202416

校正的乙胺丁醇的临界浓度

(此试验采用改良罗氏培养基的绝对浓度法)42%50%结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202417

可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对卡那霉素敏感性分析InL-JMediumIn7H10Medium67%67%结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202418抗结核药物的最低抑菌浓度比平均峰值EMBETHOFXCFXINHRMPKMCPMPASSM结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202419推荐的临界浓度药物LJ*7H107H11Bactec460MGIT960异烟肼0.20.20.20.10.1利福平40.01.01.02.01.0乙胺丁醇2.05.07.52.55.0链霉素4.02.02.02.01.0吡嗪酰胺NRNRNR100.0100.0卡那霉素30.05.06.04.0阿米卡星40.01.01.0卷曲霉素40.010.010.01.252.5环丙沙星2.02.02.02.01.0氧氟沙星2.02.02.02.02.0莫西沙星0.50.25加替沙星1.0乙硫异酰胺5.010.02.55.0丙硫异烟胺40.01.252.5PAS1.02.08.02.0环丝酰胺40.0NRNRNRNR氨苯硫脲NRNRNRNRNR利奈唑酮1.01.0*ProportionWHO推荐药敏试验的临界浓度,2007结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202420抗结核药物药敏试验程序复杂:必须在有质量保证的实验室才能实施2.试验操作危险大:操作只能在拥有好的设施及设备的实验室(BSL-3)进行,而且所有的实验室工作人员都要熟练的掌握每个程序结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202421影响药敏试验结果的物理化学环境因素培养基中活动性/精确的药物浓度药粉.试剂效价:剂量/溶解/稀释/存储

purityxactivefractionxH2O

EMB:99%purity;C10H24N2O2.2HCl(277.2-72.9=204.3);nowater;0.99x0.74x1.0=0.7326;1000mg→733mg-培养物的制备:(1)灭菌过程中热失活(2)蛋白结合;(3)拮抗剂/离子(4)pH值接种量:-接种量/离散度/可代表性-组织物的可行性试验结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202422浓缩过程中利福平的稳定性结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202423抗结核药物的储存在密封的硅胶容器内储存(最好在真空下储存)结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202424药敏试验接种物的制备Inoculate0.1mlvolumeofinoculumontoeachmedium结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202425比例法

(byMiddlebrook&Cohn)Dilute稀释1mg/mlbacterial

suspensionto10-3&10-5mg/mlbyserial10folddilution.Plant

接种0.1mlontoeachslopeofdrug-freeorcontainingmedium制备培养基Observe观察thegrowthafter4weeksincubation(ifthegrowthispoor,againafter6weeks).观察4周生长情况（如果培养基质量较差应观察6周）Report

报告theproportionofcoloniesgrownatthecriticalconcentrationofthedrug.在药物的临界浓度报告结果

DrugfreeIsoniazidEthambutolInoculummedia0.2mcg/ml2.0mcg/ml

10-3+++++310-52690%resistant34.60.1InterpretationResistantSusceptible结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202426药敏试验结果-11.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateone

loopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/㎖orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/㎖ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/㎖bacterialsuspension

orifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/㎖.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(㎍/㎖)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4

㎎)13+2+11870TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6

㎎)2282000InterpretationR(7.1)(2/28x100)S(0.03)(1/2800x100)S(0.6)(18/2800x100)S(0.3)(7/2800x100)MTB结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202427药敏试验结果-21.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateone

loopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/㎖orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/㎖ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/㎖bacterialsuspension

orifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/㎖.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(㎍/㎖)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4

㎎)14+2+21+3+0TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6

㎎)22+50010Interpretation?S??MTB结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202428药敏试验结果-31.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateone

loopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/㎖orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/㎖ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/㎖bacterialsuspension

orifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/㎖.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(㎍/㎖)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4

㎎)13515000TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6

㎎)200000InterpretationRR??MTB结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202429药敏试验的技术可靠性外部质量评估结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202430

17个跨国参比实验室网络第14轮熟练度测试结果

（数据来源于ArmandVanDeun

2007年）敏感性特异性效能可重复性Isoniazid异烟肼S敏感=13R耐药=17Average(%)99999998100%13141114<95%4313Rifampicin利福平S敏感=10R耐药=17Average(%)99999998100%14141214<95%3323StreptomycinS敏感=11R耐药=16Average(%)97919594100%121179<95%5688EthambutolS敏感=17R耐药=4Average(%)88979697100%1113811<95%6476蓝色数字表示实验室数量结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202431

51个国家（或地区）参比实验室利福平和异烟肼药敏试验结果的一致性

（世界卫生组织第四期全球耐药报告,2008）%Agreement一致性Isoniazid异烟肼Rifampicin利福平10038(77.6)37(72.5)95-996(12.2)9(17.6)90-944(8.2)5(9.8)<901(2.0)0Totalnumberoflabs合计49(100.0)51(100.0)结核分枝杆菌传统药敏试验方法5/9/202432TestDrug药物敏感性(%)特异性(%)患病情况下的耐药结果预测值(%)1%15%110%130%1KM2100909.2