食品理化检验食品中转基因成分的检验

食品理化检验食品中转基因成分的检验“转基因”是指利用分子生物学手段将外源性基因转移到某种特定生物体中，使其生物性状或机能发生部分改变。转基因食品就是以转基因生物体直接作为食品或以其为原料加工生产的食品。转基因食品（GMF）的定义GeneticallyModifiedFoods第2页,共71页，2024年2月25日，星期天转基因技术的基本步骤

1.辨认能体现所期望特征的目的基因代码，才可能从具有该基因的天然活体中分离。2.DNA的分离。利用特殊的剪切酶。在特定位点上将供体的DNA分裂成含有目的基因的片段，然后分离、纯化。第3页,共71页，2024年2月25日，星期天3.利用载体将目的基因转移，而其中典型的载体是由细菌或病毒的DNA环型片段组成的4.目的基因的扩大培养及嫁入寄主细胞5.选择性的标记基因第4页,共71页，2024年2月25日，星期天6.为控制基因表达而必需的DNA序列（启动子、终止子的DNA序列必须结合其中）7.筛选和繁殖。经过转基因的寄主细胞必须经过严格筛选、测试才能用于食品生产。第5页,共71页，2024年2月25日，星期天目前上市的转基因食品

抗除草剂基因大豆

抗虫基因玉米

抗病毒基因油菜

抗病毒土豆

抗软化基因西红柿

转抗虫基因棉花第6页,共71页，2024年2月25日，星期天BT（苏云金芽胞杆菌）玉米苏云金芽胞杆菌产生毒害剂的基因除害剂基因与质粒结合

BT玉米含转基因的幼苗植物细胞与重组基因

重组基因在细菌中

细菌共同培养培养扩增细菌

基因重组第7页,共71页，2024年2月25日，星期天质粒细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，存在于细胞质中能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。第8页,共71页，2024年2月25日，星期天转基因食品的优势增加作物单位面积产量降低生产成本增强作物抗虫害、抗病毒能力提高农产品的耐贮性，延长保鲜期摆脱季节、气候的影响，四季低成本供应食品的品质和营养价值提高富含

—胡萝卜素的转基因“金色水稻”第9页,共71页，2024年2月25日，星期天转基因食品安全性争论赞同的人：认为该项技术及其产品能大大提高人们的生活水平怀疑的人：认为它走得“太快”了，在现实生活中可能会产生副作用目前对转基因植物的安全性评价主要集中在两个方面，一个是环境安全性，另一个是食品安全性。第10页,共71页，2024年2月25日，星期天英国“普兹台事件”：1998年，英国罗伊特研究所普兹台教授说他的实验证明，幼鼠食用转基因土豆会使内脏和免疫系统受损。转基因安全事件第11页,共71页，2024年2月25日，星期天美国的“斑蝶事件”：1999年美国康乃尔大学副教授约翰·罗西在《自然》上发表文章说，一种转基因玉米可产生杀死害虫的花粉，而身为益虫的一种美州大蝴蝶食用了这种转基因玉米花粉后有44％死亡。转基因安全事件第12页,共71页，2024年2月25日，星期天过敏反应问题：对于一种食物过敏的人有时还会对一种以前他们不过敏的食物产生过敏比如：科学家将玉米的某一段基因加入到核桃、小麦和贝类动物的基因中，蛋白质也随基因加了进去，那么，以前吃玉米过敏的人就可能对这些核桃、小麦和贝类食品过敏。营养问题：科学家们认为外来基因会以一种人们目前还不甚了解的方式破坏食物中的营养成分。第13页,共71页，2024年2月25日，星期天对抗生素的抵抗作用：当科学家把一个外来基因加入到植物或细菌中去，这个基因会与别的基因连接在一起。人们在服用了这种改良食物后，产生抗药性对环境的威胁：不在改良范围之内的其它物种有可能成为改良物种的受害者第14页,共71页，2024年2月25日，星期天技术特征利用载体系统（细菌质粒、病毒的环形基因）的重组DNA技术利用物理、化学和生物学等方法将重组DNA导入有机体的技术转基因食品的特征显微注射、基因枪等农杆菌介导转化法第15页,共71页，2024年2月25日，星期天转基因食品的特征产品特征具有食品或食品添加剂的特征产品的基因组构成发生了改变，并存在外源DNA（基因重组体构成元件）产品中存在外源DNA表达产物及其生物活性产品具有基因工程所设计的性状和功能第16页,共71页，2024年2月25日，星期天基因重组体构成元件载体目的基因（定义P184）病毒衣壳蛋白基因病毒卫星RNA病毒复制酶基因苏云金杆菌杀虫蛋白基因蛋白酶抑制剂基因植物凝集素基因等第17页,共71页，2024年2月25日，星期天调控元件启动子（花椰菜花叶病毒的35S启动子等）终止子（花椰菜花叶病毒的35S终止子等）标记基因和报告基因

标记基因：已知效应的基因，能够使个体具备特定的特征并且通过生理学、形态学、生物化学或分子生物学检测能够发现其存在的基因。基因重组体构成元件第18页,共71页，2024年2月25日，星期天标记基因的作用是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用

重组DNA载体的重要标记，用来检验目的基因转化成功与否检测目的基因在细胞中的定位抗生素抗性基因、除草剂抗性基因第19页,共71页，2024年2月25日，星期天目的基因是需要表达的基因，标记基因是有一定特点的基因

标记基因与目的基因的区别大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与目的基因组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。然后，选择含有青霉素的培养基来培养受体细胞，能够在培养基中存活下来的受体细胞就可以认为是成功的导入了外源DNA，标记基因就起作用了

第20页,共71页，2024年2月25日，星期天报告基因与标记基因的异同作用与标记基因相同标记基因的缺陷：检测慢（蛋白酶作用需要时间）依赖外界筛选压力（如抗生素、除草剂）而报告基因则是指其编码产物能够被快速测定、且不依赖于外界压力的一类基因。第21页,共71页，2024年2月25日，星期天理想的报告基因具备如下要求受体细胞中不存在相应内源等位基因的活性它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性

常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、荧光素酶基因（luc）、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）等第22页,共71页，2024年2月25日，星期天氯霉素乙酰基转移酶(CAT)：可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测其活性，也可进行蛋白质印迹(Westernblotting)和免疫组织化学分析第23页,共71页，2024年2月25日，星期天荧光素酶催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶。用荧光比色计即可检测酶活性。第24页,共71页，2024年2月25日，星期天β半乳糖苷酶由大肠杆菌基因编码，可催化半乳糖苷水解最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶活性第25页,共71页，2024年2月25日，星期天GMF成分检测外源蛋白质的检测外源基因的检测蛋白质印迹法蛋白芯片试纸条法“侧流”型免疫测定酶联免疫吸附试验PCRSouthern杂交基因芯片定性PCR实时定量荧光PCR法定量竞争性QC-PCR法PCR-ELISA法定量PCR反转录RT-PCR法其它技术第26页,共71页，2024年2月25日，星期天优势:

除蛋白芯片法外。快速,具有一定的灵敏度,也能进行半定量尤其是试纸条法,不需特殊仪器设备,适用于现场检验或初筛外源蛋白质检测方法第27页,共71页，2024年2月25日，星期天局限性:1.由于抗原抗体反应的专一性,每种转基因产品都要开发和建立专门的检测试剂和方法,而转基因产品种类繁多,要建立所有转基因产品的蛋白质检测法工作量很大。

2.只能定性和半定量检测外源蛋白质检测方法第28页,共71页，2024年2月25日，星期天

3.对于加工过的转基因食品,其蛋白质很容易被破坏,从而影响检测结果的准确性。

4.有些插入基因根本不表达或表达量很低，无法检测。外源蛋白质检测方法第29页,共71页，2024年2月25日，星期天载体目的基因调控元件（启动子、终止子、增强子）标记基因报告基因PCR检测外源DNA外源DNA第30页,共71页，2024年2月25日，星期天根据检测目的和检测结果特异性水平的不同，外源DNA的检测方法有：初筛试验：对通用元件的检测局限性：只能鉴别产品是否含有基因重组体，不能鉴定转基因产品的种类基因特异性试验能检测不同的目的基因、标记基因或报告基因，区别不同的植物品系PCR检测外源DNA第31页,共71页，2024年2月25日，星期天组成结构特异性试验检测目的基因与调控基因连接处的核苷酸序列区段区别某类植物的各种转基因株系插入位点构成特异性试验区别同一插入序列在基因组中的不同重组状态第32页,共71页，2024年2月25日，星期天聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。步骤

DNA的提取

DNA纯化设计并合成引物探针制备

PCR检测PCR检测外源DNA定性、定量第33页,共71页，2024年2月25日，星期天第34页,共71页，2024年2月25日，星期天植物细胞中DNA主要存在于细胞核内细胞质中的DNA主要存在于线粒体和叶绿体中细胞内各种DNA总称为总DNA进行转基因检测需要提取的是总DNA95%以上的DNA是与蛋白质结合的DNA的提取和纯化第35页,共71页，2024年2月25日，星期天基本原理是：从样品中释放DNA，去除其他杂质：①去污剂或有机试剂破坏细胞膜，释放游离DNA②蛋白质：蛋白酶或有机试剂去除；③多糖（如果胶、纤维素、淀粉等），以相应的酶或有机溶剂（CTAB/氯仿等）去除④脂类：酶或溶剂（如正己烷）去除⑤RNA：RNA酶去除⑥盐类（提取/裂解缓冲液或沉淀液的残留物）DNA的提取和纯化第36页,共71页，2024年2月25日，星期天沉淀法：乙醇和异丙醇等沉淀DNA固体介质吸附法：采用阴离子交换树脂、硅石或玻璃珠、硅藻土、膜等吸附DNA。DNA的提取和纯化方法植物总DNA的提取方法苯酚－氯仿法CTAB法SDS法二氧化硅法胍盐第37页,共71页，2024年2月25日，星期天DNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂CTAB溶解细胞膜，使蛋白质变性，与DNA形成复合物CTAB与DNA的复合物在高盐溶液中可溶，而蛋白质、多糖、多酚溶解性降低会沉淀CTAB法提取和纯化DNA原理十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)第38页,共71页，2024年2月25日，星期天CTAB与DNA的复合物低盐溶液中沉淀；而多糖、色素等不沉淀使沉淀物溶于高盐溶液，加入乙醇和异丙醇沉淀DNACTAB法提取和纯化DNA原理两个关键试剂：CTAB缓冲液——高盐溶液CTAB沉淀液——低盐溶液适合糖类和酚类含量较高的样品第39页,共71页，2024年2月25日，星期天

加入CTAB缓冲液加入氯仿反复颠倒试管离心取上清加入CTAB沉淀液离心取沉淀CTAB法提取和纯化DNA步骤第40页,共71页，2024年2月25日，星期天CTAB法提取和纯化DNA步骤加入高浓度NaCl溶液加入氯仿离心、取上清液加入异丙醇离心、取沉淀反复加入乙醇离心、取沉淀自然晾干去离子水或TE缓冲液溶解第41页,共71页，2024年2月25日，星期天提纯DNA质量的检测电泳原理：

DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。其迁移速度与相对分子质量的对数成反比。第42页,共71页，2024年2月25日，星期天260nm、280nm处测定吸光度

A260nm/A280nm在1.6~1.9：纯度高，可用A260nm/A280nm＜1.6：蛋白质或溶剂污染A260nm/A280nm＞1.9：RNA污染提纯DNA纯度的检测用RNA酶或苯酚－氯仿法进一步纯化第43页,共71页，2024年2月25日，星期天PCR技术的原理

PCR技术类似于DNA的天然复制过程。在适宜的条件下，人工合成寡核苷酸引物与模板DNA单链互补结合，在DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸(dNTP)为底物，不断延伸，使被扩增的基因片断以几何倍数增长。定性PCR的检测方法第44页,共71页，2024年2月25日，星期天变性－退火－延伸模板DNA的变性：加热至93-95℃，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA离解成为单链；模板DNA与引物的退火（复性）：温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCR过程的基本步骤第45页,共71页，2024年2月25日，星期天③引物的延伸：温度升至72℃左右，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，合成一条与模板DNA单链互补链。

重复变性－退火－延伸三个过程，目的基因被扩增放大几百万倍。每个循环需2-4min，整个PCR反应需要2-3h。第46页,共71页，2024年2月25日，星期天PCR原理示意图PCR引物与模板结合示意图

第47页,共71页，2024年2月25日，星期天模板、引物、酶、dNTP和Mg2+是PCR反应的五个重要因素，决定了PCR反应的成败。模板DNA：抽提的DNA溶液中含有氯仿、乙醇等有机溶剂、Taq酶抑制剂和杂蛋白等会影响PCR扩增，产生假阴性。PCR反应的主要因素第48页,共71页，2024年2月25日，星期天②引物：PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度，引物的设计和合成对PCR结果起着决定性作用。引物的设计方法：参考文献报道常用的效果最佳的引物采用计算机软件，例如PermierPrimer、Oligo等。在软件的基础上辅以人工分析，以达到最佳效果。第49页,共71页，2024年2月25日，星期天③TaqDNA聚合酶：是一种耐热的DNA聚合酶，由于发现于水生栖热菌（Thermusaquaticus）内，故命名为Taq聚合酶，也称为TaqDNA聚合酶其活力的高低决定了PCR扩增是否成功最适温度很高（79℃），使引物在高温下进行退火和延伸，增加了反应的特异性和扩增效率。第50页,共71页，2024年2月25日，星期天④dNTP三磷酸脱氧核糖核苷酸的缩写N代表A、G、C、T等中的一种，是它们的混合物在PCR中起原料作用浓度过低会降低PCR产物的产量；浓度过高会导致错配DNA聚合酶水解下来两个磷酸后把脱氧单磷酸核苷酸连在DNA模板链上第51页,共71页，2024年2月25日，星期天⑤Mg2+浓度

Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，直接影响着酶的活性和可靠性Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少DNA模板、引物和dNTP可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度第52页,共71页，2024年2月25日，星期天假阳性、假阴性引起假阳性现象的原因极微量的目标DNA污染都有可能出现扩增条带。引物设计不合适也会出现假阳性现象PCR检测常见问题第53页,共71页，2024年2月25日，星期天引起假阴性现象的原因模板中含有杂蛋白质，Taq酶抑制剂，酚、氯仿、乙醇等有机溶剂

DNA量不足

Taq酶失活、酶活降低或量不足引物设计不合理变性温度低，时间短退火温度不适合等等PCR检测常见问题第54页,共71页，2024年2月25日，星期天非特异性扩增：引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体涂抹带、片状带、地毯样带（Smear现象）。原因：酶过多或酶质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低等。PCR检测常见问题第55页,共71页，2024年2月25日，星期天

DNA的提取纯化设置阳性对照、阴性对照确定待测目标序列引物设计

PCR反应体系的构建

PCR扩增电泳及结果分析转基因成分的PCR检测一般程序第56页,共71页，2024年2月25日，星期天原理通过PCR扩增和凝胶电泳分离可得到大小为170bp的DNA片段，包括花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子和玉米基因组的DNA序列。PCR定性检测抗虫转基因玉米MON810品系第57页,共71页，2024年2月25日，星期天设计引物正向引物：玉米基因，5ˊ-TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG-3ˊ反向引物：CaMV35S启动子（GeneBank编号：V000141，J02048），5ˊ-TCCATCTTTGGGACCACTGTCG-3ˊ注释：GeneBank是美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库，汇集并注释了所有公开的核酸序列。第58页,共71页，2024年2月25日，星期天PCR反应体系的构建试剂终浓度加样体积/μl模板DNA10-50ng2水14.810×PCR缓冲液（不含MgCl2）1×2.5MgCl2溶液2mmol/L2.0dNTP溶液0.4mmol/L1.0正向引物0.5μmol/L1.25反向引物0.5μmol/L1.25Taq酶（5IU/ml）1IU0.2第59页,共71页，2024年2月25日，星期天PCR扩增预变性10min，95℃20s，95℃扩增40s，64℃40s，72℃循环数40最终延伸3min，72℃第60页,共71页，2024年2月25日，星期天电泳及结果分析方法：取PCR产物在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳，用紫外灯或凝胶成像系统观察并记录PCR产物电泳条带。结果：阴性：无电泳条带阳性：有电泳条带待测样品有电泳条带：含转基因成分无电泳条带：不含转基因成分170bpM1234

第61页,共71页，2024年2月25日，星期天原理特异性强、自动化程度高、不使用溴化乙锭、不污染环境等特点指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线（标准品）对未知模板进行定量分析的方法。使用的化学物质：荧光探针和荧光染料实时荧光定量PCR第62页,共71页，2024年2月25日，星期天TaqMan荧光探针PCR扩增时，加入一对引物，同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记了一个报告荧