细胞的传代培养和细胞计数法

细胞传代培养及细胞计数5/9/20241细胞的传代培养和细胞计数法人癌细胞系传代培养1.观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染；2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体；3.漂洗：加1ml0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消化液；4.消化：再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液,保留约0.3ml,室温放置3～5min；5.吹打：镜下看到细胞收缩变园,加1～2ml含血清培养液,用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫；6.计数：取样,计数,调整细胞浓度；7.接种及培养：按104

细胞/ml接种,37℃、5%CO2

，饱和湿度条件下培养。5/9/20242细胞的传代培养和细胞计数法注意事项细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,开始传代。首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。细胞混杂生长时,可根据需要选择合适的方法纯化细胞。

5/9/20243细胞的传代培养和细胞计数法5/9/20244细胞的传代培养和细胞计数法5/9/20245细胞的传代培养和细胞计数法5/9/20246细胞的传代培养和细胞计数法血球计数板法制备细胞悬液：细胞密度＞104/ml,细胞过多时需适当稀释,单个细胞率>95%。加样：混悬细胞，取少许细胞悬液，从计数池一侧加入，不要溢出或出现气泡。计数：10倍物镜下计数四角大方格内的细胞，压线者只计左边线和上边线。计算：细胞数/ml=（四大格细胞总数／4）×104×稀释倍数5/9/20247细胞的传代培养和细胞计数法5/9/20248细胞的传代培养和细胞计数法细胞活力测定－台盼蓝染色法制备单个细胞悬液：105～106／ml染色：0.04%台盼蓝染色1min(9滴细胞悬液＋1滴0.4%台盼蓝)，3min内计数计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染料拒染）和死细胞（呈淡蓝色）计算细胞活力：活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋死细胞数）］×1005/9/20249细胞的传代培养和细胞计数法5/9/202410细胞的传代培养和细胞计数法细胞密度调整稀释公式：C1·V1＝C2·V2稀释前细胞密度C1，溶液体积V1稀释后细胞密度C2，溶液体积V25/9/202411细胞的传代培养和细胞计数法细胞计数106/mlCellsusspension105/ml104/ml103/ml0.1ml0.1ml0.1mlMedium0.9ml5/9/202412细胞的传代培养和细胞计数法细胞生长曲线测定－计数法DT=t×lg2÷(lgNt－lgNo)5/9/202413细胞的传代培养和细胞计数法培养细胞的纯化方法机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞密度梯度离心法：细胞漂浮密度，

Ficoll,Percoll克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术电泳分离法：细胞表面电荷5/9/202414细胞的传代培养和细胞计数法细胞培养过程中常见的问题培养液pH值快速偏离：CO2浓度异常，培养瓶盖过紧；细菌、酵母或霉菌污染培养液出现沉淀：细菌或霉菌污染细胞不贴壁：胰酶过度消化细胞，支原体污染，缺乏附着因子

5/9/202415细胞的传代培养和细胞计数法细胞死亡：孵箱中缺CO2

，孵箱温度不稳定，细胞冻融损伤，渗透压改变，培养液中毒性代谢产物堆积细胞生长缓慢：培养液或血清改变，基本促生长成分的消耗、缺乏或降解,如谷氨酰胺、生长因子等，低