2018微生物检验技术师考点

1.仪器的标识管理：红（停用）黄（准用）绿（合格）各自所表

明的状态。

2.分光光度计检测细菌浓度用可见光分光光度计，测细菌波长用

600nmo检测蛋白用紫外分光光度计（波长用280nm）,它

也可测核酸浓度（波长260nm）o选定分光光度计测定颜色反应

光的波长是450nm。石英比色皿用于紫外分光光度计，玻璃比色

皿用于可见光分光光度计。

3.紫外透射仪该仪器使用条件是暗室和紫外线，主要用于

在紫外线下看DNA条带。

4.色谱气相色谱可做微生物分类和鉴定，用于微生物的化学成

分分析。液相色谱仪也可做微生物化学成分分析。质谱仪也可做微生

物化学成分分析。

5.测序仪蛋白测序仪测定氨基酸排列顺序，DNA测序仪是测

核昔酸排列顺序。能做DNA测序的物质是质粒、噬菌体、PCR产

物。

6.扩增仪PCR是聚合酶链反应缩写，能做PCR称DN

A扩增仪。它能以一定DNA片段为模板，变换温度，扩增该片段。

常用的“枪”是实验室常用的微量可调移液器。

7.酶标做ELISA的仪器称酶标仪，做EUSA反应，其中

主要设备有塑料凹孔板、洗板机和酶标仪。

8.电泳类别醋酸纤维膜电泳可用于免疫球蛋白鉴定，琼脂免

疫电泳用于蛋白分离和鉴定，对流免疫电泳可测抗原或抗体，火箭电

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泳测抗原量，交叉定量免疫电泳测抗原量。IFE是等电聚焦电泳。

PFGE是脉冲电场凝胶电泳，PAGE是聚丙烯酰胺凝胶电泳。

9.PAGE用于蛋白和核酸分离，原理是凝胶介质形成立体

多孔网状结构，具有分子筛和电泳作用。分离条带上边是大分子，下

边是小分子物质。过硫酸镂在PAGE制备起催化聚合作用。SDS

-PAGE是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，它用于蛋白分离,

在此电泳中，丙烯酰胺浓度越大，线性分离范围越小；该物浓度越小，

线性分离范围越大，十二烷基硫酸钠作用是解离蛋白，用标准蛋白做

标识测验电泳条带分子量。在SDS-PAGE中常用蛋白染料是考

马斯亮蓝，硝酸银也是其常用染料。该电泳中缓冲液重要成分为甘氨

酸。

10、等电聚焦电泳其原理是以两性电解质制造凝胶有不同P

H,使带不同电荷的多肽在电泳条件下于等电点停留。两性电解

质是制备该电泳凝胶不同PH重要物质，用聚丙烯酰胺制备等电聚焦

电泳凝胶。这种电泳主要用于蛋白质分离。

11、脉冲电泳脉冲电泳用于核酸分离，其优点是分离大片段

核酸。用琼脂糖制备该电泳凝胶的介质。这种电泳的电场为正交的交

变脉冲电场。脉冲电场凝胶电泳条带靠近负极为大片段DNA,靠近

正极为小片段DNA。DNA染色可用浪化乙锭，也可用硝酸银。因

澳化乙锭有致癌作用，故在使用时应注意。丙烯酰胺具有神经毒，在

用时注意个人防护。

12、琼脂糖凝胶电泳此电泳用于核酸分离与纯化，用水平电

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泳槽。分离DNA片段最佳范围为200bp〜50kb。

13、聚丙烯酰胺电泳该电泳通常用垂直电泳槽，分离DNA片

段是最佳范围是5〜500bpo

14.中华人民共和国国家标准GB19489—2004《实验室生物安全

通用要求》根据生物因子对个体和群体的危害程度将其分为4级：

危害等级I（低个体危害，低群体危害）不会导致健康工作者和

动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子。

危害等级H（中等个体危害，有限群体危害）能引起人或动物发

病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危

害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施,

并且传播风险有限。

危害等级m（高个体危害，低群体危害）能引起人或动物严重疾

病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播,

或能用抗生素抗寄生虫药治疗的病原体。

危害等级IV（高个体危害，高群体危害）能引起人或动物非常严

重的疾病，一般不能治愈，容易直接、间接或因偶然接触在人与人,

或动物与人，或人与动物，或动物与动物之间传播的病原体。

15.保存的病原微生物菌（毒）种要按规定进行登记、上报和

核准，实行双人双锁管理和使用审批制度。保存和使用各类病原

微生物菌（毒）种的实验室，应具备相应的实验室设备和设施条件,

并在二级以上生物安全柜中操作。细菌实验室在污染情况超过许可程

度时，通常采取甲醛熏蒸消毒。

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病毒篇

1.用于病毒分离的材料，无论是传代病毒培养物，还是采自发病

或死亡动物的病料，都应尽快送往实验室作病毒分离或鉴定。组织细

胞或动物接种和传代可以应用于病毒的分离和鉴定。病毒对细胞的感

染性具严格的选择性和特异性，因此用组织培养细胞接种病毒必须首

先选择敏感细胞。

(1)病毒增殖的判定：病毒在实验动物体和组织培养细胞内增

殖，显然都会影响机体和细胞的代谢和生命活动，并且经常通过一定

的形态学和病理学变化表现出来。

(2)细胞病变(CPE)：大部分病毒在敏感细胞系均可出现CPE,

CPE可以表现为严重的细胞破坏、细胞肿大、颗粒增多、细胞融合成

合胞体或无明显的细胞变化等。CPE经常具有病毒“种”的特性，因

此常常作为病毒鉴定的依据之一。

(3)病毒蚀斑(又称空斑)技术：病毒蚀斑是指病毒在已长成

的单层细胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的纯化或病毒悬液中

感染病毒含量的测定。

(4)病毒感染力的滴定：常用的病毒感染力的滴定有两种方法，

一种方法是用实验动物测定LD50(半数致死量)，另一种方法是在组

织细胞上测定TCID50(半数细胞培养物感染量)。

(5)病毒的保存：分离或鉴定后的病毒经过冷冻干燥后可以长

期保存。

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2.病毒形态学检查快速有效的标本制作技术故然重要，但

更需要识别病毒结构的经验。病毒形态学检查方法主要有：

(1)光学显微镜仅用于大病毒颗粒(如痘类病毒)和病毒

包涵体的检查。

(2)电子显微镜检查法

(3)超过滤法用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将

获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定

病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。

(4)超速离心法根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。

可用超速离心法测得病毒的沉降系数(S),借以计算病毒的大小。

(5)X线晶体衍射法但标本必须为结晶，可用于无包膜病毒

的研究。

3.免疫学鉴定

4.病毒的分子生物学鉴定分子生物学诊断的特异性取决于

核酸序列的特异性，病毒的分子生物学鉴定，包括对病毒核酸和蛋白

质的测定。核酸测定主要使用聚合酶链反应技术、探针技术和核

酸序列测定，检测病毒基因组中的特征性区段甚至整个病毒基因组;

而蛋白质测定可使用免疫测定技术、电泳技术和质谱技术，检测病毒

特异的蛋白质成分。

实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞都可以作为人工增

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殖病毒的基本工具。而大量病毒的培养，又是病毒学实验研究以及制

备疫苗和特异性诊断试剂的先决条件。

1.组织培养组织培养用的玻璃器皿要求比较严格，要用硫酸和

重酪酸钾溶液浸泡后再清洗应用。常用的人工综合营养液为MEM和

RPMH640。用人工综合营养液配制细胞生长液时需要加入适量血清和

谷氨酰胺溶液，还需要加入规定量的抗生素溶液防止细菌污染，加人

碳酸氢钠溶液修正pH,根据情况还可加入HEPES溶液可使生长液具

有较强的pH缓冲能力。能使组织和成片细胞分散成单个细胞的化学

制剂为胰蛋白酶和EDTA,EDTA使用液又可称之为Versen溶液，其分

散细胞的作用原理是EDTA可以结合钙、镁离子，使组织细胞分散。

动物血清中具有细胞生长所必需的各种营养因子，它能促进细胞的贴

壁和生长，且有很强的酸碱缓冲能力。细胞培养液在细胞培养过程中

可分为细胞生长液和细胞维持液两种。生长液是使细胞发育增殖的液

体，因此要求营养条件丰厚；维持液用于延缓细胞代谢，从而延长细

胞的存活时间，以利于实验的进行。这两种液体成分的主要区别是血

清含量不同。细胞生长适宜的pH范围是pH7.2〜7.6。细胞培养技术

全过程的关键是防止污染。

2.细胞株的保存二甲基亚碉是细胞低温保存的良好的保护剂,

含10%二甲基亚飒的血清可以作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细

胞。

3.病毒学上常用的细胞类型可分为原代细胞、二倍体细胞和

传代细胞三大类，原代细胞培养和传代细胞培养的根本区别在于细胞

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是否能在体外无限传代。

4.细胞的纯化细胞的纯化可以用细胞克隆技术。克隆是

指用无性繁殖方法产生的一组遗传上相同的细胞和生物群体的过程。

分子杂交，常规的细菌筛选和各种杂交时多选用硝酸纤维素滤膜

作为固相支持体。

(1)Southern杂交被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。

(2)Northern杂交被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。

PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的

变性、模板DNA与引物的退火复性、引物的延伸。

PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、

dNTP、模板DNA、Mg2+O

1、引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取

决于引物与模板DNA互补的程度。设计引物应遵循以下原则：

①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至

10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳,

G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的喋

吟或口密咤核甘酸的成串排列。

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④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补,特别是3'

端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要

求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适

宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同

源性。

引物量:每条引物的浓度0.1〜lumol或10〜lOOpmol,以最低

引物量产生所需要的结果为好。

2、酶目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆

菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型

的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可

引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

3、dNTPdNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP

粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，

在PCR反应中，dNTP应为50—200umol/L,

4、模板模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环

节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标

本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜

蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合

而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，

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再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙

醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测

标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色

体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采

用异硫氧酸胭或蛋白酶K法，要防止Rnase降解RNA。

5、Mg2+浓度

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反

应中，各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg中浓度为1.5〜衣Ommol/L

为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低

会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

基因芯片也称为基因微阵列技术，指采用原位合成或显微打印手

段，将数以万计的靶基因或寡核昔酸片段固化于支持物表面上，产生

探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过监测杂交信号来实现对

生物样品进行快速、并行、高效检测或医学诊断。基因微阵列技术主

要包括四个基本技术环节：芯片微阵列制备、样品的准备和标记、生

物分子反应和信号的检测及数据分析处理。

虽然基因芯片技术在微生物诊断中存在一定的不足，但还存在很

大的应用前景，其在微生物诊断中，具有以下优越性：1）高通量，

可以同时对多种微生物进行监控。2）多条探针的分子杂交，可以有

效的克服PCR易被污染的特点，从而提高了特异性。3）可以克服窗

口期漏检情况的发生。特别是将其应用于对几种微生物的多重感染的

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诊断上，和鉴定新的病原微生物上，如在SARS病毒的鉴定中发挥了

很大的作用。

一、DNA的复制和修复细胞每分裂一次，染色体DNA就合成

一次。DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成

另一条新单链，成为半保留复制。在体内DNA复制时必须有RNA引物。

二、转录在生物体内，DNA指导的RNA合成过程称为转录。

它是按照储存在DNA上遗传信息合成。合成RNA时DNA双链也要解旋,

解旋部位称启动子。

三、翻译在合成各种不同RNA中，tRNA具有搬运氨基酸功能。

构成核糖体骨架的是rRNA,而mRNA直接决定蛋白质的结构。4种核

甘酸排列组成遗传信息，合成蛋白质时转换成20种氨基酸的排列顺

序，遗传信息的这种转换称为翻译。3个核甘酸排列顺序代表一种氨

基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种，DNA三个终止密码子

分别是UAA、UAG、UGAo在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补

序列能发现蛋白质合成开始的位置。原核生物核糖体是由16SrRNA、

23SrRNA和5SrRNA组成。在真核生物核糖体的五种主要的组蛋白中，

H1在进化中最不保守。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限

制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链

DNAo它可分为三类，其中II类限制性内切酶在分子克隆和微生物鉴

定中得到了广泛应用。绝大多数II类限制酶识别长度为4或6个核昔

酸的回文对称特异核甘酸序列。DNA经限制性内切酶切割后.产生许

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多一定长度的片段，使用电泳的方法分离不同长度的片段，一种DNA

结构就能形成一种特征性的图形，称为DNA的电泳图谱。

琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可

分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在

强度和方向恒定的电场下电泳。

聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5〜500bp)效果较好，其分辨力极

高，甚至相差Ibp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶通常采用垂

直装置进行电泳。

电泳完毕后，使用滨化乙咤染色，DNA片段聚集的地方，在紫外

光下可以显示发橙色荧光的条带。如果电泳中使用了已知大小的DNA

片段作为分子量标志，可以测量并计算出每一DNA片段的长度。结合

使用多种限制性内切酶，通过综合分析将这些片段排列起来，便可作

出DNA的限制性内切酶酶切图谱。

DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位

置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

分子生物学基本技术知识点一一质粒DNA的分离、纯化和鉴定

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从「200kb不等，为

双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主

要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，

能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒

的存在使宿主具有一些额外的特性，如致病的能力和对抗生素的抗性

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细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。从细菌中分离质粒DNA的

方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;

分离和纯化质粒DNA。

抗体检测知识点一一抗体检测方法

（一）中和反应中和反应不仅测定抗体是否存在，而且测

定抗体是否具有免疫保护作用，因而，尽管这种方法复杂费时，影响

因素众多而且不稳定，在预防医学领域特别是病毒性疾病中，仍然是

不可取代的抗体检测方法。中和试验的基本方法是，将待检物质

与活的致病微生物混合，感染实验动物或敏感的细胞，然后观察实验

动物是否发病、死亡，或细胞是否发生病变。在结果的解释中应当注

意，细胞的中和试验通常只反应抗体阻断病毒进入细胞的能力，这只

是病毒致病过程中的一小部分。

（二）沉淀反应血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可

溶性抗原与相应抗体结合出现沉淀物，这类反应称为沉淀反应。该类

反应可检测到20〜2mg/ml水平的抗体。较常用的检测方法有：

1.单向免疫扩散将一定量已知抗原混于琼脂中制成琼脂板,

在适当位置打孔后将抗体加入孔中扩散，抗原抗体在扩散过程中形成

以抗体孔为中心的沉淀环，可用于检测血清中的IgG、IgM、IgA和补

体C3等的含量。

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2.双向免疫扩散将抗原与抗体分别加于琼脂凝胶中，二者

自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。可用于抗体的定性、定量检

测。

（三）凝集反应细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合

后形成凝集团块，这一类反应称为凝集反应。

1.直接凝集将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现

细菌或红细胞凝集现象。检测方法有两种：一是玻片凝集试验，用于

定性测抗原，多用于快速诊断；二是试管凝集试验，在试管种系列稀

释待检血清，加入已知颗粒抗原（死菌或活菌，多用死菌），进行的

血清反应，用于定量检测抗体。温箱中放24小时后取出反应管在室

温放2个小时再判断为宜，判定凝集滴度以凝集程度为++而定。

2.间接凝集将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表明，

与相应抗体反应出现颗粒凝集的现象。

（四）补体参加的反应利用抗体与红细胞上的抗原结合，激

活反应体系中的补体，导致红细胞的溶解，用溶血现象作为指示系统

帮助结果判定。常用的方法有补体结合试验和溶血空斑试验。

（五）用标记抗原进行的抗原抗体反应

利用荧光素、酶或放射性核素等标记物标记抗原或抗体，进行

的抗原抗体反应。灵敏度高、快速，可定性或定量，甚至定位等优点。

1.免疫荧光将已知细菌、感染病毒的细胞等颗粒抗原等固定于

载玻片，加待检血清反应后，再加荧光素标记的抗抗体，置荧光

显微镜下观察判定，用于检测抗体。

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2.酶免疫测定是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。可

用目测定性，也可用酶标测定仪测定光密度（0D）值以反应抗体

的含量，敏感度可达ng/ml甚至pg/mlo常用于标记的酶有辣根

过氧化物酶、碱性磷酸酶等。常用的方法有酶联免疫吸附试验（EUSA）。

采用双抗体夹心法或间接法检测特异抗体。

3.放射免疫测定法用放射性的核素（1251和1311）标记抗

原，检测抗体，灵敏度达pg/ml。

4.免疫印迹法将凝胶电泳与固相免疫结合，把电泳区分的

蛋白质抗原转移置NC或PVDF等膜上。检测特异的抗体。用该法

检测血清HIV抗体为诊断HIV感染的方法之一。

细胞免疫检验知识点一一淋巴细胞的分离与类型鉴定体外检测

淋巴细胞，需要先制备外周血单个核细胞（PBMc）,制备PBMC常用的

方法是葡聚糖一泛影葡胺（淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。以下

方法通过检测淋巴细胞的某些表面标志，可确定细胞的不同类型。

1.免疫荧光法2.磁珠分离法3.陶选法4.流式细胞术

细胞免疫检验知识点一一免疫细胞功能测定

（一）T细胞功能测定

1.T细胞增殖试验

2.细胞毒试验（1）51Cr释放法（2）乳酸脱氢酶释放法

（3）皮肤试验：根据局部红肿为特征的迟发型超敏反应的强度检测。

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常用的生物性抗原常从病原体中提取，如结核菌素、麻风菌素等。

(二)B细胞功能测定1.B细胞增殖试验B细胞受丝裂原刺

激后，进行分裂增殖，温育一定时间后检查抗体形成细胞的数目。

2.抗体形成细胞测定常用的溶血空斑试验测定。将-SRBC、待检

B细胞、补体及适量琼脂糖液混合，倾斜平皿，温育1〜3小时后，

肉眼观测分散的溶血空斑出现，每一空斑中央含一个抗体形成细胞,

空斑的数量即为抗体形成细胞数。

常用仪器知识点一一生物培养类

1.普通培养箱分为隔水式和直热式两种，隔水式培养箱采用

浸入式电热管隔水加温，箱内各部温度恒定均匀，为实验室首选；直

热式培养箱是以电炉丝直接加热，箱内上下层温度相差较大，指示用

温度计不能真实指示底层温度。

用途：用于普通需氧和兼性厌氧细菌的培养。当室温低时，也可用于

真菌培养。但细菌和真菌不可在同一培养箱内培养。使用时注意事项：

(1)箱体必须有效接地，避免将水溅在内层玻璃门上，以防玻璃受

骤冷而爆裂。

(2)隔水式培养箱在通电前，一定要先加水(以蒸储水或去离子水

为宜)，否则会烧坏电热管，经常观察水位指示浮标，水位不足时，

及时补足水量。

(3)箱内的培养物不宜放置过挤.以利冷热空气对流不受阻塞，保

持箱内温度均匀。培养时，打开箱体顶部的通风口，避免箱内湿度过

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大。

(4)如箱内温度不稳定，可检查温度控制器的接点或请专人检修。

(5)使用时应早晚观测箱内温度各一次，每次观测后记录箱内实际

温度。

(5)培养箱使用后要定期消毒，以免交叉污染，影响检测结果。

2.真菌培养箱是气温过高地区培养霉菌和酵母菌的必备设备。

配有加热、制冷、加湿、消毒系统，可自动调节温度，控制湿度、定

时消毒、自动换气等。当室温高于35c时-，也可用于培养细菌。但

真菌和细菌不可在同一培养箱内培养。使用时注意事项：

(1)接通电源后，打开开关，设定温度，并用测量开关测量箱内实

际温度。

(2)开机一段时间后加热和制冷两灯均不亮，表示箱内温度达到平

衡；如两灯同时亮，表示机器故障，须请专业人员检修。

(3)在箱内取放物品时，切勿碰撞探头，以免影响灵敏度。

(4)在制冷装置启动时，如有异常声音，应立即停机检修。

(5)仪器使用时应每天两次(早、晚各一次)观测记录箱内实际温

度，并由使用人和保管人签字。

(6)每批培养物培养后，要定期对培养箱内进行消毒，以免交叉污

染。

3.恒温振荡培养箱需恒温振荡培养的微生物可用此培养箱

培养。其内部有冷、热气流风道使箱内气体循环流畅，温度比较均匀。

实验室应根据需要选择相应温度范围和振荡频率的培养箱使用。

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使用时注意事项：

(1)设备要求工作地面平整且后部有散热空间，切勿冲击散热片。

(2)设备移动时要平行移动，任一方向不可倾斜大于45度。

(3)摇盘上的螺钉要经常检查，以免所夹物品脱落。

(4)如长期工作在“制冷”状态时或停机三个月以上，要按期做加

热驱潮处理，每隔两周一次。

(5)使用中定时观测箱内温度和转速，并做记录。

(6)如发生故障，应由专业人员检修。

4.厌氧(C02)培养箱主要用于厌氧菌、微需氧菌等的培

养。一般由控温、抽空、细菌过滤、细菌培养罐以及箱外的各种压缩

气体钢瓶组成。使用时注意事项：

(1)N2、C02钢瓶可立于箱体旁与箱体相连，H2钢瓶应另置安全

处，以免发生危险，用时用橡皮袋取出少许，与上述钢瓶配用。

(2)作厌氧培养时，打开培养罐门，将已接种好的培养物放人罐

内并迅速放人催化剂铝粒、干燥剂、亚甲基蓝指示剂，关闭罐门并扭

紧。

(3)打开此罐的电磁阀开关和真空泵开关，抽气至真空度达到

93.3kPa时,关闭真空泵开关。

(4)开启N2输气阀，慢慢开启N2钢瓶和减压阀，使罐内充满N2

气，关闭N2气，开启真空泵抽气，然后再用N2充气一次。

(5)第三次按N280%、H210%、C0210%充气。待指针回至零

位时关闭输气阀，再关减压阀和电磁阀。不可出现负压，影响厌氧环

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境。

(6)选择所需温度，进行培养。

(7)在培养过程中不可打开培养罐门。以免破坏厌氧环境。

(8)使用过程中要经常观测培养箱内温度，并进行记录。

常用仪器知识点一一显微成像类

1.显微镜可分为普通光学显微镜和电子显微镜，实验室可根据观

测项目不同选择相应的类型。利用光的衍射作用，以可见光为照明光

源的普通光学显微镜的分辨极限为200nm,可观测细菌和细胞，但对

于细菌和细胞的亚结构以及病毒，光镜无法辨认；电镜以电子束为照

明光源，其波长极短，可有效提高其分辨率，达到0.2nm,用电磁透

镜代替玻璃透镜。

2.暗视野显微镜可分辨0.04微米的物体，微生物实验室多

用于观察未染色标本活的细菌、真菌等，并可观察活细胞内的线粒体

及细菌鞭毛的运动。但其只能看到物体的存在和运动，不能看清其细

胞结构。载玻片厚度为1.0mm,且载玻片和盖玻片需清洁无划痕；

标本浓度不宜过浓。

3.荧光显微镜荧光显微镜是利用荧光光源(紫外光)作为

激发光，透过经荧光色素染色的标本，辐射出比激发光的波长较长的

荧光，经光学系统放大后，可观察其可见的荧光图像，可分辨标本内

一些物质的性质与位置。

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常用仪器知识点一一灭菌、消毒类

滤菌器是利用微孔滤膜的微小孔径通过抽滤或压滤，将微生物阻

留在滤膜上，以便进一步培养分析。从材质的不同可分为玻璃滤菌器

和金属滤菌器等；从工作原理的不同可分为负压抽滤和正压压滤。

1.超净工作台超净工作台是微生物实验室通常使用的无菌

操作台，比一般的无菌操作室更洁净.其洁净度可达百级。超

净工作台采用层流技术净化空气，分为水平式和垂直式，在层流

有效区内保持无菌环境。但不能保证微生物不污染环境和操作人

员。而另加一套空气回收系统的生物安全净化工作台，可避免被

检材料污染环境和操作人员。

2.生物安全柜生物安全柜可提供样品和工作人员的双重保

护。过滤后的洁净气流从安全柜顶部吹下，通过工作区域，在到

工作人员的呼吸区域前被俘获。气流在放空前将被过滤,一般情况

下过滤后的空气将被排回实验室。超净工作台提供的是对样品的

保护，对操作者和环境是不提供保护的；而生物安全柜同时提供

对操作者、环境和样品的保护。生物安全柜可分为一级、二

级和三级三大类以满足不同的生物研究和防疫要求。

(1)一级生物安全柜可保护工作人员和环境而不保护样品。气流

原理和实验室通风橱一样，不同之处在于排气口安装有HEPA过滤

器。所有类型的生物安全柜都在排气和进气口使用HEPA过滤器。

一级生物安全柜本身无风机，依赖外接通风管中的风机带动气流,

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由于不能保护柜内样品，目前已较少使用。

(2)二级生物安全柜是目前应用最为广泛的柜型。按照NSF49的

中的规定，二级生物安全柜依照人口气流风速、排气方式和循环

方式可分为4个级别：Al,A2,Bl,B2O所有的二级生物安全柜

都可提供工作人员、环境和样品的保护。

(3)三级生物安全柜是为4级实验室生物安全等级而设计的，柜

体完全气密，工作人员通过连接在柜体的手套进行操作，俗称手

套箱，试验品通过双门的传递箱进出安全柜以确保不受污染，适

用于高风险的生物试验。生物安全柜柜内操作主要注意事项：

A.缓慢移动原则：为了避免影响正常的风路状态，柜内操作时手

应该尽量平缓移动。

B.物品平行摆放原则：为了避免物品和物品之间的交叉污染现象

产生，在柜内摆放的物品应该尽量呈横向一字摆开，避免回风过

程中造成交叉污染。同时避免堵塞背部回风隔栅影响正常风路。

C.避免震动原则：柜内尽量避免震动仪器(例如离心机漩涡振荡

器等)的使用，因为震动会使得积留在滤膜上的颗粒物质抖落。

导致操作室内部洁净度降低，同时如果在前操作面平衡失败还会

引起安全柜对操作者的污染。

D.不同样品柜内移动原则：柜内两种及以上物品需要移动时，一

定遵循低污染性物品向高污染性物品移动原则，避免污染性高的物品

在移动过程中产生对柜体内部的大面积污染。

E.明火使用原则：柜内尽量不要使用明火！因为在明火使用过程

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中产生的细小颗粒杂质将被带入滤膜区域，这些高温杂质会损伤滤膜。

无法避免一定需要使用的时候，宜使用低火苗的本生灯。

F、需定时检测工作台性能，并记录检测结果，根据检测结果调

整过滤器。

G、该设备应有专人保管并记录使用和检修情况。

消毒知识点一一干热灭菌法干热的杀菌作用是通过脱水干

燥和大分子变性。一般细菌繁殖体，在干燥状态下80〜100℃经1小

时可被杀死；芽胞则需160〜170C,2小时才能杀灭。干热灭菌机制

如下：①使菌体蛋白质变性；②电解质浓缩引起中毒。

干热灭菌法包括：

(1)焚烧法：用火焚烧，是一种彻底的灭菌方法，仅适用于废

弃的污染物品和有传染性的动物尸体等。

(2)烧灼法：微生物操作用器材可在火焰上烧灼灭菌，但在分

子生物学实验中已不主张使用。

(3)干烤法：需在干烤箱内进行，通电后利用高热空气进行灭

菌。一般加热160〜170℃,维持2小时即可杀灭包括芽抱在内的一

切微生物。本法灭菌物品主要限于玻璃器皿、磁器或需干燥的注射器

等。

(4)红外线：产生热效应，但只能照到物体的表面，多用于医

疗器械的灭菌。

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消毒知识点一一湿热灭菌法湿热灭菌法是最常用的灭菌法，效

果较好。在同一温度下湿热杀菌效果优于干热，其原因有三：①湿

热中菌体吸收水分，蛋白质较易凝固。试验表明，蛋白质含水量增

加，凝固所需的温度降低；②湿热比干热的穿透力好，这主要是由于

水或蒸汽传导热能的效率明显高于空气；③蒸汽有潜热存在。每一克

水在100C时，由气态变为液态可放出529卡的热量。这种潜热能迅

速提高被灭菌物质的温度。湿热杀菌机制相对复杂，主要有以下

几点：①使菌体蛋白质变性和凝固；②使细菌核酸降解；③使细菌胞

浆膜损伤。

常用的湿热杀菌法有：

(1)煮沸法：煮沸100C5分钟可杀死细菌的繁殖体，但一般消毒

以煮沸10分钟为宜，杀死芽胞则需煮沸1~3小时。煮沸法主要用于

一般外科器械、注射器、胶管和食具等的消毒。若水中加入1%〜2%

碳酸氢钠，可提高沸点105C,既可增强杀菌能力，又可防止金属器

械生锈。

(2)流动蒸汽灭菌法：又称常压蒸汽消毒法，是利用一个大气压

下100C的水蒸汽进行消毒，加热15〜30分钟可杀死细菌的繁殖体，

但不保证杀死芽抱。

(3)间歇蒸汽灭菌法：是利用反复多次的流通蒸汽杀死细菌所有

繁殖体和芽胞的一种灭菌法。本法适用于耐热物品，也适用于不耐热

的含糖、牛奶等培养基。

(4)高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌法，

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灭菌的温度取决于蒸汽的压力。在一个大气压下,蒸汽的温度是100℃。

如果蒸汽被限制在密闭的容器里，随着压力的升高，蒸汽的温度也相

应的升高。在103.4kPa(l.05kg/cm2)蒸汽压力下，温度达到121.3℃,

维持15〜20分钟，可杀灭包括细菌芽胞在内的所有的微生物。此法

适用于高温和不怕潮湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术

器械、注射器、手术衣、敷料和橡皮手套等耐高温、耐湿热物品的消

毒。

(5)巴氏消毒法：常用于牛奶和酒类的消毒。此法可杀死物品中

的病原菌或一般杂菌，而不严重破坏物品的质量。方法有两种：一种

是加热61.1〜62.8℃30分钟；另一种是71.7℃经15〜30秒，现广

泛采用后法。

消毒知识点一一其他物理杀菌方法

(一)辐射杀菌法1.紫外线日晒是一种有效的天然杀菌方法,

其杀菌作用主要是靠日光中的紫外线。将病人的被褥、衣服、书报等

放在日光下暴晒数小时，可达到消毒之目的。一般用于消毒的人工紫

外线是由低压水银蒸汽灯、紫外线灯产生的。由于紫外线穿透力较弱，

不能透过玻璃、纸张等物品，故只适用于空气和物品表面的消毒。紫

外线对人体皮肤和眼睛角膜有一定的损伤作用，使用紫外线灯照射时

应注意防护。紫外线的杀菌作用与其波长有关，通常波长为240〜

280nm者具有杀菌作用。其中以260nm最强。2.电离射线电

离射线具有较高的能量和穿透力，可直接或间接破坏微生物的核酸、

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蛋白质和酶系统，从而对其产生致死效应。用于消毒灭菌的电离射线

有X射线

（二）滤过除菌法滤过除菌是用特殊的器具将液体或空气中细

菌除去的方法。所用器具是含有微细小孔的滤菌器，通常大于孔径的

细菌不能通过，借以获得无菌液体或空气。主要用于不耐高温灭菌的

血清、毒素、抗生素、药液和空气等的除菌，除菌滤器一般不能除去

病毒、支原体和L型细菌。滤菌器的种类很多，目前常用的有蔡

氏滤菌器、玻璃滤菌器、薄膜滤菌器。

（三）超声波杀菌法超声波可以裂解多数的细菌，尤其是革兰阴

性菌更为敏感，但往往有残存者。目前，超声波主要用于粉碎细胞,

以提取细胞组份或制备抗原等。超声波裂解细菌的机制主要是它通过

水时发生的空（腔）化作用，在液体中造成压力改变。

（四）干燥与低温抑菌法有些细菌的繁殖体在空气中干燥时会

很快死亡，例如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、霍乱弧菌等，但有些细

菌的抗干燥力较强，如溶血性链球菌在尘埃中存活可达25天，结核

分枝杆菌在干燥的痰中可数月不死。芽胞的抵抗力更强，炭疽芽胞杆

菌的芽胞耐干燥可达20多年。干燥法常用于保存食物，浓盐或糖渍

食品可使细菌体内水分散失，造成生理性的干燥，细菌的生命活动停

止，防止食物变质。

低温可使细菌的新陈代谢减慢，常用做保存细菌菌种，当温度回

升至适宜范围的时候，又能恢复生长繁殖。为避免解冻时对细菌的损

伤，可在低温状态下真空抽去水分，此法称为冷冻真空干燥法。

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消毒知识点一一化学消毒法化学消毒法是利用化学药物杀死

或抑制病原微生物的方法。具有杀菌作用的化学药品称化学消毒剂;

用于抑制微生物生长繁殖的化学药品称防腐剂。化学消毒剂不仅对细

菌有毒害作用，对人体组织细胞也有损伤作用。因此，只能外用或用

于环境的消毒。

根据化学消毒剂的杀菌机制的不同，主要分为以下几类：

（1）促进菌体蛋白质变性或凝固，例如酚类（高浓度）、醇类、重金

属盐类（高浓度）、酸碱类、醛类；

（2）干扰细菌的酶系统和代谢，例如某些氧化剂、重金属盐类（低

浓度）与细菌的-SH基结合使有关酶失去活性；

（3）损伤细菌的细胞膜，例如酚类（低浓度）、表面活性剂、脂溶剂

等，能降低细菌表面张力并增加其通透性，胞外液体内渗，致使细菌

破裂。酚类：石炭酸、来苏、洗比泰等酚类化合物，低浓度时

破坏细菌细胞膜，使胞内容物漏出；高浓度时是菌体蛋白质凝固。

醇类：杀菌机制在于去除细菌胞膜中的脂类，并是菌体蛋白质变性。

乙醇最常用，浓度70%〜75%时杀菌力最强，高浓度因能使菌体表面

蛋白质迅速凝固，杀菌力反而降低。重金属盐类：高浓度时与带

阴性电荷的菌体蛋白质结合，使之发生变性或沉淀，也可以与细菌酶

蛋白的-SH基结合，使其丧失酶活性。氧化剂：常用的有过氧化

氢、过氧乙酸、高锌酸钾与卤素等。杀菌机制依靠其氧化能力。过氧

乙酸为强氧化剂，对细菌的繁殖体和芽胞、真菌、病毒等都具有杀灭

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作用，应用广泛，但易分解并具有刺激性和腐蚀性，不适用于金属器

具的消毒。用于消毒的卤素有碘和氯两类，碘多用于皮肤的消毒，氯

多用于水的消毒。氯化合物有漂白粉、次氯酸钙、次氯酸钠等。表

面活性剂：常用于消毒的表面活性剂有新洁尔灭。烷化剂：杀菌

机制在于对细菌蛋白质和核酸的烷化作用，杀菌谱广，杀菌力强。常

用的有甲醛、环氧乙烷和戊二醛等。缺点是有些对人体有毒性，并且

有些烷化剂可能有致癌作用。

消毒知识点一一影响消毒灭菌的效果因素

1.消毒剂的性质、浓度与作用时间消毒剂在一定浓度下，对

细菌的作用时间越长，消毒效果越好。

2.微生物的种类与数量同一消毒剂对不同微生物的杀菌效果

不同，一般的消毒剂对结核分枝杆菌的作用要比其他细菌繁殖体作

用差；70%乙醇能杀死一般细菌繁殖体，但不能杀灭细菌的芽胞,

必需根据消毒对象选择合适的消毒剂。此外，微生物的数量越大,

所需要的消毒的时间就越长。

3.温度温度升高可以提高消毒效果。

4.酸碱度消毒剂的杀菌作用受酸碱度的影响，例如戊二醛本

省呈中性，其水溶液呈弱酸性，不具有杀灭芽胞的作用。

5.有机物环境中有机物的存在可影响消毒的效果。

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细菌检验基本技术：芽胞染色、荚膜染色及鞭毛染色

1.芽胞染色用着色力强的染色剂孔雀绿在加热条件下染

色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽抱内，进入菌体的染料经

水洗后被脱色，而进入芽胞一经着色则很难被水洗脱色。当用复

染剂染色后，芽胞仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽胞囊被染成

复染剂的颜色，使芽胞和菌体更容易区分。芽胞染色的操

作步骤：制成菌悬液一孔雀绿染色1分钟一将试管水浴加

热15〜20分钟一用接种环取加热染色菌液制成涂片一干燥一

固定f水洗脱色一蕃红花或稀释石炭酸复红复染1〜2分钟一水

洗一晾干一油镜观察。

2.荚膜染色由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通

常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色,

从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%

以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。在荚膜染

色方法中，以负染色法和湿墨水法较为常用，其中湿墨水法较简

便，并且适用于各种有荚膜的细菌。

3.鞭毛染色细菌的鞭毛极细，直径一般为10〜20nm,只

有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在

普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原

理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭

毛直径加粗，然后再进行染色。常用镀银法染色。

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在显微镜下，主要观察菌落结构，表面特征和菌落边缘的

形态等。例如炭疽芽胞杆菌菌落边缘呈现大量卷曲的纤丝状纹理,

称为狮鬃样菌落；鼠疫菌落表面呈现粗糙的颗粒状突起，在血琼

脂平板上生长的菌落边缘带有“花边”；支原体的菌落呈现“荷包

蛋”状等。

生活饮用水水质微生物检测样品采集及处理知识点一一水样

的采集与保存

一、水样的采集

1.对容器的要求容器及瓶塞、瓶盖应能经受灭菌的温度，并

且在这个温度下不释放或产生任何能抑制生物活动或导致死亡或

促进生长的化学物质。玻璃或聚丙烯塑料容器用自来水和洗涤剂

洗涤，然后用自来水彻底冲洗。用硝酸溶液(1+1)浸泡，再用自

来水，蒸储水洗净。为了除去余氯，在灭菌前向容器里加

入硫代硫酸钠以还原余氯［每125ml水样加0.1ml硫代硫酸钠

(100g/L)］。

2.容器灭菌热力灭菌是最可靠而普遍应用的方法。热力灭菌

分干热和高压蒸汽灭菌两类。聚丙烯瓶只能用高压蒸汽灭菌，玻

璃瓶可用两种方法灭菌。干热灭菌之后，玻璃容器是干燥的，便

于保存和应用；高压蒸汽灭菌之后，应自灭菌器中取出放在烤箱

内烤干，干热灭菌所需温度较高、时间较长。高压蒸汽灭菌法要

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求121C15分钟，即可杀死芽胞。干热灭菌法杀死芽胞需160℃〜

180℃＞维持2小时。

3.为了除去余氯，在灭菌前向容器里加入硫代硫酸钠以还原

余氯［每125ml水样加0.1ml硫代硫酸钠(100g/L)］。

4.采集自来水时应开启水龙头，适当放水数分钟后再取样。

二、水样的保存方法

4℃保存，4小时内进行检验。

医疗机构污水和污泥样品的采集和处理知识点一一医疗机构污泥的

采样和样品处理

所采集的样品应具有代表性，制成约500g的表层和中层的平均

混合样品，置于无菌容器中带回实验室。

污水样品采集后应按检验要求尽快检验，如不能及时检验，应将

样品放置冰箱内保存，并应在6小时内检验。

(-)检测粪大肠菌值时样品的采集及处理

称取采集的污泥样品100g,溶解于100ml无菌生理盐水中，充

分搅拌均匀，用无菌吸管吸取此混悬液2ml,加入发酵管中培养；并

将此混悬液依次稀释后，吸取不同浓度的稀释液按检验要求接种发酵

管培养。

(二)检测沙门菌和志贺菌时样品的采集和处理

称取采集的污泥样品30g,放入灭菌容器内，加入300ml无菌生

理盐水，充分搅拌混匀，制成1：10混悬液，用无菌吸管吸取此混悬

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液100ml加入相应增菌液中培养。

（三）检测结核杆菌时样品的采集和处理

称取采集的污泥样品10g,放入灭菌容器内，加入100ml无菌水

冲洗过滤（滤纸漏斗），再经玻璃漏斗G2（孔径10〜15P.m）和G4

（孔径3〜4p.m）抽滤，最后再经滤膜（孔径0.45-0.7触）抽滤。

取下滤膜，用4%硫酸3ml,充分振荡冲洗30分钟。取上述酸性溶液

各0.1ml,分别接种培养。

（四）检测蛔虫卵时样品的采集和处理

采集回的样品应立即检验,如不能立即检验应加入5~10ml3%

或5%甲醛或3%盐酸溶液，用平皿盖住广口瓶瓶口，然后放于冰箱

内，以防止微生物繁殖和蛔虫卵的发育。

医疗机构污水和污泥样品的采集和处理知识点一一医疗机构污水的

采样和样品处理

所采集的样品应具有代表性，采集后应立即登记，编写检验序号,

并按检验要求尽快检验，如不能及时检验，应将样品放置冰箱内保存,

并应在6小时内检验。

（-）检测总余氯指标时样品的采集及处理

1.所检测样品需在医疗机构污水最终排放口处用冲洗干净的玻

璃容器采集。

2.采样后应立即检测，避免强光、振荡及温热等因素的影

响。

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为避免污水中悬浮性固体对检测结果的影响，可用离心机离心分

离，弃去悬浮物沉淀。

3.被测样品的温度应在15℃〜20℃。如低于此温度，应先将盛

样品的玻璃容器放入温水中，使其温度升至要求温度后，再测定数

值。

（二）检测粪大肠菌群时样品的采集及处理

1.用采水器或其他无菌容器采取污水样1000ml,放入灭菌瓶内

（加氯消毒处理的污水应加1.5%硫代硫酸钠溶液5ml中和余

氯）。

2.采集好的水样应立即运往实验室检验，一般不宜超过2小时，

否则应在10℃下保存样品，但需在6小时内检测。

（三）检测沙门菌和志贺菌时样品的采集和处理

1.用采水器或其他无菌容器采取污水样1000ml,放入灭菌瓶内

（加氯消毒处理的污水应加1.5%硫代硫酸钠溶液5ml中和余

氯）。

2.采集好的水样应立即运往实验室检验，一般不宜超过2小时，

否则应在10℃下保存样品，但需在6小时内检测。

3.取污水250ml,用无菌纱布或脱脂棉进行初滤，然后用滤膜

进行抽滤，将初滤后的纱布或脱脂棉和滤膜，放入相应的增菌液中进

行增菌培养。

（四）检测结核杆菌时样品的采集和处理

1.用采水器或其他无菌容器采取污水样1000ml。放入灭菌瓶内

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（加氯消毒处理的污水应加1.5%硫代硫酸钠溶液5ml中和余

氯）。

2.采集好的水样应立即运往实验室检验，一般不宜超过2小时，

否则应在10℃下保存样品，但需在6小时内检测。

3.根据检验条件，可选用滤膜集菌法和离心集菌法进行集菌，

然后进行接种和培养。

（1）滤膜集菌法：采用经煮沸消毒的醋酸纤维膜（孔径0.3〜

0.7触）和特制的金属滤器，抽滤500ml污水，根据悬浮物的多少，

一份水样要更换数张滤膜，将同一份水样的滤膜集中于小烧杯中，用

4%硫酸溶液反复冲洗，静置30分钟，收集洗液于离心管中，3000

转/分，离心30分钟，弃去上清液。沉淀物中加1ml灭菌生理盐水

混合均匀后，供接种用。

（2）离心集菌法：将水样500raL分装于50ml或200ml灭菌离心

管中，3000转/分，离心30分钟，同一份水样的沉淀物集中于试管

中，加等量4%硫酸处理30分钟，供接种用。如体积过大，再次离

心浓缩后接种。化妆品微生物检测样品采集及处理知识点一一样品

的采集及注意事项1.所采集的样品，应具有代表性，一般视

每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分

别从2个包装单位以上的样品中共取10g或10ml。包装量小于20g

的样品，采样量可以适当增加，其总量应大于16go2.供检

验样品，应严格保持原有的包装状态。进口产品应为市售包装。容器

不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。3.接到

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样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不

能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。

4.若只有1个样品而同时需作多种分析，如细菌、毒理、化学等，

应先作微生物检验，再将剩余样品作其他分析。5.在检验过

程中，从打开包装到全部检验操作结束，均需防止微生物的再污染和

扩散，所用采样用具、器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌

室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。

化妆品微生物检测样品采集及处理知识点一一供检样品的制备

（­）液体样品1.水溶性的液体样品，可量取10ml加到90ml

灭菌生理盐水中，如样品少于10mL仍按10倍稀释法进行。如为5ml

则加到45m灭菌生理盐水中，混匀后，制成1：10检液。2.油

性液体样品，取样品10ml,先加5ml灭菌液状石蜡混匀，再加10ml

灭菌的吐温-80,在40〜44℃水浴中振荡混合10分钟，加入灭菌的

生理盐水75ml（在40℃〜44c水浴中预温），在40℃〜44c水浴中

乳化，制成1：10的悬液。

（二）膏、霜、乳剂半固体状样品1.亲水性的样品。称取10g,

加到装有玻璃珠及90ml灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀。

静置15分钟。用其上清液作为1：10检液。2.疏水性样品,

称取10g,放到灭菌的研钵中，加10ml灭菌液状石蜡，研磨成黏稠

状，再加入10ml灭菌吐温80,研磨待溶解后。加70ml灭菌生理盐

水，在40℃〜44c水浴中充分混合，制成1：10检液。

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（三）固体样品称取10g,加到90ml灭菌生理盐水中，充分

振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1：10检液。

如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等.可称10g样品加入

90ml灭菌生理盐水，均质1〜2分钟；疏水性膏、霜及眉笔、唇膏等，

称10g样品，加10ml灭菌液状石蜡，10ml灭菌吐温-80,70ml灭菌

生理盐水，均质3〜5分钟。

公共场所样品采集方法及处理知识点一一空气微生物样品采集及处

理

（一）撞击法

1.选择有代表性的位置设置采样点。将采样器消毒，按仪器使

用说明进行采样。

2.样品采完后，将带菌营养琼脂平板置36℃±1℃恒温箱中，

培养48小时，计数菌落数，并根据采样器的流量和采样时间，换算

成每立方米空气中的菌落数。以cfu/m3报告结果。

3.选择撞击式空气微生物采样器的基本要求

（1）对空气中细菌捕获率达95%。

（2）操作简单，携带方便，性能稳定，便于消毒。

（二）自然沉降法

1.设置采样点时，应根据现场的大小，选择有代表性的位置作

为空气细菌检测的采样点。通常设置5个采样点，即室内墙角对角线

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交点为1个采样点，该交点与四墙角连线的中点为另外4个采样点。

采样高度为1.2〜1.5m。采样点应远离墙壁1m以上，并避开空调、

门窗等空气流通处。

2.将营养琼脂平板置于采样点处，打开平皿盖，暴露5分钟，

盖上平皿盖，翻转平板，置36℃±1℃恒温箱中，培养48小时。

3.计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落

数。以cfu/皿报告结果。

（一）细菌总数测定

1.随机抽取清洗消毒后准备使用的茶具。

2.用灭菌生理盐水湿润棉拭子，在茶具内、外缘，涂抹50cm2,

即1〜1.5cm高处一圈（口唇接触处）。用灭菌剪刀剪去棉签手接触的

部位，将棉拭子放人10ml生理盐水内，4小时内送检。

3.将放有棉拭子的试管充分振摇。