微血栓致缺血性心肌病发病机制的研究

微血栓致缺血性心肌病发病机制的研究微血栓致缺血性心肌病发病机制的研究，现在的生活越来越好了，发病率却比起以前来又更多了点，今天一起来认识下缺血性心肌病的研究。提高下科普的水平，还是有好处的1材料和方法：1.1动物雄性SD大鼠90只体重(250±30)g，购于哈尔滨医科大学附属第二临床医学院动物中心。实验动物及实验步均按照合国家实验动物管理条列执行。1.2试剂与器材月桂酸钠(Sigma，L9755)，大鼠可溶性血栓调节蛋白(solublethrombomdulin，sTM)ELISA试剂盒(美国R&D)，中性甲醛固定液(南京化学试剂公司生产)，戊二醛(湖北新景新材料有限公司)MotecDigitalMicroscope成像分析系统(德国Motec)，透射电子显微镜(日本JEOL)，超声仪(GEVivid7)，L550离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。1.3实验分组90只大鼠随机分成3组：模型组30只，假手术组30只和正常对照组30只，各组中随机选择12只进行超声检测，另于术后1、7、28天每组各选6只进行组织学检查。1.4实验方法SD大鼠，10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔内注射麻醉，常规备皮，气管插管连接呼吸机，右侧卧位固定，于左前外侧第三肋间开胸，逐层剥离进入胸腔，分离主动脉并用血管夹夹闭主动脉后，迅速以微量注射器从主动脉根部注射月桂酸钠(1μg/g)，夹闭20s，松开血管夹，待呼吸心跳稳定后逐层关胸，拔除气管插管，术毕腹腔注射80万单位青霉素并于术后连续抗炎3日，普通饲养。假手术组给予同等剂量的生理盐水替代月桂酸钠进行冠脉内注射，正常对照组不进行任何处理，余均同模型组。各组于术后1、7、28天，分别取6只鼠处死，取材进行指标检测。1.5检测指标1.5.1病理组织学检测：按照时间点取鼠处死，开胸，取出心脏，修剪去除心耳及主要大血管，中性甲醛固定，石蜡包埋。取左室乳头肌段心肌，连续切片，将组织切成4μm厚的切片。每只鼠随机取两张切片进行HE以染色观察微血栓的形成。微血栓指在小于150μm的微血管中，由血小板、纤维素或/和红细胞组成，HE染色呈粉红色，单纯的红细胞堆积认为是血管中残留的血液，HE染色呈点样深红色[7]。同时取两张切片进行马休黄-酸性品红-苯胺蓝(改良Lendrum法)染色，观察冠脉微血管原位栓塞组成成分，纤维素呈鲜红色，肌纤维呈红色，细胞核呈蓝褐色，胶原纤维呈蓝色，红细胞呈黄色，陈旧的纤维素成紫蓝色。1.5.2透射电镜检查于术后第7天，取大鼠左心室组织，4℃条件下制成约1mm3成组织块，迅速置于2.5%戊二醛固定液中固定24小时，经脱水、浸透、包埋后制成切片，进行染色，在透射电镜下观察微血管超微结构的改变。1.5.3血浆sTM检测各组动物均于细胞移植后1、7、28天取血2ml(n=6/组/时间点)，3000rpm离心10min，收集上清液，按照ELISA检测试剂盒说明书检测血清中sTM的浓度。1.5.4心功能检测将大鼠麻醉后，备皮，仰卧位固定于检查台上，用10MHz超声探头进行超声检查，每只大鼠记录3个心动周期以计算左室收缩末期容积(LVIDs)、左室舒张末期容积(LVIDd)内径的平均值、左室射血分数(EF%)和短轴缩短率(FS%)。每个指标检测3次，计算均值为最终的数值。1.6统计学处理用SPSS15.0软件分析，计量资料以x±s表示，组间均数的比较采用单因数方差分析，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Games-Howell检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。2实验结果2.1微血管原位血栓形成模型组HE染色显示，心肌微血管内弥漫分布着由血细胞、血小板和纤维蛋白构成的半透明粉红色血栓混合物，并可见局部心肌凋亡坏死(图-1)。马休黄-酸性品红-苯胺蓝(改良Lendrum法)染色则表明，血管内微栓塞的成分多由红色的纤维素和蓝色的胶原所组成(图-2)。而在假手术组和对照组则未见同样的特征性改变。2.2透射电镜观察结果模型组微血管内皮细胞细胞核过度收缩，核膜有下大面积染色质凝聚，形成高密度斑块，饮泡数量明显减少，线粒体絮状改变，内质网减少，内皮细胞间紧密连接呈增宽断裂状，血管腔挛缩狭窄，腔内可见胶原成分。假手术组可见微血管内皮细胞核呈梭形结构良好，质膜下存在大量饮泡，核内细胞器丰富，核一端相邻细胞紧密连接清晰可见，管腔大完整，内有大量红细胞2.3血浆sTM含量测定与对照组相比，术后模型组在各时间点大鼠血清sTM含量明显增加(P<0.05)，1天时既有明显升高，7天时最高，至28天时下降至术后一天水平(表-1)。假手术组术组与对照组比较，差异无统计学差异。2.4心功能检测与对照组比较，模型组在术后1天心功能即开始下降，差异有统计学意义(P<0.05);7天时各项心功能指标，模型组与对照组相比存在明显降低(P<0.05);28天时，可见差异继续增大(P<0.05)。而在同时间点假手组与对照组比较，差异无统计学意义3讨论研究结果表明，冠状动脉微循环在心肌整体血供体系中扮演了极其重要的角色，引起冠脉微循环障碍的原因主要可分为原位血栓形成和微栓子栓塞[8]：斑块中的脂质碎片、基质成分及内皮细胞、炎症细胞脱落、血小板及白细胞黏附聚集均可造成微小血管栓塞，冠脉血管介入(PCI)治疗均可能导致微血管栓塞,使心肌灌注发生障碍,引起心肌缺血，在即刻或远期预后方面具有重要意义。但并非仅有自发性的斑块破裂才导致微血管栓塞,临床观察发现,在血管介入治疗中,几乎所有的患者均有致血栓物质的释出[9,10],并可能形成微血管原位血栓的形成,同样会导致心肌灌注发生障碍。因此,防止及减少微栓塞发生和微血栓的形成具有重要的临床意义。目前研究认为在血栓的过程中，血管内皮细胞功能和结构的完整具有重要的作用[11]，在原位血栓的形成过程中可能也与内皮功能障碍有关。因而采用向冠脉注射月桂酸钠的方法来诱发微血栓的形成[12]。月桂酸钠以往常被用于制造外周动脉的血栓栓塞模型[13,14]，来评价研究抗血小板及抗血栓类药物的疗效及机理。由于月桂酸钠有强烈的内皮损伤作用,可造成血管内皮的脱落，甚至穿孔;注射1mL(1gPL)月桂酸钠可以造成下肢动脉内皮损伤、血栓形成，并进一步发生坏疽[15]。在试验中我们发现在桂酸钠的作用下，冠脉微血管内皮细胞的超微结构发生了明显的变化，细胞核固缩，染色质聚集，细胞器减少，细胞间紧密连接断裂增宽，血管腔挛缩狭窄。病理染色则显示在微血管处存在大量由胶原和纤维素构成的血栓形成。以上结果表明，月桂酸钠损伤内皮细胞，致使血管的完整性受损，内皮下基质暴露，诱发凝血，最终导致原位微血栓的形成。可溶性血栓调节蛋白(TM)是由由血管内皮细胞分泌产生，是蛋白C系统的重要组成成分，其与血酶结合形成T-TM复合物而激活蛋白C系统，血管内皮细胞蛋白C受体能加强T-TM活化蛋白C，从而提示TM参与激活蛋白C系统的过程。而另一方面TM通过与活化的蛋白C的结合还可以抑制活化蛋白C的活性，因而TM在凝血和抗凝过程中具有重要作用，以往对TM的研究主要集中在凝血和纤溶作用中，而近年来的研究表明TM可作为某些疾病血管内皮损伤的分子标志以检测血管内皮的损伤情况[16,17]。在本实验中可见在术后1天时模型组TM含量既有明显升高，7天时最高，至28天时下降至术后一天水平。这可能与血栓局部炎症反应有一定联系。总之，通过向冠状动脉内注射月桂酸钠的方法，可以成功构建大鼠冠脉微血栓的动物模型，其机制与月