格氏乳杆菌益生菌抗过敏佑治儿童支气管哮喘的疗效分析

抗过敏益生菌格氏乳杆菌〔L.gasseriA5〕对于气喘合并过敏性鼻炎儿童的影响〔康敏元益生菌〕RandomizedPlacebo-ControlledTrialofLactobacillusonAsthmaticChildrenWithAllergicRhinits.出处：PediatricPulmonology；2010摘要：回忆过去的文献指出，食用益生菌可以有效的治疗或改善婴幼儿过敏性皮肤炎的情形，但是益生菌在过敏性呼吸道疾病的角色依然有争议性。为了确认其成效，本试验选择同时患有气喘及过敏性鼻炎的学童为对象，每天补充益生菌L.gasseriA5持续八周，来探讨是否具有改善临床病症及调节免疫的功能。针对6-12岁患有气喘及过敏性鼻炎的学龄儿童，随机双盲试验分为两组，补充益生菌L.gasseriA5组(49人)与抚慰剂组(51人)，试验期两个月。试验期间由医师诊断评估肺部功能，以及气喘与过敏性鼻炎的改善情形，严重者在试验期间参加服用药物。每日评估受试者早、晚纪录：测量尖峰呼气流速、气喘与过敏性鼻炎发生次数。在免疫评估方面，那么分析患者食用益生菌前与后之总量IgE的浓度与PBMC细胞分泌各类细胞激素的量。试验结果显示，相较于抚慰剂组，食用益生菌组患者其肺部功能与尖峰呼气流速(PEFR)都有显着的提升，以及气喘与过敏性鼻炎等临床病症都有降低的情形。结论：补充益生菌L.gasseriA5，对于患有呼吸道过敏性疾病(如气喘或过敏性鼻炎)的学童，具有临床改善的效果。关键词：益生菌；临床试验；过敏性鼻炎；哮喘前言过敏性疾病，如过敏性湿疹，荨麻疹，常年性过敏性鼻炎〔AR〕，成为在开展中国家以及以开发国家最常见过敏性疾病。其中一个解释为这些疾病的发生率增加在于良好被称为“卫生假说＂，它假设，在过敏性疾病的增加反映了在儿童时期感染减少。益生菌是活的生物体，能预防以及治疗过敏性疾病，主要是靠通过以及平衡肠道的生态系统。婴儿肠道菌群的不同取决于之后过敏性疾病的开展，服用益生菌对婴儿无危险性已经证明，并能预防过敏性湿疹。临床试验还说明，暴露于微生物通过胃肠道有利免疫功能。特别乳酸菌被认为是诱发Th1细胞反响和改善过敏性疾病。口服热处理L.casei被发现能抑制小鼠血清中IgE的产生。此外，热处理L.plantarumL-137腹腔注射对热蛋白过敏的小鼠，可以抑制IgE产生。口服裂解EnterococcusfaecalisFK-23，能减少由花粉引起的是酸性球数量。在人类中，口服抗过敏乳酸菌菌种组合物康敏元益生菌降低了儿童异位性湿疹的危险。因此，补充益生菌对于胃肠功能紊乱或相关过敏疾病，如：过敏性湿疹与食物过敏的影响是相当可观的。相比之下，只有少数的研究探讨了影响益生菌对过敏性呼吸道疾病，如鼻黏膜炎和哮喘。但它已被证明L.paracasei可以提高青少年的生活质量与减低常年性鼻炎〔AR〕。研究了长期饮用益生菌的乳酸菌奶，并建议可能是有益的呼吸道。另一项最新报告指出，益生菌补充剂可以保护婴儿接受育儿对发作的腹泻疾病和发烧，但不是针对呼吸系统疾病。由于只有少数临床试验，信息缺乏是现有的关于意义乳酸菌在过敏性疾病，特别是在呼吸道过敏。因此，我们进行这项随机，双盲，抚慰剂对照的临床试验，以探讨L.gasseriPM-A0005〔康敏元益生菌〕的补充对患有哮喘及过敏性鼻炎的学童的临床病症和免疫学上的影响。本创造涉及新的乳酸菌菌株，及含一种或多种所述菌株的组合物，其中所述菌株具有现有技术中未知的可用于增进抗过敏的能力，且该组合物为食品或药物组合物形式。还公开了筛选测定乳酸菌菌株的方法，以及通过增进Th1型免疫反响来调控因过敏而反响过度的Th2型免疫反响的方法。益生菌组合物：唾液乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌，通过刺激肠道壁上的树突状细胞上的受体并结合，激活和活化细胞内的转译蛋白移至核内而释放大量细胞激素，通过促进白介素质12〔IL-12〕和干扰素γ的分泌增加，可有效改善过敏病症，调控Th1型免疫反响而抑制免疫球蛋白IgE，改善Th2型免疫反响过度的过敏现象的方法。技术领域本创造涉及应用在食品或医药中的抗过敏乳酸菌菌株组合物，及其在提高抗过敏能力中的用途。产品名称康敏元益生菌冲剂〔抗过敏乳酸菌〕专利号：200710128018X专利抗过敏益生菌菌株抗过敏益生菌〔唾液乳杆菌LactobacillussalivariusPM-A0006、格氏乳杆菌LactobacillusgasseriPM-A0005、约氏乳杆菌LactobacillusjohnsoniiPM-A0009、副干酪乳杆菌LactobacillusparacaseiPM-A0001、罗伊氏乳杆菌LactobacillusreuteriPM-A0059〕

辅配方：木寡糖(Woodoligosaccharides)、低聚果糖(Oligosaccharide)菌株保藏采用了具有增强抗过敏能力的、二00七年四月六日保藏于中国典型培养物保藏中心的专利抗过敏益生菌有：唾液乳杆菌〔Lactobacillussalivarius)PM-A0006菌株，保藏号M207040；格氏乳杆菌〔Lactobacillusgasseri)PM-A0005菌株，保藏号M207039；约氏乳杆菌〔Lactobacillusjohnsonii)PM-A0009菌株，保藏号M207039；抗过敏作用可广义包括通过促进白介素〔IL-12〕或干扰素调控Th1型免疫反响而抑制免疫球蛋白IgE，改善Th2型免疫反响过度的抗过敏免疫现象的方法。许多文献指出增加辅助型T细胞1的细胞激素包括白介素〔IL-12〕、干扰素的分泌增加，可以有效改善过敏病症，进一步的研究也指出抗过敏的乳酸菌菌株和树突状细胞上Toll样受体结合，活化细胞内的转译蛋白移至核内而释放大量细胞激素，属于先天免疫的一个环节，因此这些特定的抗过敏益生菌菌种借由其细胞壁多糖类物质如肽聚糖、脂多糖、多糖等，经先天免疫系统，确实能活化T细胞的发育。中国典型培养物保藏中心保藏的这三株乳酸菌具有抗过敏的能力，包括对异位性皮炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、食物过敏及过敏性哮喘的病症有减缓及治疗的功能。过敏性疾病，例如过敏性湿疹、荨麻疹、反复发作的过敏性鼻炎及过敏性哮喘，在台湾及其它兴旺国家中已成为严重的社会问题，导致过敏性疾病流行程度的上升是有原因的，众所皆知的卫生学假说为：婴幼儿接触免疫刺激病源体的时机愈少，愈容易引发过敏相关疾病〔Strachan,1989).过敏性疾病发生时，人体内的免疫反响会使Th1细胞数量下降，连续产生多种细胞激素促使免疫反响朝向Th2途径，形成体液免疫反响，例如IgE的产生及嗜酸性粒细胞过多等〔Romagnani,1994;Holt,1995)0-12岁儿童使用康敏元抗过敏平安性：

唾液乳杆菌〔LactobacillussalivariusPM—A0006〕格氏乳杆菌〔LactobacillusgasseriPM—A0005〕来自于健康新生儿之消化道中别离纯化，属人体原生菌种，为东宇专利菌株。产品是首家通过台湾“卫生署”[调节过敏体质]健康食品评估方法中的平安性检测，过敏性疾病或过敏体质人群〔包括：孕妇、婴幼儿、哺乳期妇女、中青年等〕均可放心服用。

耐胃酸耐胆盐试验：

检测五株抗过敏益生菌菌株：唾液乳杆菌PM-A0006菌株、格氏乳杆菌PM-A0005菌株、约氏乳杆菌PM-A0009菌株试验结果显示，调节过敏的抗过敏益生菌的本创造保藏菌株在培养基活化后，用酸性缓冲溶液及胆盐处理菌株，PM-A0006,PM-A0009菌数并不受胃酸胆碱改变影响而急剧下降，PM-A0005不受胃酸影响，证明这五株抗过敏益生菌菌株可以通过人体消化系统严格环境的考验。

定殖性：

经实验结果显示，康敏元益生菌冲剂中的五株益生菌属“强烈附着”，表示具有极高的定殖性，能附着肠道且增殖，均为人体外乡菌株。成效应用过敏疾病发生时，人体内的免疫反响会使Th1细胞数量下降，连续产生多种细胞激素促使免疫反响朝向Th2途径，形成体液免疫反响，例如IgE的产生及嗜酸红细胞过多等。人体临床实验成效证实：1.有助于减少血清中特异性IgE抗体之生成，迅速缓解过敏反响；2.有助于促进脾脏细胞IFN-γ的分泌量，诱导正确的免疫应答；3.有助于减少过敏反响相关细胞激素IL-5的分泌量减少过敏复发；4.有助于提升脾脏细胞增生能力，诱导TH1型免疫，调整过敏体质。IgE变化量补充康敏元加强型抗敏益生菌使过敏患者血清中的IgE浓度显著下降，且刺激免疫细胞IFN-γ分泌量上升，减少人体受过敏原的刺激，证实能够调整过敏反响免疫系统的作用。降低发炎介质趋化激素也叫免疫细胞激素分泌，这一发炎介质在人体发炎后或过敏发生后会大量分泌，因此也被视为重要的发炎与过敏反响指标，补充康敏元加强型抗敏益生菌其血液中的发炎介质分泌显著降低，最大程度的反响在呼吸道可缓解气喘及皮肤黏膜过敏反响，具有调整过敏体质的能力。降低肺呼吸阻力康敏元加强型益生菌对于哮喘合并过敏性鼻炎确实有改善效果，尤其在夜间更能增加呼吸道畅通，且随着服用时间增加而效果更好，大大提升过敏患者的生活质量不再影响到隔日的工作与学习。改善TH1与TH2细胞比值补充康敏元加强型抗敏益生菌后有助于减少过敏反响相关细胞激素IL-4、IL-5以及减少IFN-α与IL-13的分泌量，可直接降低Th2细胞的活性；其次，可刺激脾脏细胞增加细胞激素IL-10、IL-12与IFN-γ干扰素的分泌，使T细胞免疫反响趋向Th1路径，发挥着免疫调节，调整过敏体质，改善过敏病症的重要作用。材料与方法受试条件这项研究的受试者是患有哮喘至少持续一年有轻度或重度病史的儿童(年龄6~12岁)并伴随有过敏性鼻炎的病症。所有的受试者吉他们的监护人均详细研读本研究的相关资料，并签署受试者同意书，并确实答复相关的问卷，以调查哮喘及过敏性鼻炎的病史。本研究乃由台湾国立成功大学附设医院人体试验委员会同意。而哮喘诊断的标准是基于过去六个月的病例，或经由支气管扩张试验，1秒中增加12%FEV1，呈阳性反响。过敏性鼻炎的诊断依据为六个征兆或病症(咽痒，打喷嚏，流鼻涕，鼻痒和眼睛，鼻腔阻塞)存在一个或多个为期4天以上。患者曾接受口服或是皮下注射类固醇连续超过15天，吸入性皮质类固醇剂量超过每天1000μg，或是β2-agonists每天些受超过四次，或是唤友其它呼吸道系统疾病、心血管疾病，或是先天遗传疾病等贝蟹为试验排除的条件。试验设计本试验在国立成功大学附设医院儿科部进行双盲，随机，对照抚慰剂的方式进行哮喘及过敏的研究，研究时间自2006年10月至2007年3月。参与者首先评估了2周〔基线，v0〕，再进行了评估，以确定其资格。此外，受试者每日对病症进行纪录，并每日两次测定极端呼吸峰值(PEFR)，之后书面通知受试者及监护人开始启动试验(图1)。在此期间，对受试者进行过敏病症全面评估，包含皮肤试验最常见的8种过敏原，计算其血液中嗜酸性球、总IgE。皮肤测试为阳性被定义为在场的≥1阳性反响的一个风雨同舟直径≥5毫米。血清总IgE水平是侦测采用固相免疫分析法。而所有120名患者中，屋尘螨〔87例，72.5％、粉尘螨〔81例，67.5％、蟑螂〔46例，38.3％〕、狗〔27例，22.5％〕，真菌溷合物〔38例，占31.6％〕，花粉溷合组〔n=18，15.0％〕，虾〔24例，20.0％〕，牛奶〔8例〕。所有符合条件的患者随机分配到控制组及益生菌治疗的对照组(图1)。对照组每日服用含有L.gasseriPM-A0005(2X109cells/capsule)两次；而控制组的胶囊那么是内含奶粉的抚慰剂，服用剂量也是一天两次，两组皆连续服用八周。Fig.1.此研究方式为益生菌临床测试。A：为实验组织图、B：为实验流程图。临床测试时间为2006年10月~2007年3月结束。乳酸杆菌及抚慰剂胶囊的制备抗过敏乳酸菌康敏元所含L.gasseriA5自健康人类肠道中别离出来，并高密度培养后，冻干做成菌粉，于4℃组藏。此菌能在常温下存放三个月，不会影响菌种活性，并经由生物技术中心进行过急性经口毒性试验研究，小鼠最高剂量为5000毫克/公斤，经口服14天，无任何副作用。评估参与试验的医生从试验开始的2个星期的间隔期〔V1-V3〕到8周的干预期〔V4〕及第10周〔V5〕的最后评估期全程参与。此期间医生负责进行患者临床病症的评估，血液的采集以及益生菌的投予；病患那么纪录病症的评分以及药物。使用儿童哮喘控制测试〔CACT作业者集团〕的中文版进行了评估，每个研究工程。日纪录卡患者的父母提供了日记卡，他们被要求记录哮喘分数，药物消费，PEFR在整个研究治疗期间。的日间和夜间哮喘病症记录在4个等级〔0=没有病症，1=轻度病症，2=中度病症，3=严重病症〕。日夜间的分数总和为哮喘总分。在评估过程中，整个研究期间所有患者均接受同样的控制者，根据个人哮喘的病症，如果需要的话使用药物：吸入β2-agonists，以及口服皮质类固醇〔5毫克〕所有药物的施用均被确实记录。每天的PEFR测定，在白天和晚上，每一次测量三次，取最好的的一次是用在后续计算。肺功能试验医生测量FVC、FEV1，用力呼气容积在肺活量范围25-75％〔FEF25-75〕，在V0、V3、V5期间进行PEFR的评估。检测细胞激素的变化量在将病患随机分配之前，先收集外围血液单核细胞〔PBMC〕，在浓度为1×106细胞/毫升；之后分配到服用益生菌的对照组再收集一次(n=41)。与植物血凝素〔PHA;10微克/毫升〕，屋尘螨〔尘蹒，1微克/毫升〕，或尘蹒〔1微克/毫升〕培养，再与L.gasseriA5〔细菌/细胞比例，1:1〕共培养72小时，使用酵素免疫吸附试验(ELISA)来分析TNF-、IFN-、IL-10、IL-12p40和IL-13这些细胞激素。统计分析使用双因子变异数分析方法来分析两组内的固定因素。成对样本T检定来分析每个分析条件基准间的变化，以P值小于0.05判定为有显着差异。科克伦-曼特尔-Haenszel法统计分类变量是用来比拟两组间的差异。结果：研究范围从120例儿科门诊的患者中选出105位，并随机分成接受益生菌(49人)及抚慰剂(56人)治疗的两个组别。图1B显示整个试验的流程。表1那么是受试者收桉的标准。两组个组别在统计学，临床和功能变量上均无显着的差异。此外，哮喘和AR的严重程度上，两组也无差异。血清总IgE，各种过敏原的敏感性，PEFR，肺功能测试结果是两群体之间评估的基准；儿童哮喘控制测试〔CACT〕前先进行超过四周的哮喘控制，两组之间并没有显着不同。两组患中度持续性哮喘的受试者中，过敏性鼻炎的患者占多数。有6例病患有一个或多个试验控制的偏差，治疗方法上那么无差异。所有可用的数据都计算在内。肺功能的变化表2显示了在在每个临床病人访问中进行肺活量、肺功能参数变化的检测。相对于控制组的病人中，接受益生菌治疗的对照组病人，其FEV1、FVC、FEV1/FVC(%)和MEF25-75到试验后期有显着的增进。此外，支气管扩张试验中，两组之间也有显着性的差异(p<0.001)；这也支持了益生菌可以减缓哮喘儿童支气管的敏感性。PEFR的变化在每次门诊中，病人的病例日记卡纪录日间和夜间PEFR得分以及哮喘病症。图2显示由病患日夜间PEFR的变化临床纪录(图2A)及纪录卡评分的变异(图2B)的比拟。接受益生菌治疗的病人，其PEFR在观察期间均有显着的增加，控制组那么无显着差异。白天的观察纪录中，两组之间相比拟无显着的差异；但是晚上的纪录中，在刚开始实验的两周以及试验结束前有显着的差异。过敏性鼻炎以及哮喘的变化检视患有过敏性鼻炎的气喘儿童的气喘评分以及病例日记卡，我们发现控制组与对照组在白天及夜间均有稳定的改善直到试验结束。虽然两组间在哮喘及过敏性鼻炎的改善上无显着的差异，但益生菌治疗的对照组在白天，其病症从试验开始(Vo)至结束(V4)有显着的改善；而控制组那么无。而两组在夜间那么均无显着改善上的差异(图3b)。在哮喘控制试验中严重哮喘及过敏性鼻炎的变化情形两位医生(J.R.L和C.S.H.)随机分配到不同的患者群，来做严重哮喘及过敏性鼻炎的评估诊断。在图4A所显示，无论是益生菌治疗的对照组和抚慰剂的控制组，均观察到严重过敏性鼻炎持续性的改善；相同的结果也出现在严重哮喘的观察(图4B)。在小儿气喘控制试验(CACT)的结果发现，在试验结束前对照组跟控制组的分数均有增加，但以益生菌治疗的对照组，从试验开始到试验结束，有显着性的差异(p<0.05)。血清中总IgE及细胞激素变化虽然对照组与控制组病患血清中总IgE在试验结束前均侦测到有减少，两组无显着差异。图5显示从试验初期〔Ｖ０〕至试验末期〔Ｖ５〕，血液单核球(PBMC)经由ＰＨＡ或是Ｄｅｒｐ的刺激，在培养基上清液中所侦测到的发炎性的细胞激素TNF-a，以及Th2细胞激素群中的IL-10和IL-13。我们观察到相较于控制组，服用益生菌L.gasseri连续８周的对照组，其ＴＮＦ－ａ以及ＩＬ－１３有显着的减少〔p<0.05〕。虽然IL-10的侦测量，控制组低于对照组，但两者在统计上无显着上的差异。为了延续我们发现的现象，我们侦测了Ｔｈ１的细胞激素ＩＦＮ－ｒ以及ＩＬ－１２，我们发现对照组在试验末期的细胞激素浓度明显低于试验初期；而控制组那么无显着的差异。我们也测试了其它Ｔｈ２的细胞激素，例如：ＩＬ－４、ＩＬ－５和ＴＧＦ－Ｂ，然而产生的浓度过低而无法侦测到。讨论众所皆知益生菌能够平衡肠道中的微生物平衡，有利于免疫以及预防过敏性湿疹在婴儿身上发生。然而此类微生物对于改善上呼吸道的过敏性疾病尚存许多疑点，需要更多临床试验的左证。在本试验中，连续八周给予学童L.gasseri服用，相较于接受抚慰剂的控制组学童，其对照组的学童肺功能明显改善，哮喘以及过敏性鼻炎的分数均下降。更重要的是，由全球医生的评估认为给予病患补充乳酸菌无重大或是轻微的副作用发生。在此之前，仅少数的临床研究过敏性鼻炎的成人和儿童口服益生菌的影响。而我们的研究显示，益生菌的补充能改善患有呼吸道过敏疾病的儿童在白天哮喘以及呼吸道的功能。虽然造成影响的机制尚不清楚。但至少有三个支持益生菌况过敏的相关假说。益生菌引起调节T淋巴细胞(Treg)，例如：Th3、Th1和自然调节性T细胞(Treg)分泌Th1佐剂，而调节改变Th2细胞激素的状态，而减少发炎反响；益生菌也会在肠胃道的黏膜上和一些抗原呈现细胞，例如：巨噬细胞和树状细胞(DCs)，进而到达全身性免疫调节作用。在这个试验中，我们发现益生菌治疗的前后，其血液中总IgE和过敏程度无显着的提高,而且精益生菌治疗后，Th1类细胞激素，如：IFN-r及IL-12的浓度均未显着升高(图6)。这些结果似乎排除了在过敏性体质的儿童身上益生菌会提升Th1细胞功能去抗衡Th2细胞。另一方面，由诱导型T细胞而产生的IL-10，经益生菌的疗程后减少(图5)。此外，我们还发现CD4+CD25highFoxp3+