聚合酶链式反应

14第五章聚合酶链反响及其相关技术PCR技术从Mullis20感性和简便快捷等特点而备受人们广泛应用PCR技术或由PCR不断消灭，使PCRPCR技术在体外快速特异地复制目的DNA序列，理论上能将极其微量的〔pgDNA〕目的基因在较短的时间内〔通常1-3h〕扩增到达纳克、微克甚至毫克级水平，使产物极易被检测。因此PCR技术目前已经成为人们猎取目标基因的最常用的方法之一，Mullis因其出色的奉献，于1993年获得了诺贝尔化学奖。聚合酶链式反响(polymerasechainreaction，PCR)是体外酶促扩增DNARNA的一种方法，它是一种不需要借助于分子克隆而可以在体外快速生殖、扩增DNA的技术,它与分子克隆molecularcloninDNA测序DNAsequencin〕一起构成了分子生物学的三大主流技术。在这三项技术中，PCR1983CetusKary.Mullis们能够在数小时内通过试管中的酶促反响将特定的DNA争论手段带来了革命性的变化。由于PCRPCR科学争论的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的进展。目前，一系列的PCR、分子进化争论、环境检测、法医鉴定等诸多领域。PCR聚合酶链式反响〔PCR〕是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延长的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从格外微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物〔见图5-。PCRDNA20DNA在降低温度复性时，引物分别与A，B链两端的互补序列配对结合。最终，在DNA催化下，以目的DNA片段为模板进展聚合反响。第一轮反响完毕后，目的DNA增加了一倍。合成的DNADNA2的指数增加。由于在PCRDNA活。后来从耐热菌中纯化得到一种TaqDNA聚合酶，能在较高的温度下(70～75℃)进展催化聚合。这样就不需要在每次循环时参加酶，而且可以获得质量更好的DNA片段，从而使PCR聚合酶链式反响操作过程Mullis最初建立的PCRDNA聚合酶I的Klenow片段催化复性引物的延长。由于该酶不耐热，在DNA求较高。1988Saiki〔Thermusaquaticus〕中提取到的耐热DNA〔TaqDNApolymerase〕引入了PCR技术。由于该TaqDNA热变性时不会被钝化，所以整个反响只需添加一次酶即可，此酶的觉察为如今通过PCR仪实现DNAPCR扩增靶DNA3⑴变性〔denaturation〕94℃并维持肯定时间，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为反响的模板。⑵退火〔annealing〕是将反响体系温度降低至特定的温度〔寡核苷酸引物的融点温度Tm值左右或以下分子较引物简单得多，加之引物量大大超过模板DNADNA时机很少。另外，两个引物在模板上结合的位置打算了扩增片段的长短。⑶延长〔elongation〕是将反响体系的温度升至72℃并维持肯定时间，使反响体系中已结合到模板DNA〔dNTP〕dNTP3DNA上述三个步骤作为PCRDNA模板，所以每循环一次，底物DNA的拷贝数增加一倍。因此，反响产物量以指数形式增长，一个分子的模板经过n2n25225个拷贝DNA3.4×107DNAPCR100％，并且扩增产物中还有局部PCR251×1063×106数。另外从图中可以看出，PCR3的特异性DNAPCR参与PCR反响的成分主要包括：模板核酸、一对寡核苷酸引物、催化依靠模板的DNA合成的耐热DNAM2，4(dNTP数、PCR1、模板用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。核酸模板来源广泛，可以从动植物细胞、培育的细胞、细菌、病毒、组织，病理样品，考古样品等中提取。当用RNAcDNAPCRDNARNA、DNA和线粒体DNA等。模板DNADNA〔如SDS、氯仿、乙醇等〕RNA)，以保证有较高的纯度。DNA模板中过多的RNARNADNA的杂交或RNARNA模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为PCR含靶序列的DNA模板5`3`3`5`第一次变性5`3`3`5`引物1 第一次退火引物25`3`3`5`第一次延长5`3`3`5`其次次变性、退火5`3`其次次延长3` 5`其次次延长5` 3`3` 5`第三次变性、退火、延长开头消灭靶片断〔其它不同长度的链未标出〕5-1聚合酶链式反响示意图应。除了上述的DNARNAPCR一般来说PCR的模板DNA，只要先溶细胞，经蛋白酶消化去除蛋白质，再用酚、氯仿抽提，经乙醇沉淀的模板即可应用。某些扩增试验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热，用蛋白质变性后的DNA溶液作模板。但在DNA溶液中，不能有影响扩增反响的物质存在，例如蛋白酶、核酸酶、结DNAEDTAMg2TaqDNA影响扩增效果，甚至使扩增失败。一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul100ng获得成功。2、引物引物是与靶DNA35”端特异性结合的寡核苷酸，是打算PCRDNA中的靶序列复性形成稳定的构造，才能保证其特异性。一般状况下，设计的引物长度介于15～30个核苷酸之间，3”端必需带有游离的－OH0.1~0.5μmol/L之间，过高或过低均不利于反响的正常进展。引物设计是打算PCR单链模板结合，并且与靶序列3’端侧翼碱基互补，从而限定了引物只能结合在所识别的链3’DAN5’3’3’大小及特定范围。PCRPCR16～30bpTaqDNA)G+C的含量一般为40％～603个以上的一样嘌呤3’3Gc，否则会使引物与核酸的GcPCR身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应互补，尤其是它们的3’端不应互补。一对引物之间不应多于47083’端是引发延长的点，因此不应错配。由于ATCG3A影响最大，因此，尽量避开在引物3’端第一位碱基是A。引物3’末端也不应是编码密码子的第三个碱基，以免由于密码子第3位简并性而影响扩增特异。引物5’端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，启动子序列，蛋白质结合DNA序列等。引物浓度一般要求在0．1～0．5pmol之间。浓度太高，简洁生成引物二聚体，或非特异性产物。引物Tm55～70℃范围。简并引物实际上是一类由多种寡核苷酸组成的混合物PCR扩增引物的核苷酸组成挨次是依据氨基酸挨次推想而来简并引物同样也可以用来检测一个的基因家族中的成员因。使用简并引物的PCR(hotstartmethod)能够有效地抑制错配现象。热起始法要求将反响混合物先加热到72℃，然后才参加TaqDNA聚合酶。经过这样的处理，增加了PCR扩增产物的特异性，所得到的靶DNAEB糖凝胶电泳中可以简洁地观看到，而且背景中的非靶序列的条带全消逝了。(nestedprimers)的策PCR扩增产物作为其次轮PCRDNA结合位点是处在头两个引物之低的，所以应用嵌套引物技术能够使靶DNA3(dNTP)dNTP为PCRdNTP是dATP，dCTP，dGTP，dTTPDNA聚合酶错配的机dNTP20-200μmol/L之增加，DNA聚合酶复制DNAdNTPdNTP储存液必需为pH7.02mmol／L，20℃环境下保存。4DNA聚合酶耐热DNA聚合酶是PCRDNAPCRDNA必在每次高温变性后再另添加酶。同时它催化的聚合反响的最适温度为70～80℃，此时引DNADNADNA聚合酶有TaqDNAPwoDNATthDNAVentDNAPfuDNA聚合酶等,但在PCRTaqDNATaqDNA自然的TaqDNA聚合酶是从美国黄石国家公园的温泉嗜热水生菌ThermusaquaticusYT-1249983294kDaTaqDNA聚合酶是E.coli细胞中表达的产9530min1005min，还具有一半活性。TaqDNA5”→3”DNA5”→3”外切酶活性，缺3”→5”外切酶活性，不具有klenow酶的校对功能，在其催化的PCR率大大增加，碱基错配的几率为1/300~1/18000。碱基错配的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。TaqDNA聚合酶作为PCR的耐热性DNADNA为模板，以dNTP原料，催化互补链的聚合反响，在引物3”-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3”,5”磷酸二酯键，使DNA5”→3”方向延长，扩增的DNAkb。PwoDNAPwoDNA〔archaebacterium〕Pyrococcuswoesei中觉察的，现在已经克隆出此酶基因并转入E.coli细胞中用于表达、提取此酶并在市场销售。该酶具5”→3”DNA3”→5”外切酶活性，没有检测到5”→3”外切酶活性。这种酶具有更高的耐热性，100℃下处理2h3”→5”外切酶DNATaqDNA5kb，并且扩出的DNATthDNA聚合酶这种酶是从喜温性真菌ThermusthermophilusHB8中分别的，具有强的5”→3”DNA3”→5”Mn2+RNAcDNAMn2+Mg2+，则可以使该酶的cDNAPCR扩增。由于TthDNA聚合酶既具有反转录活性又具有DNA扩增的功能，使得cDNA的合成与扩增可以用同一种酶催化，所以被用于反转录－聚合酶链式反响RT-PC，对于从RNA水平检测和分析基因表达格外有用。VentDNA此酶由海底火山口98℃水中生长的Litoralis栖热球菌中分别得到，酶基因已经得到克隆，并在大肠杆菌中成功表达了该酶。VentDNA聚合酶热稳定性极好，97.5℃下半衰期长达130min3”→5”外切酶活性，因此在催化DNA而有效降低碱基错误掺入率，提高扩增结果的忠实性。PfuDNAPfuDNAPyrococcusfurisus5”→3”DNAPwoDNA3”→5”PfuDNADNATaqDNA1297.53hdNTP存在时会降解模板DNAPCR反响液时须在最终添加于反响体系。除了上述的几种DNATakala公司推出的LATaqDNA聚合酶和EXTaqDNA聚合酶,不仅聚合力量大大提高，如前30kb5kb的片断，而且均具有3”→5”外切酶活性，保证扩出产物的保真性，产物还可以直接用于TA5、镁离子(Mg2+)浓度一般来讲，耐热的DNAPCR体系中使用Mn2+Mg2+Ca2+不能活化DNA聚合酶。因此，PCR反响中耐热DNA聚合酶的活性与反响体系中游离Mg2+浓度直接相关：Mg2+ 浓度过低酶活力显著降低，使产物削减；浓度过高又会使酶催化非特异性扩增。Mg2+ 浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、PCR产物的特异性、引PCR反响体系中dNTPDNA均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+存在(如EDTA),也会结合一局部游离的Mg2+。因此，在优化PCR反响条件时应考虑上述诸多因素，以查找体系中Mg2+的最适反响浓度。6、反响缓冲液反响缓冲液为PCR在购置公司耐热DNA10～50mmol/LTris-HCl，室温条件下其pH8.3～8.872℃时其pH7.2KCl，50mmol/L50mmol/L以上则抑制DNADNA合酶的活性，一般还需在反响缓冲液中添加DNA聚合酶保护剂，如小牛血清白蛋白〔BSA，10μg/m、明胶0.0％Tween-2〔0.0％0.1％〕或二硫苏糖醇等。7、PCR促进剂PCR促进剂主要包括向反响体系中参加助溶剂和添加剂，起到降低PCR反响过程中碱基错配水平，提高富含 GC模板的扩增效率。助溶剂主要包括甲酰胺formamid、二甲基亚砜dimethylsulfoxidDMSO〕和甘油glycero；添加剂包括tetramethylammoniumchloridTMApotassiumglutamat硫酸铵ammoniumsulfat、离子化及非离子化的除垢剂等。这些有关促进剂的添加可能DNA的解链温度使DNA变性完全，同时增进DNADNAPCR5％~10DMSO利于DNATaqDNA5％~20%的甘油有利于DNA10~100μmol/L的TMAC聚合酶链式反响的条件聚合酶链式反响的条件主要考虑如下几个方面：PCR反响体系的配制，变性的温度与时间，退火的温度与时间，延长的温度与时间，循环次数等。1、PCR如前所述，PCRDNADNADNADNADNAdNTP，催化DNA的肯定量的耐热DNAMg2＋在内的维系DNA液系统，在有些状况下还可考虑在反响体系中添加适量的某种PCR促进剂以提高反响效率。2.变性温度与时间PCRDNAPCRDNAPCR热来实现。变性所需的温度取决于模板DNAPCR产物双链DNA中的G+CG+C高，则双链DNA93℃～95DNADNADNADNA性时间过短，则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性，当PCR循环中的温度降低时，局部变性的DNA模板又重结合成双链，导致引物无法结合而使扩增失败。所以变性阶段DNAPCR3、退火的温度与时间退火温度是影响PCR反响特异性的重要因素。引物与模板复性所需的退火温度与时间，G+C甚至无扩增产物消灭。引物的退火温度可通过Tm=4(G+C)＋2(A+T)公式粗略估算，一般在算Tm5℃即为较适宜的反响设计退火温度。4、延长的温度与时间延长温度取决于使用的DNA聚合酶的最适温度，延长温度设定于聚合酶的最适温度四周，以获得较高的扩增效率。PCR70～75℃之间，常用温度为72℃，PCR在最适温度条件下，核苷酸的掺入率为每秒35～1001min2kb增片断已经足够。延长进间过长会导致非特异性扩增带的消灭。5、循环次数循环次数打算PCRPCR的模板DNA的浓度。PCR反响中扩增出的靶序列随循环次数的增加而呈指数性增长，但这种产物量及碱基错配数，循环次数太少则影响正常的PCR产物量，一般的循环次数介于30～40聚合酶链式反响引物设计原则PCR引物起到了格外关键的作用。因此为了提高反响的效率，需要对引物细心设计。引物设计的一般原则PCR5”→35”端引物和3”端引物，分别设在被扩增目标片段的二端，并分别与模板正负链序55”端上游的一小段DNA33”端的一小段正链DNAPCR增产物就是包括二条引物在内的这一对引物之间的双链DNA特异性和提高扩增产量，在设计PCR引物本身的长度及配对扩增用引物之间的扩增跨度;引物设计的目的是要提高PCRDNA并使延长温度超过TaqDNAPCR18～25个核苷酸为宜，而且一对引物中两个引物的寡核苷酸长度差异应小于3bp。至于配对扩增用引物之间的扩增跨度，即可G+C扩增用DNA引物的碱基组成;组成引物的4影响扩增特异性。C+G40%～60%为宜。引物自身特征;引物除了考虑长度外，自身内部碱基不应有反向重复序列或大于3bp的自身互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹构造，影响引物与待扩增DNA中的靶序列结合。引物之间;二条引物之间不应存在互补序列，尤其应避开3”端的互补重叠以免形4PCRPCR必造成对聚合酶、反响合成底物dNTP及包括引物本身的竞争，从而抑制待扩增靶序列的扩PCR〔touchdownPCPCR扩增退火温度常依据较低的Tm35”端引物应有相接近的Tm5℃，否则难以保证扩增的效果。引物末端修饰;在PCR扩增中，引物的3”端是引发延长的起点，因此肯定要与模板准确配对，不能进展任何修饰。引物的5”端并无严格的限制，在与模板结合的引物长度足够的前提下，其5”端碱基可不与模板DNA互补而成游离状态。通常这些游离序列对引物与模板的结合并无显著影响，因此引物的5”端可以被修饰，如引入突变位点，用生物素、DNA于扩增产物的下步克隆等。3”端的末位碱基3”端的末位碱基对Taq酶的DNAA33”端使用碱基AT3”端第一位碱基使用T3”端末位碱基最正确选择是GC们形成的碱基配比照较稳定。引物设计软件引物的设计要考虑多方面的因素，设计出的引物在PCR扩增中具有重要的地位，直接关系到靶DNA“Oligo”和“PrimerPremier”两者侧重点不同，“PrimerPremier”自动搜寻功能最强且便利使用。除了上述两种设计软件外，“Dnassist“Omiga”和“DNAstar”invitrogen公司、Roche〔“://invitrogen/“invitrogen“://roche/“roche〕均供给在线引物设计。聚合酶链式反响技术类型PCR198520一系列的技术体系，不仅可以扩增两段序列间的DNA，现在进展到可以扩增序列两进展、完善，功能上不仅可以用于DNADNA量和基因的连接等。DNA对DNAPCRPCR的靶DNA待扩增的特定双链DNA20～30bp3”端、5”端引物之用。靶DNA可以是环状DNADNAPCRDNdNTMg2PCR反响缓冲液、耐热DNA聚合酶等各按肯定的浓度或量要求添加到反响PCR编好程序后并运作此PCRDNAPCR此类DNA序列的PCR逆转录聚合酶链式反响PCR技术不仅可以用于DNARNARNA的PCR通常称为逆转录-聚合酶链反响(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCRPCR、RNAPCRmRNAPCR术相偶联的靶基因分别技术。通过mRNA反转录得到对应的cDNA，然后利用特定的PCR引物直接以反转录得到的cDNA为模板进展PCR扩增反响，获得大量的靶DNA序列。反转录可以用总RNA或分别出的总poly(A)RNAcDNA，即可进展PCRRT-PCRcDNART-PCRRT-PCRRTPCR同一反响管和单一的反响缓冲液中完成，RT完成后不需翻开反响管进展加样以避开污染。两步法是先在一个管中通过反转录酶的作用将mRNA模板反转录出cDNA中添加适量已反转录获得的cDNA一链，参加特异引物及其它反响成分后进展PCR扩增。两PCR反响，可以从一个样品解答多个问题。逆转录中所用的引物可以是基因特异引物，也可以是Oligo(dT)或随机引物。对于用特异引物即用3”端引物通过与mRNA模板结合引导反转录只能获得特定基因或基因家族的cDNAOligo(dT)引物则针对真核生物mRNA3”端均带有poly(A3poly(AmRNAcDNARNArRNARNA物中除了由mRNA反转录出的cDNA外，大局部产物均为总RNA中的rRNA试验中选择何种反转录引物，则视具体需要而定〔见图5-。反转录常用的逆转录酶主要有三种类型Moloney鼠白血病病毒来源的MMLV反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒来源的AMV3”→5”的核酸外切酶活性，因此没有校正功能，而且在反转录体系中需要高浓度的dNTP以确保反转录完全。在反转录酶活性最适温度方面，MMLV37AMV录酶的活性最适反响温度低RNARNaseHAMVRNaseH活性较MMLVAMVRNA-DNA杂合链中的RNA局部，也能消化cDNA3”RNAcDNA成的长度。其次类反转录酶是MMLV反转录酶的RNaseH-突变体，具有反转录效率高、合成cDNA〔50℃〕下反转录合成cDNA，更有利于具有强二级构造的RNATthDNA聚合酶，在Mn2+RTPCRcDNA总RNA或mRNA的分别AAA(A)n3`引物退火oligo-(dT)n引导TTT(T)n3`TTT(T)n3`

随机6寡聚核苷酸引AAA(A)n3`反转录酶cDNA第一链的合成AAA(A)n3`

基因特异序

AAA(A)n3`AAA(A)n3`基因特异DNA聚合酶引物组合 进展PCR5-2RT-PCRcDNAcDNAcDNA是基因转录产物mRNAcDNAcDNA序列还可以通过构建cDNA文库后筛选获得，也可以通过对分别纯化后的目的蛋白进展氨基酸序列测定后获得，但通常状况下获得的cDNA只是基因全长cDNA的局部序列而并非全长。cDNA末端的快速扩增〔rapidamplificationofcDNAends，RACE〕为克隆获得基因全长供给了解决途径。RACE是一种基于mRNA反转录和PCR序列为起点、扩增基因转录本未知区域、从而获得cDNA完整序列的方法。依据待扩增序列3”RACE和5”RACmRNA未知序列和序列位点上游的mRNA1、3”RACE3”RACEmRNA3”末端第一链cDNA序列，然后以第一链cDNA3”末mRNA3poly(AmRNA3”序列反转录供给mRNApoly(A)互补的oligo(dT)序列作为反转录引物，经退火后引导cDNA链的合成。但为了便利后续的cDNA3”序列的扩增及提高试验结果的牢靠性，需对3”RACE反转录引物两端做特别设计。反转录引物5”端添加一特定序列，这特定序列由外侧引物区OP〔outerprimer〕和内侧引物区IP〔innerprimer〕两局部组成，OPIP将为以后的两轮PCR转录在紧接poly(A3”端参加一个非T碱基的锚定核苷酸，构成3anchoringprimeAP，它实为三种引物的混合体。为了扩出未知序列，可依据目的基因的序列设计两条基因特异性引物GSP1〔外侧基因特异性引物〕和GSP2〔内侧基因特异性引物。在用反转录产物扩增目的序列时，先用GSP1OP引物组合进展第一轮PCRPCR引物即GSP2和IP引物组合进展二次PCR扩增，以提高扩增产物的特异性〔见图5-。2、5”RACE5”RACEmRNA〔5”端〕的未知序列。由于mRNA5”端没有类似于3”端的寡聚核苷酸尾巴，为此需要设计一种能够将锚定引物AP序列引入其cDNA3”RACE55”RACEGSP1cDNARNADNA末端转移酶的活力对cDNAcDNA3”RACE此经典的5”RACE缘由，反转录反响并不能使全部得到的第一链cDNA到达末端，形成一些假全长cDNA5”RACE5”端完整mRNARNA连接酶的作用下把锚定RNA寡核苷酸引物序列连接到mRNA5”端。反转录时，只有那些进展到mRNA5〔即反转录反响通过了被连入的mRNA锚定序列的反响，互补序列才会整合进第一链cDNA3”端，在以后的PCR些全长的cDNA才能被有效扩增〔见图5-。RNA3～5〔dC〕cDNA示这种活性，因此可以设计出3”端带3～5个dG的锚定引物参加到反转录体系中，该含poly(dGRNApoly(dC)的第一链cDNA3”端序列mRNA5clontech试剂盒。mRNA5`cDNA合成 反转录mRNA

X(A)n3`X(dT)m-IP-OP5`

mRNA5`

GSP1

X(A)n3`5` X(A)n3`X(dT)m-IP-OP5`降解RNA

GSP1降解RNA

X(A)n3`5`GSP1

X(dT)m-IP-OP5`OP5`

GSP15`GSP2

第一轮扩增 OP-IP-(G)nGS(C)nGS

GSP15`GSP15`GSP2

其次轮扩增

OP5`IP5`IP5`

OP-IP-(G)n

P2GSP2图5-33’RACE示意图 图5-45’RACE示意图序列侧翼聚合酶链式反响扩增常规的PCR技术是用于扩增两段序列之间的DNADNA序列的扩增，常规的PCRPCR得序列基因两侧未知DNA序列的PCR方法，包括反向PCR、锚定PCR、TAIL-PCR大便利了对序列的侧翼未知DNA1PCRPCR〔inversepolymerasechainreaction〕IPCR，格外适合于序列侧翼DNA序列的扩增，虽然在设计扩增用的一对引物时与常规PCR引物设计的规章全都，设计出的引物必需与序列互补，但与常规PCR引物的方向是相对的不同，用于反向PCRPCR板线性扩增，不能进展指数级增长，无法得到足够的产物。故用IPCR扩增的DNA模板必需DNA环化，使设计的引物由原来的相反转变为相对，就按常规PCR操作扩出未知的侧翼序列。所以综合来讲，IPCRPCR扩增等步骤〔见图5-：首先，用限制性内切酶消化待测线性DNA模板。其次，用连接酶将酶切后的线性DNA未知序列的扩增：其一为用设计的引物直接进展常规PCR扩增，其二为先把已环化的DNADNADNA序列，未知序列夹在中间，再按常规PCR往往设计巢式引物〔nestedprimer〕即包括内侧引物、外侧引物共两对引物，先用外侧引过序列测序与分析，就可获得侧翼序列。靶DNA序列适当的限制性核酸内切酶切割左侧序列 右侧序列连结后重环化引物1 引物2依据靶DNA序列设计一对外向引物进展PCR扩增5-5反向PCR〔引自吴乃虎，1998〕17212PCR(anchoredPCR)PCRPCR(single-specificprimerPCR，SSP-PCR)，是指通PCR引物为依据序列设计的序列特异性引物PCR技术是以DNA文库中载体上的一小段序DNA称为连接锚定PCRligationanchoredPC。在前述的RACE技术扩增基因中，均属锚定PCRmRNA的poly(A)序列特征设计出的一oligo(dTmRNA通过反转录获得的一链cDNADNA3”末端进展同聚物加尾后，如poly(dG)尾，再据此尾特点而设计出的对应poly(dC)引物，它们均属锚定引物的范畴。关于RACE3、TAIL-PCRTAIL-PCR也叫穿插式热不对称PCthermalasymmetricinterlacedPC，它是利用一系列序列特异性的巢式引物和一个短的任意引物〔arbitraryprimer〕引导扩增序PCRTAIL-PCRPCR反响中退火温度的凹凸对它与目〔序列的侧翼序列发〔见图5-PCR转基因突变体T-DNADNA以供给更多的侧翼序列信息，制造者对该技术进展了进一步的完善，在原来TAIL-cycling技术的根底上，引入了抑制PCR技术，进展出了hiTAIL-PCR方法。此方法对序列位点的侧翼未知序列的分别显示了更强大的生命力。未知序列聚合酶链式反响扩增PCR35”两端序列合成一PCR着PCRPCR扩增技术包括差异显示PCR、限制性显示PCR、消减PCRPCRAlu-PCR基因，下面重点对前三者作具体介绍。1PCR在高等生物中，体内基因的表达图谱不仅随着发育时间与空间的变化而呈规律变化，差异表达的基因格外利于生疏生物的基因功能及其表达规律PCR1992LiangPardeemRNAmRNA差异显示PCR〔mRNAdifferentialdisplayPCR，DD-PCR〕技术，又称差异显示反转录PCdifferentialdisplayreversetranscriptionPCDDRT-PC。由于该技术图5-6 TAIL-PCR原理示意图〔引自刘耀光，1995〕：TR1，TR2，TR3AD具有与PCR鉴定，在分子生物学和基因工程领域发挥了极大的作用。该技术的原理主要是基于真核生物成熟mRNA具有poly(A)的尾巴构造特点，依据在poly(A212〔B〕G、C、T种可能，其次位碱基〔N〕有A、T、G、C四种可能，设计出oligo-(dT)MN样mRNA3”端反12转录锚定引物，它是由约123”端锚定脱氧核苷酸组成，其中M为除T以外的任何一种核苷酸〔即、G或，而N则为任何一种核苷酸〔即AT、G或CMN共有125”-TMN1212种oligo-(dT)MN对mRNAmRNA1/12mRNA-cDNA12杂合分子。然后以一种由105”端随机引物〔arbitraryprimer，AP〕和3”端锚定引物进展PCRcDNA123”端锚定引物和205”端随机引物组成的全部240组引物对作PCR20230条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定的mRNA种类。这个数字大体上涵盖了在肯定发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA为了便于显示不同样品按同一种引物对扩增后的差异表达带PCR32P35SPCR胶电泳，经放射自显影和对胶板上的不同样品间进展比较，找出差异显示条带〔5-。将差异条带从凝胶上切割并回收cDNA，即可进展克隆测序分析或用作制备探针从基因文库中际操作中还觉察，该技术也存在一些缺乏：如假设要检测全部mRNA种类则每样品要进展至少240PCR存在差异条带漏检的可能；有时条带集中使目的带难以精精准出导致假阳性结果等。2PCRDDRT-PCR术的进展应用。马文丽进展的限制性显示PCR〔restrictdisplayPCR，RD-PCR〕技术很好的解决了上述问题。 mRNA

提取总RNANBAAAAAAAAAAn3`

mRNA

提取总RNANBAAAAAAAAAAn3`cDNA合成

oligo-(dT)12MN反转录

cDNA合成oligo-(dT)12MN反转录5 NBAAAAAAAAAAn3`3 NMTTTTTTTTTTTn

5 NBAAAAAAAAAAn3`3 NMTTTTTTTTTTTnPCR 反

oligo-(dT)12MN

PCR 反

oligo-(dT)12MN5”端随机引物5”端随机引物32S-dATP

32S-dATPPCR产物 PCR产物差异片断凝胶电泳 凝胶电泳差异片断切下差异片断制作探针或克隆Northern杂交分析等5-7差异显示PCR〔引自黄留玉，2023〕RD-PCR的原理是将反转录的cDNA或双链DNADNAPCR3”端分别延长一个或几个碱基，通过引物间的两两组合，将PCR10或4n×〔4n＋1〕/2个亚组，从而使基因片断通过选择性引物被有效地安排于不同的亚组中〔见图5-。合成的双链cDNA 提取的DNA限制性内切酶酶切选择性引物

连接通用引物选择性引物RD-PCR进展分组 基因片断的纯化与分析5-8RD-PCR〔引自黄留玉，2023〕3PCRPCR〔subtractivePCR〕PCRPCR〔suppressionsubtractionhybridization，SSH〕技术，该方法运用了杂交的二级动力学原理，即丰度高的单链cDNA在复性时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链cDNA，从而使原来存在丰度差异的单链cDNAPCR序列〔longinvertedrepeats〕在复性时产生“锅柄样”〔panhandle-like〕构造或类似发夹的互补构造，无法作为模板与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。这样即利用了消减杂交技术的消减富集，又利用了抑制PCR增加了获得低丰度差异表达cDNA的概率〔见图5-。PCR1、提取两种不同试验材料〔testerdriver〕的差异mRNA并反转录成cDNA，分别作为检测cDNtestercDN〕和驱除cDN〔drivercDN。用限制性内切酶将cDNA消化500bpcDNA2cDNA12〔40nt〕和一短链〔10nt〕5”端无磷酸化的平端双链DNADrivercDNA(过量) 接头2)第一次杂交ab第一次杂交cd 其次次杂交，混合样品，参加变性的Driver和复性的Driver和复性a,b,c,d+e末端补平g hi j参加引物PCR扩增f，i不扩增,h线性扩增g变为j指数扩增接头1； 接头2； cDNA5-9消减PCR的方向与cDNA3”端与cDNA5”端相连。长链外侧序列〔20nt〕与第一次PCR引物序列一样，内侧序列则与其次次PCR引物序列一样。此外，接头上还参加了T7启动子序列及内切酶识别位点，为以后的克隆和测序供给便利。3cDNAcDNA混合，变性后复性进展一种不充分的消减杂交。依据复性动力学原理，浓度高的单链分子快速复性，而浓度低的单链分子仍以单链形式存在，杂交的结果实现检测单链cDNAnormalizatiocDNA由于检测cDNA中与驱除cDNAcDNAcDNA中的差异表达基因的目标cDNA杂交产物，同时参加的变性驱动cDNA进展复性杂交。此时只有第一次杂交后经丰度均等化和消减的单链检测cDNA和驱动cDNAcDNA5”端分别连上了来自两个样本的不同的接头。杂交完成后补平末端。4PCRPCR这时只有两端是不同接头的双链cDNA分子才能呈指数扩增。而两端连上一样接头的同一片cDNAPCRPCR使差异片断获得大量富集并提高了产物的特异性。5PCR强、假阳性率低，二是敏感性高，适于低丰度表达基因，三是速度快，效率高。但此法最大的缺乏是需要较多的起始材料。目前此技术已用于很多基因的克隆。5.3.6聚合酶链式反响技术应用PCR先就必需构建突变体的基因组文库，然后应用有关探针进展杂交筛选等一系列繁琐的步骤，PCR步骤是依据预先测定的野生型基因的核苷酸序列资料DNA中直接扩增出大量的突变基因DNA5’端加上一段特别的额外序列。按设计要求，在第一次杂交时，引物中的这段额外序列因无互补性是不能参与杂交作用的，而只是其3’端的局部序列退火到了模板DNA5’端的额外序列才掺人到了扩增的DNA5’端的额外序列可以依据试验者的特定需求而细心设计，因此在实际的争论工作中具有很大的应用价值，供给了很多的敏捷性。因此，它是基因克隆的一种有效方法。另外，还有反向PCR，不对称PCRPCR技术问世以来，以其简便、快速、灵敏、特异性好等优点受到分子生物学界的普遍列分析，还可以用于cDNA文库的构建，突变体的分析，重组体的构建，基因表达调控的争论，SSR、RAPD、AFLP、RFLP等基因多态性的分析，染色体步移与基因的定位，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探究，法医鉴定包括亲子鉴定等诸多方面，近年进展的定量PCR技术也还可以用于基因的表达水平分析或基因在生物体内的拷贝数分析。PCRPCR可对特定核苷酸片断进展指数级的扩增。在扩增反响完毕之后，可以通过凝胶电泳还是半定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在很多状况下，我们所感兴趣的是未经PCR要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；在这种需求下荧光定量PCR19931996年美国ABIPCR来，因其高特异性、高灵敏度、所需时间短、并且还能进展核酸定量，而备受欢送，它不但解决了传统PCRPCRPCRmRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNAsiRNAPCR实现实时监测，消退穿插污染实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限PCR，实时荧光PCR承受闭管分析，无须电泳等PCR后处理步骤，有效消退核酸的穿插污染。特异性强由于在PCR的TaqManMGB(Mino，GrooveBinder)探针可检测出靶序列中单个碱基的错配、缺失或插人突变。定量结果准确PCRPCR荧光PCR方法通过承受外标准曲线定量的方法,其正确性已得到全世界的公认，广泛用于基因表达争论、转基因争论，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。5.4.2PCR在实时荧光定量PCRPCR反响的进展，PCR这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化6-6)图5-10实时荧光扩增曲线图一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始PCR26阈值线 CT值图5-11.荧光定量标准曲线产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进展定量分析。PCR阈值和CT3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反响管内的荧光信号到达设定的域值时所经受的循环数被称为CT〔thresholdvalue〕〔6-7。CTCTCT值越小。利用起Ct值〔如图6-7所示〕。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。5.4.3实时荧光PCR关键就是使用了荧光探针及其相应的荧光信号检测装置类很多，实现的途径也不完全一样，但根本原理都是依据荧光共振能量转移现象(fluorescencereso．nanceenergytransfer，FRET)设计的。当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，这种现象即是FRET。FRET现象发生程度与供、受体分子的空间距离严密相关，一般为7～10Bill时即可发生FRET；随着距离延长，FRETFRET27现象已广泛应用于核酸分子检测、生物大分子内和分子间相互作用等生物学争论。目前荧光实时定量PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：内嵌染料〔SYBRGreeⅠFRET探针、分子信标和Ampliflo。其中SYBRGreeⅠ染料法不RNA表达相对定量以及DNA定量争论中。TaqMan特异的荧光染料双键DNASYBRGreenISYBRGreenIDNA结合染料。与双链DNA大大增加。这一性质使其用于扩增产物的检测格外抱负。SYBRGreenI的最大吸取波长约为497nm520nmPCRSYBRSYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，放射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会PCR产物的增加完全同步。5-12SYBRGREENISYBRGreenIDNA相结合，可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增。但是，由于SYBRGreenI与全部的双链DNA相结合，因此由引物28温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。分子信标〔molecularbeacon〕分子信标是一种在靶DNA不存在时形成茎环构造的双标记寡核苷酸探针。在此发夹构造被激发后不是产生光子，而是将能量传递给