重组DNA技术应用

重组DNA技术应用序列检测

病原菌感染检测传统方法：免疫反应斑点杂交与反转斑点杂交

引物标记多重PCR扩增病原菌群引物设计：独有的稳定区1.诊断工具

——序列检测第2页,共34页，2024年2月25日，星期天1.诊断工具

——比较序列分析比较序列分析：单核苷酸多态性（SNP）

SNP：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。

第3页,共34页，2024年2月25日，星期天基因的纯合或杂合第4页,共34页，2024年2月25日，星期天利用SNP进行已知遗传疾病的诊断利用SNP分析未知遗传疾病的原因建立人类SNP库，利用SNP芯片进行个性化诊断老年痴呆病对药物tacrine的反应

80％无ApoE4等位基因患者，有疗效

60％有ApoE4等位基因患者，恶化第5页,共34页，2024年2月25日，星期天×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析第6页,共34页，2024年2月25日，星期天+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析第7页,共34页，2024年2月25日，星期天1.诊断工具

——限制性片段长度多态性（RFLP)RFLP是根据不同个体基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同个体的DNA水平的差异（即多态性）NPANPA已出生的生病孩子PAPA未出生的孩子？为患病小孩的父母提供未来的产前诊断第8页,共34页，2024年2月25日，星期天由某些序列重复程度的不同引起的长度多态性变化主要与卫星DNA序列有关可以设计多位点探针，分析DNA图谱进行鉴定1.诊断工具——可变数目串联重复多态性（VNTR)1985年，AlecJeffrey发现非编码区的小卫星DNA串联重复序列可用于确定个体的特异性，他开发了一个能和多个小卫星序列位点互补探针，检测结果类似条形码，被称为DNA指纹

改进：多个单位点探针检测（样本量更少、有利于DNA指纹数据库的建立、统计学上更为简单）第9页,共34页，2024年2月25日，星期天多位点探针与单位点探针VNTR在司法上的应用第10页,共34页，2024年2月25日，星期天2.新药物的生物法生产

一般蛋白质产品必须具有绝对的真实性时（即生物加工的蛋白质产品和天然提取的产品完全一样），选择哺乳动物细胞培养。真实性意味着不仅所有的氨基酸要有正确的排列顺序，而且在培养细胞中的所有翻译后修饰过程要和在完整的动物体中的翻译后修饰过程相同。哺乳动物细胞生产的优点：提供尽可能类似于天然产物的产品，真实性最好另一个优点是大多数具有商业价值的蛋白质都很容易被细胞分泌出来细胞培养生长缓慢，培养基昂贵，蛋白质表达水平较低安全性问题：转化细胞的致癌可能性、病毒转基因动物和哺乳动物细胞培养2009年，FDA批准首个转基因动物生产药物ATryn上市第11页,共34页，2024年2月25日，星期天转基因植物和植物细胞培养成本优势不存在内源病毒或朊病毒的安全问题生产的放大很容易通过扩大种植面积来实现选定在植物中无菌的可食用部分生产蛋白质，这样不仅可以避免苛刻的纯化过程，还可以直接将食用部分作为治疗蛋白质口服通常表达水平非常低（<总可溶性蛋白的1％）N-连接糖基化是不完全的，以及缺乏一些其它哺乳动物的翻译后过程。需要花费大量时间来测试和生产足够的种子，研制生产周期不能令人满意很难对生长在地里的农作物进行环境控制，因此随着生产时间和生产地点的不同（即环境），产品的生产量（也可能包括质量）变化非常大。第12页,共34页，2024年2月25日，星期天3.基因治疗对患者细胞中的遗传信息进行修饰来治疗疾病的方法第13页,共34页，2024年2月25日，星期天第14页,共34页，2024年2月25日，星期天第15页,共34页，2024年2月25日，星期天

美国医学家W·F·安德森等人对腺苷脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩Desilva，A进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。

Desilva，A

，1999第16页,共34页，2024年2月25日，星期天4.重组疫苗失活毒株或活体减毒毒株（有一定危险性）重组亚单位疫苗（保真度差、无法有效刺激免疫反应）重组细菌疫苗（接种细菌）

以减毒细菌为宿主表达异源抗原，能够有效刺激免疫反应重组病毒疫苗（接种病毒）

以病毒为载体表达异源抗原，或破坏毒素基因植物可食用疫苗（通过转基因植物表达病毒或病菌抗原）DNA疫苗（在宿主中引入编码抗原的DNA分子）第17页,共34页，2024年2月25日，星期天鉴定毒性基因的技术启动子诱捕库体内展示技术（IVET）差异荧光诱导技术第18页,共34页，2024年2月25日，星期天5.蛋白质工程通过各种方法使蛋白质分子的结构发生某些改变，从而改变蛋白质的某些特性和功能的技术过程称为蛋白质工程提高活力activity增强稳定性stability降低或消除抗原性immunologicalproperty研究和了解分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响第19页,共34页，2024年2月25日，星期天氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。

现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（sitedirectedmutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（ProteinEngineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。氨基酸置换修饰第20页,共34页，2024年2月25日，星期天酶分子的定点突变1、基因序列分析2、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变5、酶基因克隆表达6、变异特性分析第21页,共34页，2024年2月25日，星期天酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。第22页,共34页，2024年2月25日，星期天定向进化蛋白质的合理设计(rationaldesign)

氨基酸序列比对、蛋白质三维构象、残基功能分析

蛋白质的定向进化(directedevolution)第23页,共34页，2024年2月25日，星期天体外定向进化的意义理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是体外定向进化的基本先决条件。所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。第24页,共34页，2024年2月25日，星期天定向进化的原理第25页,共34页，2024年2月25日，星期天DNAShufflingStemmer在1994年首先提出的一种体外分子定向进化方法同传统的分子进化方法相比，DNAShuffling可以更快地加速分子进化的进程、取得更好的进化效果通过定向进化方法改进酶的特性、甚至创造出新酶成为对代谢途径进行改造的一种非常有用的策略。第26页,共34页，2024年2月25日，星期天提高目的产物的产量

实例:Arnold等人通过定向进化改变了乙内酰脲酶对底物的对映体选择性（从D型变为L型），并使酶活力提高了5倍，这种进化后的酶和另外三种Met合成途径中的酶一起表达后大幅度提高了L-Met的合成速度。提高酶蛋白在各种极端物理或化学环境下的活力和稳定性，对不同来源的蛋白质的优良性状进行组合

实例:Ness等人通过对26种枯草杆菌蛋白酶基因的Shuffling

而在酶活力、热稳定性、溶剂稳定性等方面的特性取得了较大的进展实例:两种

-glycosidase基因的DNAShuffling定向进化的应用

—优化代谢途径第27页,共34页，2024年2月25日，星期天extremestabilityglucoseinhibitionlactosehydrolysislowerstabilitynoinhibitionlactosehydrolysisCelBPyrococcus(100oC)LacSSulfolobus(85oC)Geneshufflingoftwob-glycosidasesCelB-LacShybridSB20approachesCelBstabilitylesssubstrateinhibitionhighlactosehydrolysisGeneshuffling★★★★★★第28页,共34页，2024年2月25日，星期天Hybrids-improvedhydrolysisoflactoseandcellobiose乳糖

纤维二糖Geneshufflingoftwob-glycosidases第29页,共34页，2024年2月25日，星期天6.代谢工程代谢工程定义：利用DNA重组技术对特定的生化反应进行修饰或引入新的反应以定向改进产物的生成或细胞的性质。上述定义的基本特征是：通过分析确定要修饰的目标反应、或打算要新引入的特定生化反应。一旦目标被确定，那么就要应用已建立的分子生物学技术对相应的基因或酶进行扩增、抑制或缺失、或解除调控。为了达到上述目的，需要应用DNA重组技术。第30页,共34页，2024年2月25日，星期天定向改进：合理设计？如何对酶活进行设计，着重于“量”

随机诱变与定向筛选技术：

有利基因突变信息、有利突变的组合信息、途径结构与控制方面重要信息，着重于“质”

反向代谢工程（有利突变点在野生菌株中的重新组装）分子进化工程

基因或酶的人工定向进化:DNAShuffling

基因或酶分子的合理设计：计算机上的模拟

第31页,共34页，2024年2月2