临床生化检验方法的选择和评价

临床生化检验方法的选择和评价临床生化检验方法的选择和评价，是临床生化检验质量控制的重要基础工作。当建立一个新的方法，或引进新的方法、都应对它们的技术性能作出评价，以便科学的选择和应用。5/8/20241临床生化检验方法的选择和评价5/8/20242临床生化检验方法的选择和评价一检验方法和标准品的分级（一）方法的分级

临床生化检验方法根据其准确度与精密度的不同可以分为决定性方法、参考方法、常规方法等三级。

5/8/20243临床生化检验方法的选择和评价1．决定性方法（definitivemethod）是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法。用于发展及评价参考方法和一级标准品。

5/8/20244临床生化检验方法的选择和评价2．参考方法（referencemethod）是指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。这类方法在条件许可的实验室中应经常使用。用于评价常规方法和试剂盒，鉴定二级标准品。5/8/20245临床生化检验方法的选择和评价

3．常规方法（routinemethod）指性能指标符合临床或其他目的的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，而且经济实用。这类方法经有关学术组织认可后可称为推荐方法（recommendedmethod），推荐方法应具有足够的实验证据5/8/20246临床生化检验方法的选择和评价三级方法的相互关系常规方法参考方法决定性方法准确度增加应用范围增加5/8/20247临床生化检验方法的选择和评价（二）标准品的分级国际标准化委员会将标准品（参考物）的定义为：一类具有一种或多种成分、且含量均匀确定的物质。

；被用于校正仪器或用于评价一种测定方法的物质，并将其分成三级。

5/8/20248临床生化检验方法的选择和评价（二）标准品的分级1．一级标准品（原级参考物，primaryreferencematerial

）是一种稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂质也已经定量，且有证书；用于校正决定性方法，评价及校正参考方法以及为二级标准品定值。5/8/20249临床生化检验方法的选择和评价2．二级标准品（次级参考物，secondaryreferencematerial

）包括用于常规分析的标准液。这类标准品可由实验室自已配制或为商品，它的示值必须用一级标准品和参考方法并由训练有素的，能熟练掌握参考方法的操作者确定；主要用于常规方法的评价或为控制物定值和常规测定的结果计算。5/8/202410临床生化检验方法的选择和评价3．校准品（calibrator）用二级标准品和常规方法测定得到校准品，用于常规测定中的标准4.控制物（controlmaterial）具有与检测过程相适应的特性，其成分及基质与检测样本相同或相似，且均匀、稳定。用于质量控制，控制患者样本的测定误差5/8/202411临床生化检验方法的选择和评价各级实验方法与参考物的相互关系决定性方法用途：评价参考方法及为一级参考物定值一级参考物用途：发展和评价参考方法，校正决定性方法和参考方法，产生二级参考物参考方法用途：为二级参考物及控制物定值，评价常规方法（标准化、偏差、干扰因素）

二级参考物用途：常规方法的工作标准及为控制物定值5/8/202412临床生化检验方法的选择和评价二常规方法选择的原则（一）适用性微量快速方法简便安全可靠成本低廉（二）可靠性较高精密度、准确度较好检测范围5/8/202413临床生化检验方法的选择和评价（二）方法选择的步骤（一）提出要求（二）获取资料（三）选定候选方法（四）候选方法的初步试验标准曲线的线性范围和重复性；重复试验——精密度；对比试验——准确度；5/8/202414临床生化检验方法的选择和评价第二节临床生化检验方法学评价方法学评价（evaluationofmethodology）通过实验途径测定分析方法的技术性能，并评价其是否能接受。

评价实验的过程就是对误差的测定。

一、方法学评价的意义和内容5/8/202415临床生化检验方法的选择和评价主要的方法技术性能指标：

准确度(accuracy)

灵敏度(sensitivity)

特异度(specificity)

分析测量范围(analyticalmeasurerange,AMR)评价实验的过程就是对误差的测定。

5/8/202416临床生化检验方法的选择和评价确定方法的质量目标选定及进行适当的揭示分析误差类型的实验收集试验数据，进行统计学分析判断方法的可接受性二、方法学评价的基本步骤5/8/202417临床生化检验方法的选择和评价三、误差的分类和表示1.系统误差（SE）定义：指测定值与真值存在的同一倾向的偏差。系统误差或正或负，即具有单向性，一般由恒定的因素引起，并在一定条件下多次测定中重复出现。5/8/202418临床生化检验方法的选择和评价三、误差的分类和表示2.系统误差分类恒定系统误差（CE）指测定值与真值之间存在恒定的误差，其大小与干扰物浓度相关，而与被测物浓度无关。比例系统误差（PE）误差大小与被测物浓度成正比。5/8/202419临床生化检验方法的选择和评价三、误差的分类和表示3.随机误差（RE）定义：多次重复测定某一物质时出现的误差，误差无一定的大小和方向，数据呈正态分布。5/8/202420临床生化检验方法的选择和评价误差类型示意图比较方法结果试验方法结果比例系统误差恒定系统误差随机误差5/8/202421临床生化检验方法的选择和评价揭示误差类型的实验

误差类别实验随机误差（RE）重复性比例误差（PE）回收恒定误差（CE）干扰系统误差（SE）方法对比总误差（TE）重复性和方法对比5/8/202422临床生化检验方法的选择和评价一、方法评价方案（一）精密度评价

1．目的要求反映精密度好坏的指标是变异系数CV，CV越小精密度越好，反之则差，故有人称其为不精密度。变异系数CV包括：批内、批间、日间和总CV，其中总CV最重要，它代表整个分析体系的可重复程度。

5/8/202423临床生化检验方法的选择和评价2．评价前的准备①对于评价对象和评价方案均应熟悉。②实验试剂应是同批次配制，或同一批号的商品试剂盒和参考物，仪器也应处于良好的工作状态③实验用标本一般选择2个（亦可更多），一个在正常范围或在医学决定水平附近，另一个为异常值，实验标本的介质应与临床标本一致。④先作一个初步的批内精密度测定，即一个标本重复测定20次，计算出均值，标准差和变异系数5/8/202424临床生化检验方法的选择和评价3．评价步骤用2个标本每天测定2次（2次测定间隔不得少于2小时），每次测定均作双份，共测定20天。每次测定至少做一个质控。

5/8/202425临床生化检验方法的选择和评价（二）准确度评价1．方法比较试验将试验方法（待评价或待验证的方法）与比较方法（参考方法或准确度已知的方法）进行比较，用于评价试验方法的恒定和比例系统误差。5/8/202426临床生化检验方法的选择和评价（二）准确度评价1．方法比较试验(1)要求比较方法应是参考方法或推荐方法，如该测定没有参考方法或推荐方法亦可用公认的常规方法。但须具备：①比较试验方法有更好的精密度。②干扰影响已知。③与试验方法使用相同的计算单位。5/8/202427临床生化检验方法的选择和评价(2)比较前准备①实验者应熟悉所用的仪器、试验方法、比较方法和评价方案。②实验标本应收集新鲜的正常和异常的临床标本，应有足够宽的浓度范围，各浓度应有合适的比例。如不能及时测定，标本应妥善保存并应在分析物的稳定期内测定。5/8/202428临床生化检验方法的选择和评价(3)方法比较步骤①样本数至少为40个标本，每个标本用2种方法分别作双份测定，如临床标本的量太少可将2份含量相近的标本混合。②每天测定8个标本，双份测定时第一次按顺序1，2……7，8，第二次8，7……2，1，共测试5天。5/8/202429临床生化检验方法的选择和评价结果分析(1)作图分析1)差异分析2)对比分析––差异图:Y轴:试验方法与比较方法之差X轴:比较方法的测定值––对比图:Y轴:试验方法测定值X轴:比较方法的测定值5/8/202430临床生化检验方法的选择和评价差异分析图对比分析图比较方法结果零线差异（试验－比较）比较方法结果测定方法结果5/8/202431临床生化检验方法的选择和评价2．回收试验所谓回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。目的是测定比例系统误差，以衡量候选方法的准确度。

（1）方法：将被分析的纯品标准液加入样品中，成为分析样品，原样品加入同量的无分析物的溶液作基础样品，然后用实验方法分析，两者测定结果的差值为回收量。

5/8/202432临床生化检验方法的选择和评价

（2）回收率计算：理想的回收率为100%，如某法测血钙的回收率为95.7%，有4.3%的比例误差，表明一个含钙真值为2.5mmol/l的标本,若用该方法测定,约为2.39mmol/l(2.5×95.79%)，误差为0.11mmol/L(2.5×4.3%)。5/8/202433临床生化检验方法的选择和评价（3）注意事项：①准确吸量,因为被分析物的理论值是根据加入标准液体积及原样品的体积计算所得，吸量稍有不准，就会影响结果；②样品中加入标准液后,总的浓度必须在方法的分析范围内，一般须加入高、中、低不同浓度做回收试验，计算平均回收率；③加入标准液后，最好使实验样品的被测浓度达到医学决定浓度；④加入标准液的体积一般在10%以内。若稀释过大，误差将发生改变，甚至消失。5/8/202434临床生化检验方法的选择和评价（三）线性评价1．目的要求线性范围是分析方法的一个重要技术指标，它能判断对某一分析方法测得的浓度或活性值与设定的浓度或活性值之间的比例关系的范围。常规方法应具有较宽的分析范围，一般应覆盖临床可能出现的高值。

5/8/202435临床生化检验方法的选择和评价2．评价前准备①熟悉仪器、评价方案和试剂。②评价标本的介质应与实际测定的标本相一致，理想的标本是病人的低值或高值标本，这往往不易收集到，亦可用病人的混合标本加入分析物作为高值标本，用正常人标本作为低值标本。③浓度范围应以分析项目的线性要求为准。5/8/202436临床生化检验方法的选择和评价线性评价应有5个不同浓度，可选择低值和高值标本各一个，低值标本为1号，高值标本为5号，二者3：1混匀为2号，等份混匀为3号，1：3混匀为4号，2-4号标本的浓度按下式计算：

标本浓度=（C1V1+C5V5）/（V1+V5）C：浓度，V：体积。5/8/202437临床生化检验方法的选择和评价（四）干扰试验1．目的要求判断评价方法给出的结果是否受非分析物影响及影响程度。①干扰是指在测定某分析物的浓度或活性时，受另一非分析物影响而导致测定结果增高（正干扰）或降低（负干扰）。②干扰物质可分为内源性（标本中存在的）和外源性（外界污染的）两类。5/8/202438临床生化检验方法的选择和评价③干扰的机理，可有物理作用、化学作用以及非特异反应等。④干扰可能是造成误差的一个重要原因，如果干扰物是恒定的将引起恒定误差，如干扰物随病理生理因素影响，将引起随机误差。因此，实验室应了解各种测定方法的干扰情况

5/8/202439临床生化检验方法的选择和评价2．试验前准备①应做的主要干扰物为病人标本中常常出现的黄疸，脂血和溶血；某些药物如维生素C等；实验常用的抗凝剂，防腐剂和稳定剂。②质量保证，不存在系统误差；批内精密度在可接受范围内；应不存在前后结果的交叉污染；实验过程有质控监督。

5/8/202440临床生化检验方法的选择和评价3．干扰试验方法

(1)"配对差异"试验:即将不同浓度的干扰物加入到实验标本中，然后分别测定加与不加干扰物的标本，比较二者有无偏差，并了解干扰物浓度与偏差程度的关系。

(2)用病人标本作偏差分析:5/8/202441临床生化检验方法的选择和评价第三节方法学评价实验（举例）一、批内重复性实验重复性试验依据时间间隔可分为批内、天内、天间三种重复性试验。方法学评价重复性试验应由实验者作批内(或天内)及天间重复性试验。

5/8/202442临床生化检验方法的选择和评价【目的与要求】掌握方法学重复性实验的设计原理和基本方法及统计分析；熟悉重复性实验的注意事项和评价标准。客观评价GOD-POD法测血糖随机误差的大小。

5/8/202443临床生化检验方法的选择和评价【原理】批内重复性试验是指在相同条件下对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价GOD-POD法测血糖随机误差的大小。

【操作步骤】

将血清标本用GOD-POD法作5轮，每轮4次血糖测定，即可获得20个测定数据。

5/8/202444临床生化检验方法的选择和评价【结果计算】1．检验20次测定数据中的离群值（用Grubbs检验准则，检验离群值）2．按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均数()、标准差(S)和变异系数(CV%)。

5/8/202445临床生化检验方法的选择和评价5/8/202446临床生化检验方法的选择和评价5/8/202447临床生化检验方法的选择和评价【评价标准】

如试验求得的血清葡萄糖GOD-POD测定法的CV值＜WHO对中等实验室提出的OCV(±3%)标准，即表明实验条件的控制达到最佳条件，试验结果可按OCV%报告。作为方法探讨实验，其变异系数应该＜OCV标准。

5/8/202448临床生化检验方法的选择和评价【注意事项】1.血糖的医学决定水平值为2.8、6.7、8.9mmol/L。分析物浓度应选择医学决定水平值才更具价值。

2.为了缩小测定值的离散程度，操作中必须准确加入标准液及标本量，并严格控制反应时间，准确读数。

3．计算批内标准差(Sw)时不可误用连续测定精密度的统计学公式。否则会使Sw的估计值明显偏低。

5/8/202449临床生化检验方法的选择和评价【思考题】

1.重复性试验依据时间间隔可分为几种？哪种最符合临床实际？

2.重复性试验结果反映了什么误差？

3.方法评价的批内重复性试验在标本浓度、样本数、测试方法及统计方法方面有什么要求？5/8/202450临床生化检验方法的选择和评价二、回收试验回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。用于测定实验方法的比例系统误差。这种误差常随分析物的浓度增加而增加，常因样品中其它物质与分析物竞争分析试剂并与之发生反应而引起。

5/8/202451临床生化检验方法的选择和评价【目的与要求】掌握方法学回收实验的设计原理和基本方法及统计分析；熟悉回收实验的注意事项和评价标准。客观评价GOD-POD法测血糖比例系统误差的大小。

5/8/202452临床生化检验方法的选择和评价【原理】回收试验是发现分析方法比例系统误差的有效评价方法。通过测定GOD-POD法测血糖的回收率，能较确切地判断该分析方法比例系统误差的有无或大小，可以对方法的准确性作出可靠评价。

5/8/202453临床生化检验方法的选择和评价【操作步骤】1．样品制备

基础样品：血清0.9ml+0.1ml生理盐水。

回收样品Ⅰ：血清0.9ml＋0.01ml80mmol/L葡萄糖标准液＋0.09ml生理盐水。

回收样品Ⅱ：血清0.9ml＋0.06ml80mmol/L葡萄糖标准液＋0.04ml生理盐水。

回收样品Ⅲ：血清0.9ml＋0.09ml80mmol/L葡萄糖标准液＋0.01生理盐水。

2．血糖浓度测定按GOD-POD法测定各制备样品的血糖浓度，每份样品作双份检测，结果取平均值。5/8/202454临床生化检验方法的选择和评价【结果计算】5/8/202455临床生化检验方法的选择和评价5/8/202456临床生化检验方法的选择和评价【注意事项】1．分析物浓度应选择医学决定水平，血糖测定的医学决定水为平2.8、6.7、8.9mmol/L。

2．纯标准品溶液的加入体积不得超过血清样品的10%，避免将血清稀释过度，引起误差的改变或消失。

3．准确加量是最主要的技术关键。

5/8/202457临床生化检验方法的选择和评价【结果判断】一般检验方法要求回收率在95%-105%之间，最为理想的回收率应是100%。

【思考题】

1.什么叫回收试验？在回收试验的样品制备中应注意哪些事项？

2.回收试验反映的是方法的哪种误差？

3.回收率怎样计算？

5/8/202458临床生化检验方法的选择和评价三、干扰试验干扰试验用于测定某物质加到样品中产生的系统误差，干扰物浓度一定时，产生的误差是恒定系统误差，误差的实际大小随干扰物的浓度而异。干扰试验既用于检测某方法的特异性，也用于检测干扰物质对方法的干扰作用，以评价分析方法的准确性。

5/8/202459临床生化检验方法的选择和评价【目的与要求】掌握方法学干扰实验的设计原理和基本方法及统计分析；熟悉干扰实验的注意事项和评价标准。客观评价GOD-POD法测血糖恒定系统误差的大小。

5/8/202460临床生化检验方法的选择和评价【原理】干扰试验是测定特异性和干扰二者引起的误差。在具体方法学评价实验中，首先要确定被试可疑物质是否引起误差；若能引起误差，再进一步探讨其误差的来源是因方法特异性差还是干扰，若加入的物质本身和分析试剂反应并产生读数，这是特异性差，若加入物质并不与分析试剂反应，但它改变了分析物和分析试剂间的反应，这是干扰。本实验选用尿酸做GOD-POD法测血糖的干扰试验，尿酸可以和GOD反应生成的H2O2发生反应，使部分H2O2不能参与第二步POD的偶联反应，从而降低显色强度，产生负的测定误差。因此，尿酸对该反应有干扰，但不是尿酸被测定。5/8/202461临床生化检验方法的选择和评价【操作步骤】1．样品制备

基础样品：血清0.9ml＋蒸馏水0.1ml。

干扰样品Ⅰ：血清0.9ml＋9.0mmol/L尿酸标准液0.05ml+蒸馏水0.05ml。

干扰样品Ⅱ：血清0.9ml＋9.0mmol/L尿酸标准液0.1ml。

尿酸样品：蒸馏水0.9ml＋9.0mmol/L尿酸标准液0.1ml。

2．血糖值测定取各样品按GOD-POD法操作。

5/8/202462临床生化检验方法的选择和评价【结果计算】5/8/202463临床生化检验方法的选择和评价5/8/202464临床生化检验方法的选择和评价【注意事项】1．可疑干扰物浓度加入可疑干扰物的浓度应明显高于通常所见浓度的上限，有可能时应达到病理标本的最高值，尿酸升高的变动范围在0.42-0.9mmol/L之间。

2．凡可疑干扰物都应做，这里仅是举例示范。

3．无论是方法特异性差或是受干扰，都影响到测定结果的正确性，影响的程度与分析物的浓度无关，但与非分析物的量有关，所以产生的误差都是恒定系统误差，常以偏差Bias作为统计量。Bias指所有测定值系统性的偏离真值，表示系统误差的大小。在干扰试验中，偏差等于干扰样品测定值与基础样品测定值之差。

其它注意事项与回收试验相同。5/8/202465临床生化检验方法的选择和评价【结果判断】Bias＜允许误差(EA)的临界值，表明由干扰物引起的偏差对临床诊断和治疗不产生不良影响，可被接受。血糖2.8、6.7、8.9mmol/L时的EA为0.56mmol/L。

5/8/202466临床生化检验方法的选择和评价【思考题】1.请阐述干扰和特异的概念，怎样用实验来加以区分？

2.干扰试验的样品制备与回收试验的样品制备有何相同点和不同点？

3.干扰试验反映的是何种误差？干扰率怎样计算？5/8/202467临床生化检验方法的选择和评价四、方法比较试验方法比较试验是用两种方法同时测定一批标本计算出两种方法间测定结果的差值，以此来估计被评价方法在实际测定病人标本时可能引入的总系统误差的水平。

5/8/202468临床生化检验方法的选择和评价【目的与要求】掌握方法比较实验的设计原理和基本方法及统计分析；熟悉方法比较实验的注意事项和评价标准。客观评价GOD-POD法测血糖系统误差的大小。

5/8/202469临床生化检验方法的选择和评价【原理】方法比较试验是将候选方法与准确度已知的方法(如参考方法)作对比分析，以评价候选方法的准确度，是考核候选方法是否可被采用的重要试验。方法比较试验是用于检测候选方法系统误差的大小包括恒定误差和比例误差，如对适当的数据进行分析，也可以提供误差的性质。本实验以HK法测血糖的参考方法作对比来评价GOD-POD法测定血糖的总系统误差。5/8/202470临床生化检验方法的选择和评价【数据处理】1．将对比试验数据作散点图，图中以x轴代表对比方法的测定值，y轴代表被评价方法的测定数据，在方格纸上作图应散布于整个测定范围之内。

散点图能够提供初步的印象。如果所有测定值的对应点在直角坐标图中大致呈45°角的直线分布，提示被评价方法与对比方法的测定结果之间存在密切的相关关系；若呈明显的曲线分布，虽然在统计学上可按照非线性资料处理，但在这种情况下，候选方法被采用的可能性极小。5/8/202471临床生化检验方法的选择和评价2．如果x、y之间呈直线关系,即可用经典的直线回归分析法作统计处理，其结果可以显示候选方法的测定结果有无系统误差存在，这种误差可分为三类，即恒定系统误差、比例系统误差和(或)兼有两种误差。

5/8/202472临床生化检验方法的选择和评价在评价一个候选方法时，最理想的情况是回归直线通过零点，呈45°角分布，这时a＝0，b(x/y比值)＝1.0，表明既无恒定误差，又无比例误差存在。但x和y都会有随机误差，a和b只是估计值，是会有所波动的。如果a≠0，b的数值稍偏离1.0，但只要这种偏离程度比较小(可以忽略不计)，据经验判断这一候选方法可以被接受，就能适用于临床检验的常规分析。假如要对回归系数b作出较严密的统计判断，就需要进一步作回归系数的显著性检验。5/8/202473临床生化检验方法的选择和评价3．根据计算出的回归方程的a、b值，可以计算出候选方法系统误差(SE)的大小，并与不同医学决定水平(Xc)的允许误差(EA)作比较，对被评价方法的系统误差的可接受性作出判断。

5/8/202474临床生化检验方法的选择和评价4．作相关分析在方法比较试验中，相关系数(r)可作为被评价方法可否被接受的一项统计学指标。

相关系数(r)按下列公式计算：

5/8/202475临床生化检验方法的选择和评价【结果判断】1.回归方程计算出候选方法系统误差(SE)的大小，与不同医学决定水平(Xc)的允许误差(EA)作比较，对被评价方法的系统误差的可接受性作出判断。

SE的可接受性判断指标为：

2.试验方法（Y）与比较方法（X）相关性，r≥0.975或r2≥0.95说明二法的相关良好。5/8/202476临床生化检验方法的选择和评价【注意事项】1．选择试验样品一般作40-100例，包括常规工作中可能遇到的整个分析范围，选择合适的样品分析范围比增加样品的数目更为重要。

2．试验方法一般每个样品用两种方法各测一次，最好每个样品用两种方法各测定两次，不是平行测定，而是分两批进行，最好在4h内进行。

3．对比方法对比方法的选择十分重要，一般应选参考方法或决定性方法，这样方法间的任何分析误差均可归于被评价的候选方法。5/8/202477临床生化检验方法的选择和评价【思考题】

1.方法比较试验反映的是何种误差？比较方法为何要用参考方法？

2.方法比较试验的样本有何具体要求？

3.方法比较试验后尚需做哪些统计分析？这些统计结果分别说明方法的哪些性能？

4.做方法比较试验应注意哪些事项？

5/8/202478临床生化检验方法的选择和评价分离纯化小麦胚芽中酸性磷酸酶【原理】酸性磷酸酶(ACP)在自然界中广泛分布于植物种子、霉菌、以及动物肝脏和前列腺中。植物种子中的ACP在发芽时含量最丰富。本实验选用新鲜小麦胚芽作为原料来分离和纯化ACP。ACP能溶解于稀缓冲液和水中；溶于35%饱和度的硫酸铵溶液中，在57%饱和度的硫酸铵溶液中可沉淀析出；在中性及高温条件下不稳定，在70℃时相对稳定；pH小于6.5时稳定性增加，枸橼酸和乙酸可增加ACP酶溶液的稳定性；Mg2+、Mn2+为ACP激活剂，而Cu2+、Hg2+、