酶工程教案 资料

酶工程简介酶工程（enzymeengineering）是在1971年第一届国际酶工程会议上才得到命名的一项新技术。酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。根据研究和解决问题的手段不同将酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。第一章酶学概论（Enzyme）新陈代谢是生命活动的基础，是生命活动最重要的特征。而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化，都是在酶催化下进行的。生命的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。第一节酶的一般概念一、酶的概念及化学本质（一）

酶的概念：酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂。（二）

酶的化学本质：绝大多数酶是蛋白质,少数是核酸RNA，后者称为核酶。本章主要讨论以蛋白质为本质的酶。二、酶的组成与分类（一）

根据酶的组成成分，酶可分为：单成分酶（单纯酶）、多成分酶（复合酶）单纯酶(simpleenzyme)是基本组成单位仅为氨基酸的一类酶。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。脲酶、消化道蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等均属此列。复合酶(conjugatedenzyme)的催化活性，除蛋白质部分(酶蛋白apoenzyme)外，还需要非蛋白质的物质，即所谓酶的辅助因子(cofactors)，两者结合成的复合物称作全酶(holoenzyme)，即：全酶酶蛋白辅助因子(结合蛋白质)(蛋白质部分)(非蛋白质部分)酶的辅助因子可以是金属离子，也可以是小分子有机化合物。常见酶含有的金属离子有K+、Na+、Mg2+、Cu2+、(或Cu+)、Zn2+和Fe2+(或Fe3+)等。它们或者是酶活性的组成部分；或者是连接底物和酶分子的桥梁；或者在稳定酶蛋白分子构象方面所必需。小分子有机化合物是一些稳定的小分子物质，其主要作用是在反应中传递电子、质子或一些基团，常可按其与酶蛋白结合的紧密程度不同分成辅酶和辅基两大类。辅酶(coenzyme)与酶蛋白结合疏松，可以用透析或超滤方法除去；辅基(prostheticgroup)与酶蛋白结合紧密，不易用透析或超滤方法除去，辅酶和辅基的差别仅仅是它们与酶蛋白结合的牢固程度不同，而无严格的界限。大多数维生素(特别是B族维生素)是组成许多酶的辅酶或辅基的成分。它们的化学结构式见下章维生素。体内酶的种类很多，而辅酶(基)的种类却较少，通常一种酶蛋白只能与一种辅酶结合，成为一种特异的酶，但一种辅酶往往能与不同的酶蛋白结合构成许多种特异性酶。酶蛋白在酶促反应中主要起识别底物的作用，酶促反应的特异性、高效率以及酶对一些理化因素的不稳定性均决定于酶蛋白部分。常见的辅酶，如下表所示：辅酶形式主要作用所含B族维生素硫胺素焦磷酸酯(TPP)α-酮酸氧化脱羧、酮基转换作用硫胺素(B1)6,8-二硫辛酸α-酮酸氧化脱羧硫辛酸辅酶A(CoA)酰基转换作用泛酸黄素单核苷酸(FMN)黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)氢原子转移氢原子转移核黄素(B2)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)氢原子转移氢原子转移尼克酰胺(PP)磷酸吡哆醛氨基酸代谢吡哆素(B6)生物素羧化作用生物素(H)四氢叶酸"一碳基团"转移叶酸5-甲基钴铵素5-脱氧腺苷钴铵素甲基转移钴胺素(B12)(二)根据酶的结构特点及分子组成形式分为：1.单体酶：只含一条肽链，分子量小，大多数水解酶属于此类。2.寡聚酶：由几条或几十条多肽链组成，每条肽链是一个亚基，单独的亚基无酶的活力。如己糖激酶、乳酸脱氢酶，均含四个亚基，谷氨酸脱氢酶含六个亚基。3.多酶复合体：若干个功能相关的酶彼此嵌合形成的复合体。每个单独的酶都具有活性，当它们形成复合体时，可催化某一特定的链式反应，如丙酮酸氧化脱羧酶复合体，含三个酶六个辅助因子；脂肪酸合成酶复合体，含有六个酶及一个非酶蛋白质。(三)根据酶的存在状态分为：胞内酶、胞外酶1.胞内酶：在合成分泌后定位于细胞内发生作用的酶，大多数的酶属于此类。2.胞外酶：在合成后分泌到细胞外发生作用的酶，主要为水解酶。三.酶催化作用的特性（一）酶与普通催化剂的共性：1.只能催化热力学上允许进行的反应，对于可逆反应，酶只能缩短反应达到平衡的时间，但不改变平衡常数；2.酶也是通过降低化学反应的活化能来加快反应速度；3.酶在反应中用量很少，反应前后数量、性质不变。（二）酶催化作用的特性：指酶不同于一般的催化剂的性质。1、高度专一性：酶的专一性：也称为酶的特异性(specificity)，它是指酶对所作用底物(substrate)的选择性。根据酶对底物的选择方式不同，酶的专一性分为：（1）、绝对专一性(absolutespecificity)：指一种酶只选择一种底物作用，如脲酶。（2）、相对专一性(relativespecificity)：指一种酶选择一类底物作用。根据酶选择的对象不同又分为：键专一性(bondspecificity)：指酶对所作用键的选择性，如脂肪酶。基团专一性（族专一性,groupspeicificity）：指酶对所作用的键及键一侧的基团的选择性，如α-D-葡萄糖苷酶，胰蛋白酶。（3）、光学专一性(opticalspecificity)：指酶对所作用底物立体构型的选择性，如L-氨基酸氧化酶。（4）、几何专一性(geometricalspecificity)：指酶对所作用底物顺反异构的选择性，如顺乌头酸酶。2、高效性：酶比一般的普通催化剂效率高106-1013倍。3、反应条件温和4、易变性5、酶的活力（activity）受多种因素的调节与控制四、酶的命名与分类（一）酶的命名：通常采用习惯命名法，主要根据以下几个原则：1、根据酶作用的底物来命名：如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等；2、根据酶催化反应的性质来命名：如脱氢酶、脱羧酶、水解酶等；3、根据酶的来源、作用条件等来命名：如细菌淀粉酶、碱性磷酸酯酶、胃蛋白酶等。从上述可知，酶的习惯命名法不够系统，不够准确，难免会出现一酶多名或一名多酶的现象。为此1961年国际酶学委员会（EnzymeCommission，EC）提出了系统命名法，系统命名法规定，酶的名称包括两部分：底物名称和反应类型，如果反应中有多个底物，每个底物均需列出（水解反应中的水可省略），底物名称之间用“：”隔开。若底物有构型，也需标出，如L—丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶。(二)、酶的系统分类方法：根据酶所催化反应的性质，由酶学委员会规定，将酶分为六大类：1.

氧化还原酶类催化底物的氧化还原反应，如脱氢酶、氧化酶等。2.

转移酶类催化底物之间基团的转移反应，如氨基转移酶、激酶、甲基转移酶、羧基转移酶等。3.

水解酶类催化底物的水解反应，如蛋白酶、肽酶、脂肪酶、淀粉酶等。4.

裂合酶类催化底物裂解或缩合反应，如脱水酶、脱氨酶、脱羧酶、醛缩酶等。5.

异构酶类催化同分异构体的底物之间相互转换，如磷酸甘油酸变位酶、磷酸己糖异构酶。6.

合成酶类也称连接酶类，催化两种或两种以上化合物合成一种化合物的反应。反应需吸收能量，通常与ATP的分解相偶连，ATP分解产生能量用于合成反应。（三）酶的系统编号：根据上述酶的系统分类方法，国际酶学委员会还对每个酶做了统一编号，一个酶只有一个编号，因此不会混淆。酶的系统编号由“EC”加四个阿拉伯数字组成，每个数字之间以“.”隔开。“EC”是国际酶学委员会的缩写，这四个数字的含义分别是：第一个数字代表大类，第二个数字代表亚类，第三个数字是亚亚类，第四个数字是酶在亚亚类中的序号。如：EC1.1.1.27（乳酸：NAD+氧化还原酶）。第二节酶的结构与功能的关系一、酶的活性中心与必需基团（一）酶的活性中心酶是生物大分子，相对分子质量很大，而与酶反应的底物一般是相对分子质量较小的分子，有时即使是大分子底物时，反应也是逐步进行的，酶仅与大分子底物中的一小部分作用。与底物接触并且发生反应的部位就称为酶的活性中心(activecenter)。酶的活性中心往往是若干个在一级结构上相距很远，但在空间结构上彼此靠近的氨基酸残基集中在一起形成具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并将底物转化为产物，对于结合酶来说，辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。酶的活力中心通常包括两部分：与底物结合的部位称为结合中心，结合中心决定酶的专一性；促进底物发生化学变化的部位称为催化中心，它决定酶所催化反应的性质以及催化的效率。有些酶的结合中心与催化中心是同一部分。酶活性中心示意图（二）酶的必需基团(essentialgroup)酶的分子中存在着许多功能基团，例如，-NH2、-COOH、-SH、-OH等，但并不是这些基团都与酶活性有关。一般将与酶活性有关的基团称为酶的必需基团。必需基团可分为四种：1.

接触残基（contactresidue）：直接与底物接触的基团，它们参与底物的化学转变，是活性中心的主要必需基团。这些基团中有的与底物结合称为结合基团(bindinggroup)，有的催化底物发生化学变化称为催化基团(catalyticgroup)。活性中心中有的必需基团可同时具有这两方面的功能。还有些必需基团虽然不参加酶的活性中心的组成，但为维持酶活性中心应有的空间构象所必需，这些基团是酶的活性中心以外的必需基团。2.

辅助残基(auxiliaryresidue):这种残基既不直接与底物结合，也不催化底物的化学反应，但对接触残基的功能有促进作用。它可促进结合基团对底物的结合，促进催化基团对底物的催化反应。它也是活性中心不可缺少的组成部分。3.

结构残基（structureresidue）：这是活性中心以外的必需基团，它们与酶的活性不发生直接关系，但它们可稳定酶的分子构象，特别是稳定酶活性中心的构象，因而对酶的活性也是不可缺少的基团，只是起间接作用而已。4.

非贡献残基（noncontributionresidue）：酶分子中除上述基团外的其它基团，它们对酶的活性“没有贡献”，也称为非必需基团。这些基团对酶活性的发挥不起作用，它们可以被其他氨基酸残基取代，甚至可以去掉都不会影响酶的催化活力。但这些基团并不是真正意义上的“非必需”基团，它们可能在系统发育的物种专一性方面、免疫方面或者在体内的运输转移、分泌、防止蛋白酶降解的方面起一定作用。如果没有这些基团，酶的寿命、酶在细胞中的分布等方面受到限制。这些基团的存在也可能是该酶迄今未发现的新的活力类型的活力中心。（三）.酶活性中心证明方法1.切除法对小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切除一段肽链后剩余的肽链仍有活性，说明切除的肽链与活性无关，反之，切除的肽链与活性有关。2.化学修饰法选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引起共价结合、氧化或还原等修饰，称之为化学修饰。酶分子中可以修饰的基团有：-SH、-OH、咪唑基、氨基、羧基、胍基等，用作修饰的试剂很多，目前已有七十多种，但专一性的修饰剂不多。判断方法：某一基团被修饰后，酶的活性显著下降或无活性，可初步判断该基团与酶的活性有关；反之，与酶的活性无关。缺点：也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶分子的正常空间结构，而导致酶活性的丧失。为排除这种可能，常在底物保护下用同一试剂对酶作用，若不能被修饰，说明该基团确实处于活性部位；反之，底物存在下，该基团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该基团不是活性部位的基团，而是结构基团。根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学修饰可分为：（1）、非特异性共价共接修饰：修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合，又可与酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共价共价修饰。此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位，在非活性部位不存在或极少存在。判断标准是一：酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比；二：底物或竞争性抑制剂保护下可防止修饰剂的抑制作用。（2）、特异性的共价修饰：修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团，使酶失活。如：DIFP（二异丙基氟磷酸）可专一性地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸—OH而使酶失活。DIFP一般不与蛋白质反应，也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应，只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合。3.亲和标记法：根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物，作为活性部位的标记试剂，它能象底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为：N—对甲苯磺酰—L—苯丙氨酰乙酯或甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：N—对甲苯磺酰—苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）。4.X—射线衍射法：把一纯酶的X—射线晶体衍射图谱与酶与底物反应后的X-射线图谱相比较，即可确定酶的活性中心。(四)酶的活性中心的一级结构应用化学修饰法对多种酶的活性中心进行研究发现，在酶的活性中心处存在频率最高的氨基酸残基是：丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸和半胱氨酸。如果用同位素标记酶的活性中心后，将酶水解，分离带标记水解片段，对其进行一级结构测定，就可了解酶的活性中心的一级结构。对各种蛋白水解酶进行类似的分析，功能类似的酶在一级结构上有惊人的相似性。见下表所示：酶氨基酸顺序胰蛋白酶（牛）胰凝乳蛋白酶（牛）弹性蛋白酶（猪）凝血酶（牛）蛋白酶（S.griseus）—天冬.丝,半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.缬--丝.丝.半胱.甲硫.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮--丝.甘.半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮--天冬.丙.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.苯丙-苏.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.甲硫

从上表可知，一些丝氨酸蛋白酶在活性丝氨酸附近的氨基酸几乎完全一样，而且这个活性丝氨酸最邻近的5-6氨基酸顺序，从微生物到哺乳动物都一样，说明蛋白质活性中心在种系进化上有严格的保守性。二、酶的活性与高级结构的关系酶的活性不仅与一级结构有关，而且与其高级结构密切相关。就某种程度而言，在酶的活性表现上，高级结构甚至比一级结构更为重要。高级结构是形成酶特定空间结构的保证，高级结构破坏，酶失去活性。三、酶原激活有些酶在细胞内合成时，或初分泌时，没有催化活性，这种无活性状态的酶的前体称为酶原(zymogen)。酶原向活性的酶转化的过程称为酶原的激活。酶原激活实际上是酶的活性中心形成或暴露的过程。胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活性的酶原形式存在，在一定条件下才转化成相应的酶。某些酶原的激活过程酶原激活条件活化的酶水解掉的肽段胃蛋白酶原胃蛋白酶六肽胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽糜蛋白酶原Aα-糜蛋白酶两个二肽羧肽酶原A羧肽酶A几个碎片弹性蛋白酶原弹性蛋白酶几个碎片例如，胰蛋白酶原进入小肠后，受肠激酶或胰蛋白酶本身的激活，第6位赖氨酸与第7位异亮氨酸残基之间的肽键被切断，水解掉一个六肽，酶分子空间构象发生改变，产生酶的活性中心，于是胰蛋白酶原变成了有活性的胰蛋白酶。除消化道的蛋白酶外，血液中有关凝血和纤维蛋白溶解的酶类，也都以酶原的形式存在。胰蛋白酶原激活示意图糜蛋白酶原的激活过程胃蛋白酶原的激活过程

胃蛋白酶原的激活过程酶原激活的生理意义在于避免细胞内产生的蛋白酶对细胞进行自身消化，并可使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢的正常进行。酶催化机理酶的催化机理是解释酶催化特性的理论，如：酶为什么能催化化学反应、酶是如何催化化学反应的、酶为什么有专一性、酶为什么有高效性等。一、酶为什么能催化化学反应一个化学反应要能够发生，关键的是反应体系中的分子必须具备一定能量即分子处于活化状态，活化分子比一般分子多含的能量就称为活化能。反应体系中活化分子越多，反应就越快。因此，设法增加活化分子数量，是加快化学反应的唯一途径。增加反应体系的活化分子数有两条途径:一是向反应体系中加入能量，如通过加热、加压、光照等，另一途径是降低反应活化能。酶的作用就在于降低化学反应活化能，下图1所示图1非催化过程和催化过程自由能的变化二、酶如何降低化学反应的活化能中间产物学说中间产物学说认为：酶在催化化学反应时，酶与底物首先形成不稳定的中间物，然后分解酶与产物。即酶将原来活化能很高的反应分成两个活化能较低的反应来进行，因而加快了反应速度。S+E→ES→P+E底物酶中间产物产物中间产物学说已经得到一些可靠的实验依据。如，用吸光法证明了含铁卟啉的过氧化物酶参加反应时，单纯的酶的吸收光谱与加入了第一个底物H2O2后确实产生了变化。三、酶的高效性的解释1、底物与酶的邻近效应和定向效应2、底物分子的形变和扭曲3、共价催化4、酸碱催化5、活性部位的微环境的影响四、酶的专一性的解释（一）锁与钥匙学说：如图所示锁与钥匙学说示意图（二）诱导契合理论如下图所示（三）结构性质互补假说该学说认为酶同底物结合的专一性，与底物结构和酶的活性中心的空间结构相关，二者的结构是互补的。如果底物是解离的，则酶的活性中心的空间结构必然带相反的电荷才能很好结合。而且底物同酶活性中心的极性也必然相同。第四节酶促反应动力学酶促反应动力学(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。这些因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。一、底物浓度对反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影响是在酶的浓度一定的条件下测定的，底物浓度对反应速度影响呈现矩形双曲线(rectangularhyperbola)。底物浓度对反应初速度的影响在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，表现为一级反应。随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。(一)米氏方程

Vmax指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，VO是在某一底物浓度时相应的反应速度。当底物浓度很低时，[S]《Km,则V≌Vmax[S]/Km，反应速度与底物浓度呈正比。当底物浓度很高时，[S]》Km，此时V≌Vmax，反应速度达最大速度，底物浓度再增高也不影响反应速度。(二)米氏常数的意义1.物理意义：Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。2.Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。3.Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。各种酶的Km值范围很广，大致在10-1～10-6M(三)Km在实际应用中的重要意义1.鉴定酶：通过测定可以鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。2.判断酶的最佳底物：如果一种酶可作用于多个底物，就有几个Km值，其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解（Km=28mol/L），也可催化棉子糖水解（Km=350mol/L）,两者相比，蔗糖为该酶的天然底物。3.计算一定速度下的底物浓度：如某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的99%，则[S]=99Km4.了解酶的底物在体内具有的浓度水平：一般地，体内酶的天然底物的[S]体内≈Km，如果[S]体内《Km，那么VO《Vmax,细胞中的酶处于“浪费“状态，反之，[S]体内》Km，那么VO≈Vmax，底物浓度失去生理意义，也不符合实际状态。5.判断反应方向或趋势：催化正逆反应的酶，其正逆两向的反应的Km不同，如果正逆反应的底物浓度相当，则反应趋向于Km小对应底物的反应方向。(四)Km求法：双倒数作图(doublereciprocalplotorLineweaverBurkplot)将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：1／VO=Km／Vmax·1／[S]+1／Vmax从下图可知，1/V0对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/Vmax,，在纵轴上的截距为1/Vmax,横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值。双倒数作图法二、酶浓度的影响在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大大超过酶浓度时，速度与酶的浓度呈正比。酶浓度对速度的影响机理：酶浓度增加，[ES]也增加，而V0=k3[ES]，故反应速度增加。三、温度对酶促反应速度的影响酶促反应与其它化学反应一样，随温度的增加，反应速度加快。化学反应中温度每增加10℃反应速度增加的倍数称为温度系数Q10。一般的化学反应的Q10为2-3，而酶促反应的Q10为1-2。在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度（optimumtemperatureTm）,.一般动物组织中的酶其最适温度为35-40℃，植物与微生物中的酶其最适温度为30-60℃，少数酶可达60℃以上，如细菌淀粉水解酶的最适温度90℃以上。温度对酶促反应速度的影响机理：1.温度影响反应体系中的活化分子数：温度增加，活化分子数增加，反应速度增加。2.温度影响酶的活性：过高的温度使酶变性失活，反应速度下降。最适温度不是酶的特征常数，因为一种酶的最适温度不是一成不变的，它要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂、酶反应时间等因素的影响。因此，酶的最适温度与其它反应条件有关。四、pH对酶促反应速度的影响大多数酶的活性受pH影响显著，在某一pH下表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力显著下降。酶表现最大活力的pH称为酶的最适pH(optimumpHpHm)。典型的酶速度—pH曲线是较窄的钟罩型曲线，但有的酶的速度—pH曲线并非一定呈钟罩型。如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度—pH曲线。胃蛋白酶的速度-温度曲线如下图。胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲线pH对酶促反应速度的影响机理：1.pH影响酶和底物的解离:酶的活性基团的解离受pH影响，底物有的也能解离，其解离状态也受pH的影响，在某一反应pH下，二者的解离状态最有利于它们的结合，酶促反应表现出最大活力，此pH称为酶的最适pH；当反应pH偏离最适pH时，酶促反应速度显著下降。2.pH影响酶分子的构象：过高或过低pH都会影响酶分子活性中心的构象，或引起酶的变性失活。动物体内多数酶的最适pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最适pH约1.8，肝精氨酸酶最适pH约为9.8(见下表)。一些酶的最适pH酶最适pH酶最适pH酶最适pH胃蛋白酶1.8过氧化氢酶7.6延胡索酸酶7.8胰蛋白酶7.7精氨酸酶9.8核糖核酸酶7.8最适pH不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液的种类和浓度以及酶的纯度等因素的影响。五.激活剂对酶反应速度的影响能使酶活性提高的物质，都称为激活剂(activator)，其中大部分是离子或简单的有机化合物。如Mg++是多种激酶和合成酶的激活剂，动物唾液中的α-淀粉酶则受Cl-的激活。通常，酶对激活剂有一定的选择性，且有一定的浓度要求，一种酶的激活剂对另一种酶来说可能是抑制剂，当激活剂的浓度超过一定的范围时，它就成为抑制剂。六.抑制剂对反应速度的影响凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂(inhibitor)。使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。（一）不可逆性抑制作用(irreversibleinhibition)不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共价键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使酶丧失活性，按其作用特点，又有专一性及非专一性之分。1.非专一性不可逆抑制抑制剂与酶分子中一类或几类基团作用，不论是必需基团与否，皆可共价结合，由于其中必需基团也被抑制剂结合，从而导致酶的抑制失活。某些重金属(Pb++、Cu++、Hg++)及对氯汞苯甲酸等，能与酶分子的巯基进行不可逆适合，许多以巯基作为必需基团的酶(通称巯基酶)，会因此而遭受抑制，属于此种类型。用二巯基丙醇(britishantilewisite,BAL)或二巯基丁二酸钠等含巯基的化合物可使酶复活。2.专一性不可逆抑制此属抑制剂专一地作用于酶的活性中心或其必需基团，进行共价结合，从而抑制酶的活性。有机磷杀虫剂能专一作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，乙酰胆碱不能及时分解成乙酸和胆碱，引起乙酰胆碱的积累，使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过度兴奋状态，引起神经中毒症状。解磷定等药物可与有机磷杀虫剂结合，使酶和有机磷杀虫剂分离而复活。(二)可逆性抑制(reversibleinhibition)抑制剂与酶以非共价键结合，在用透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复，即抑制剂与酶的结合是可逆的。这类抑制剂大致可分为以下二类。1.竞争性抑制(competitiveinhibition)(1)含义和反应式抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥，已结合底物的ES复合体，不能再结合I。同样已结合抑制剂的EI复合体，不能再结合S。（2）特点：A.抑制剂I在化学结构上与底物S个相似，能与底物S竞争酶E分子活性中心的结合基团，因此，抑制作用大小取决于抑制剂与底物的浓度比，加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。例如，丙二酸、苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。B.竞争性抑制剂双倒数曲线，如下图所示：竞争性抑制有竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于纵坐标I/Vmax处，但横坐标的截距，因竞争性抑制存在变小，说明该抑制作用，并不影响酶促反应的最大速度Vmax，而使Km值变大。很多药物都是酶的竞争性抑制剂。例如磺胺药与对氨基苯甲酸具有类似的结构，而对氨基苯甲酸、二氢喋呤及谷氨酸是某些细菌合成二氢叶酸的原料，后者能转变为四氢叶酸，它是细菌合成核酸不可缺少的辅酶。由于磺胺药是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂，进而减少细菌体内四氢叶酸的合成，使核酸合成障碍，导致细菌死亡。抗菌增效剂-甲氧苄氨嘧啶(TMP)能特异地抑制细菌的二氢叶酸还原为四氢叶酸，故能增强磺胺药的作用。磺胺药物的抑菌作用2.非竞争性抑制(non-competitiveinhibition)(1)含义和反应式抑制剂I和底物S与酶E的结合完全互不相关，既不排斥，也不促进结合，抑制剂I可以和酶E结合生成EI，也可以和ES复合物结合生成ESI。底物S和酶E结合成ES后，仍可与I结合生成ESI，但一旦形成ESI复合物，再不能释放形成产物P。（2）特点：A.I和S在结构上一般无相似之处，I常与酶分子上结合基团以外的化学基团结合，这种结合并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不能减少I对酶的抑制程度。B.非竞争性抑制剂的双倒数曲线：有非竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于横坐标-1/Km处，但纵坐标的截距，因竞争性抑制存在变大，说明该抑制作用，并不影响酶促反应的Km值，而使Vmax值变小，如下图所示：非竞争性抑制3.反竞争性抑制（1）含义和反应式反竞争性抑制剂必须在酶结合了底物之后才能与酶与底物的中间产物结合，该抑制剂与单独的酶不结合。（2）特点：反竞争性抑制剂存在下，Km、Vmax都变小。第五节酶的分离提纯及活力测定一.酶的分离提纯(一)酶在细胞中的分布：胞外酶：水解酶类，易收集，不必破碎细胞，缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液。胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。(二)分离材料：动植物原料或微生物的发酵液。微生物发酵液是用于分离酶的最常用材料，因为微生物种类多，繁殖快，培养时间短，含酶丰富。由微生物发酵产生的酶或其它生物组织中的酶因含有大量的其它物质，所以必须经过分离、提纯、结晶等阶段才可做实际应用。对于某种酶的具体制备方案，应通过了解酶的来源、性质及纯度需要来确定，无固定的方案。（三）原则：在增加酶得率和纯度的同时，尽可能避免高温、过酸、过碱、剧烈的震荡及其它可能使酶丧失活力的一切操作过程。尽最大可能保存酶的活力。（四）分离提纯：1.酶的抽提：将酶溶解出来就称为抽提。胞外酶：固体培养的菌体加水或适当缓冲溶液浸泡过滤即可。液体培养的菌体将发酵液离心分离除去菌体收集离心液即可。胞内酶：先破碎细胞，再用水或适当的缓冲溶液抽提。2.酶的纯化：纯化的关键是维持酶的活性，因为随着酶的逐渐提纯，一些天然的可保持酶活力的其它成分逐渐减少，酶的稳定性变差，所以整个纯化过程应维持低温。（1）酶的沉淀方法：与蛋白质的沉淀方法相同，常用：A．盐析法：常用硫酸铵盐析，有分段盐析和一次性盐析两种方法。B．有机溶剂沉淀法：用乙醇、丙酮等。应低温操作，溶剂少量分批加入。（2）酶的纯化方法：有吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。3.酶的结晶：纯化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。4.酶的保存：一般在-20℃二.酶活力的测定定性鉴定提取物中某一酶是否存在，一般是根据此酶引起的化学反应来判断，如检验在提取物中是否存在淀粉酶。则用提取物与淀粉反应，一段时间以后，用碘-碘化钾与反应液反应，若变蓝，说明提取物无淀粉酶活力；反之，提取物有淀粉酶的活力。酶活力的测定：实际上是酶定量测定的方法，酶制剂因含杂质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。（一）酶活力的概念：指酶催化特定化学反应的能力。其大小通常用在一定条件下酶催化某一特定化学反应的速度来表示。一定量的酶制剂催化某一化学反应速度快，活力大；反之，活力小。速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，测初速度，多用后者。因为反应初期底物过量，底物的减少量不容易测定，而产物从无到有，易测定。（二）酶的活力单位：1961年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（IU）规定为：在最适反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位。测定条件：最佳的反应条件，如最适的Tm（或25℃）、pHm、[S]》[E]、初速度下。1972年国际生化协会又推荐一种新单位，即Katal(Kat)单位。规定：在最适温度下，每秒钟能催化1摩尔底物转化为称为所需要的酶量定义为1Kat。1Kat=60×106IU.(三)酶的比活力：每单位酶蛋白所含的活力单位数。对固体酶：用活力单位/毫克酶蛋白、或活力单位/毫克酶蛋白氮来表示，对液体酶：用活力单位/毫升酶液来表示。很明显，比活力越大，酶的活力越大。（四）、酶活力的测定方法1、分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质或产物有紫外吸收的能力可采用此法。2、测压法：产物中有气体，测气压增加量。3、滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。4、荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂反应生成荧光产物可用此法。5、旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。第六节酶活性的调节一、变构酶与变构调节（一）概念变构酶又称为别构酶，指酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地共价结合后，引起酶的构象的改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节作用称为变构调节(allostericregulation)，具有变构调节的酶称变构酶(allostericenzyme)，凡能使酶分子发生别构作用的物质称为变构剂(effector)。变构酶多为寡聚酶，含的亚基数一般为偶数；且分子中有催化部位（结合底物）与调节部位（结合变构剂），这两部位可以在不同的亚基上，或者在同一亚基的两个不同部位。（二）、变构酶作用特点1、一般变构酶分子上有二个以上的底物结合位点。当底物与一个亚基上的活性中心结合后，引起酶分子构象的改变，使其它亚基的活性中心与底物的结合能力发生改变，或出现正协同效应(positivecooperativeeffect)，或出现负协同效应（negativecooperativeeffect）。2、正协同效应的变构酶其速度—底物浓度曲线呈S形，即底物浓度较低时，酶活性的增加缓慢，底物浓度高到一定程度后，酶活性显著加强，最终达到最大值Vmax。如大肠杆菌的天冬氨酸转甲酰基酶（ATCase）对底物天冬氨酸的结合表现为正协同效应。

3、负协同效应的变构酶其速度—底物浓度曲线为类似双曲线，底物浓度较低时，酶表现出较大活性，但底物浓度明显增加时，其反应速度无明显变化。如3-磷酸甘油醛脱氢酶对NAD+的结合为负协同效应，其意义在于无论细胞内酶的底物浓度如何变化，酶始终能以一个较恒定的速度进行以满足细胞的基本需要。4、变构酶除活性中心外，存在着能与变构剂作用的亚基或部位，称调节亚基(或部位)，变构剂与调节亚基以非共价键特异结合，可以改变调节亚基的构象，进而改变催化亚基的构象，从而改变酶活性。凡使酶活性增强的变构剂称变构激活剂(allostericactivitor)，它能使上述S型曲线左移，饱和量的变构激活剂可将S形曲线转变为矩形双曲线。凡使酶活性减弱的变构剂称变构抑制剂(allostericinhibitor)，能使S形曲线右移。例如，ATP是磷酸果糖激酶的变构抑制剂，而ADP、AMP为其变构激活剂。5、由于变构酶动力学不符合米－曼氏酶的动力学，所以当反应速度达到最大速度一半时的底物的浓度，不能用Km表示，而代之以K0.5S表示。正协同效应的变构酶底物活性曲线⊙不加变构剂加变构激活剂加变构抑制剂（三）、生理意义1、在正协同效应的变构酶的S形曲线中段，底物浓度稍有降低，酶的活性明显下降，多酶体系催化的代谢通路可因此而被关闭；反之，底物浓度稍有升高，则酶活性迅速上升，代谢通路又被打开，因此可以通过细胞内底物浓度的变化来灵敏地控制代谢速度。2、变构抑制剂常是代谢通路的终产物，变构酶常处于代谢通路的入口，通过反馈抑制，可以及早地调节整个代谢通路，减少不必要的底物消耗。例如葡萄糖的氧化分解可提供能量使AMP、ADP转变成ATP，当ATP过多时，通过变构抑制剂ATP抑制磷酸果糖激酶的活性，可限制葡萄糖的分解，而ADP、AMP增多时，则可通过变构激活剂AMP、ADP激活磷酸果糖激酶的活性促进糖的分解。随时调节ATP/ADP的水平，可以维持细胞内能量的正常供应。二、共价调节酶1、概念：也称共价修饰酶，指一类可在其它酶的作用下其结构通过共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalentmodificationregulation)，这类酶称为共价修饰酶(prosessingenzyme)。一些酶的巯基发生可逆的氧化还原修饰，一些酶以共价键与磷酸、腺苷等基团的可逆结合，都会引起酶结构的变化而呈现不同的活性。酶的共价修饰是体内代谢调节的另一重要的方式。2、特点：共价修饰酶通常有活性与非活性两种形式，两种形式之间转换的正、逆反应是由不同的酶催化产生。如骨骼肌中的糖原磷酸化酶有高活性的磷酸化形式与低活性的脱磷酸化形式两种，从脱磷酸化形式转化成磷酸化形式是由磷酸化酶b激酶催化，反之，则是有由磷酸化酶磷酸酶催化.

目前已发现有几百种酶被翻译后都需要进行共价修饰，其中一部分处于分支途径，对其代谢流量起调节作用的关键酶，属于这种酶促共价修饰系统。由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能源，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。第七节重要的酶一、同工酶同工酶(isoenzyme)是指催化的化学反应相同，酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。如乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH），具有多种分子组成形式：LDH5（M4）、LDH4（M3H）、LDH3（M2H2）、LDH2（MH3）、LDH1（H4）。

LDH同工酶有组织特异性，LDH1在心肌含量高，而LDH5在肝、骨骼肌含量高。因此，LDH同工酶的相对含量的改变在一定程度上反映了某器官的功能状态，临床上利用这些同工酶在血清中的相对含量的改变作为某脏器病变鉴别诊断的依据。同工酶也是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分化和癌变的有力工具，在酶学、生物学、和医学中均占有重要地位。二、固定酶用物理、化学等方法将水溶性的酶固定到特定的载体上使之成为水不溶性的酶称之为固定酶或固相酶。三、核酶具有催化活性的酶性RNA称为核酶。1981-1982年ThomasR.Cech实验室在研究四膜虫(Tetrahymenathermophiea)的rRNA前体加工成熟时发现第一个有催化活力的天然rRNA，起名“ribozyme”（核酶）。随后，S.Altman和N.R.Pace以及T.R.Cech几个实验室又陆续发现了真正RNA催化剂。其中L19RNA和核糖核酸酶P的RNA组分具有酶活性是两个典型的例子。L19是四膜虫rRNA前体自我剪接释放的内含子，在自身两次环化、开环反应中丢失了19个核苷酸形成的，故名L19RNA。L19RNA有催化寡聚核苷酸底物进行切割和连接反应，具有核糖核酸酶和RNA聚合酶的活性。它具有使底物分子加速反应且反应终了本身不被消耗仍具有催化活性的一般催化剂具有的特性。它对底物还具有专一性，作用C5比U5水解时快得多，对A5和G5无催化活性；此外，它还符合一般酶的米氏动力学规律,并被dC5竞争性抑制。综上所述，L19是一个真正的酶。核酶的发现意义重大，它不仅打破了酶是蛋白质的传统观念，而且还大大促进了有关生物起源，生物进化等问题的进一步探讨。酶的生产和分离纯化所有的生物体在一定的条件下都能产生多种多样的酶。酶在生物体内产生的过程，称为酶的生物合成。经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物、植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产。酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。酶的分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，以获得符合研究或使用要求的酶的过程。其主要内容包括细胞破碎、酶的提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、结晶等。酶的生物合成酶是生命活动的产物，又是生命活动必不可缺的条件之一。酶的生物合成主要是RNA和蛋白质的生物合成过程。RNA的生物合成———转录（一）RNA合成的起始1.原核生物启动子：约55bp,分为起始点（startsite）、结合部位、识别部位。

起始点：转录起始部位以+1表示，转录的第1个核苷酸常为嘌呤G,A。

结合部位：约6bp组成,是高度保守区,共有序列为5'-TATAAT-3',位于起始点上游-10。因Tm低,DNA易解开双链，为RNA聚合酶提供场所。

识别部位：约6bp组成,在-35处,为高度保守区,序列5'-TTGACA-3',s因子识别此部位。2.真核生物启动子（以RNApolⅡ为例）如图所示

于-25处含AT富集区,共有序列TATAA（TATAbox）

-70处含共有序列CAAT,还含许多其它box,例如GCbox,E-box等。

含增强子(enhancer)和静息子(silencer)

RNApolⅠ和RNApolⅢ与聚合酶Ⅱ所识别的启动子差异较大。（二）

链的延长

转录泡：是由DNA双链,RNA聚合酶与新合成的转录本RNA局部形成的结构,它贯穿于延长过程的始终。

过程：在起始阶段形成第一个磷酸二酯键后，RNA聚合酶核心酶沿模板向下游移动，核苷酸之间以3',5'磷酸二酯键相连，合成方向5'→3'，合成的RNA自3'末端逐步延长。合成出的RNA与DNA形成杂交分子,约12bp，因结合不紧很易脱离。（三）

RNA合成的终止：合成移到终止信号时,酶不滑动,聚合停止,转录完成。

特点：ρ因子参与的终止：r因子与RNA产物中富含C的部位结合,并诱使RNA聚合酶构象改变停止滑动;ρ因子的解螺旋酶活性,利于RNA产物的释放。

其它终止方式：GC区形成的发卡结构阻碍RNA聚合酶的行进，聚U区使配对不稳定,以利于RNA产物的释放。蛋白质的生物合成——翻译以mRNA为模板，以各种氨基酸为底物，在核糖核蛋白体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程，称为翻译。翻译是将mRNA分子上的碱基排列次序转变为多肽链上氨基酸排列次序的过程。不同的生物，其蛋白质的生物合成过程虽然有些差别，但是基本过程均包括氨基酸活化、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止及新生肽链的加工等。（一）、蛋白质合成的起始１、核糖体激活起始因子（ＩＦ）激活由３０Ｓ，５０Ｓ亚基组成的无活性核糖体（７０Ｓ）。２、起始复合物的形成３０Ｓ－ＩＦ３复合物，mＲＮＡ和起始氨基酰tＲＮＡ结合成起始复合物。此步需消耗ＧＴＰ。3、５０Ｓ亚基与起始复合物的结合起始复合物与５０Ｓ亚基结合，则起始因子ＩＦ从３０Ｓ亚基中释放出来，作用与下一个核糖体的起始作用。（二）、肽链延伸包括结合，转肽，移位三个步骤。（三）、肽链合成终止在接肽过程中，当核糖体沿mＲＮＡ移动到终止密码子ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧ时，肽链合成便自动终止。酶生物合成的调节根据机体内酶的合成对环境影响的反应不同，可分为两大类：一类是构成酶或组成酶；另一类酶，它的合成量受环境营养条件及细胞内有关因子的影响，有的随环境条件变化酶的合成量增加，称为诱导酶，相反，酶合成随环境条件改变而降低，称为阻遏酶。概述酶的诱导和阻遏是在调节基因产物阻遏蛋白的作用下，通过操纵基因控制结构基因或基因组的转录而发生的。由于经济的原则，细菌通常并不合成那些在代谢上无用的酶，因此一些分解代谢的酶类只在有关的底物或底物类似物存在时才被诱导合成；而一些合成代谢的酶类在产物或产物类似物足够量存在时，其合成被阻遏。在酶诱导时，阻遏蛋白与诱导物相结合，因而失去封闭操纵基因的能力。在酶阻遏时，原来无活性的阻遏蛋白与辅阻遏物，即各种生物合成途径的终产物（或产物类似物）相结合而被活化，从而封闭了操纵基因。（二）诱导机制在正常条件下，大肠杆菌细胞内的β—半乳糖苷酶的量极少，但在培养基中加入乳糖后这种酶的量就大大增加。（三）阻遏机制酶的阻遏与酶的诱导现象非常相似，可以用一个统一的理论来解释。在合成代谢中，产物的积累可反作用于酶的合成，即阻遏。1.

终产物阻遏调节在合成代谢中，某些合成产物可作为辅阻遏物与调节基因产生的阻遏蛋白结合，这种结合使基因关闭，酶的合成反应也因此减慢而停止。这种由于终产物的积累而抑制酶的合成常常被称为反馈阻遏2.

自身阻遏调节组氨酸的生物合成是通过10步反应完成的，催化这10步反应的酶由9个结构基因决定，这9个结构基因和一个操纵基因构成组氨酸操纵子。3.

降解物阻遏大肠杆菌在只含乳糖而不含葡萄糖的培养基上生长，必须经过一段生长停顿的时间，在这段时间内逐渐诱导形成能使乳糖进入细胞的透性酶以及分解乳糖的β—半乳糖苷酶。酶的发酵生产酶的发酵生产的前提之一，是根据产酶的需要，选育到性能优良的产酶细胞。优良的产酶细胞应具备下列条件：（1）酶的产量高；（2）容易培养和管理；（3）产酶性能稳定；（4）利于酶产品的分离纯化；（5）安全可靠。目前工业上应用的酶都采用微生物细胞发酵生产。酶生产常用微生物菌种的分离筛选（一）常用的产酶微生物现在大多数酶都采用微生物细胞进行发酵生产。微生物具有种类多，繁殖快，容易培养代谢能力强等特点，有不少性能优良的产酶菌株已在菌的发酵生产中广泛应用。现把常用的产酶微生物简介如下：1.枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)枯单芽抱杆菌是应用最广泛的产酶微生物之一。枯草杆菌是芽胞杆菌属细菌。细胞成杆状，大小为0.7~0.8x2~3μm，单个，无荚膜，周生鞭毛，运动，革兰氏染色阳性。曲落粗糙，不透明，污白色或微带黄色。此菌用途很广，可用于生产α—淀粉酶、蛋白酶、β—葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。例如，枯草杆菌BF7658是国内用于生产α—淀粉酶的主要菌株；枯草杆菌AS1.398可用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶。枯草杆菌生产的α—淀粉酶和蛋白酶都是胞外酶。而碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。2.大肠杆菌(Escherichiacoli)大肠杆菌细胞呈杆状，大小为0.5×1.0~3.0μm，革兰氏染色阴性，无芽胞，菌落从白色到黄白色，光滑闲光，扩展。大肠杆菌可生产多种多样的酶，一般都属于胞内酶，需经过细胞破碎才能分离得到。例如，谷氨酸脱羧酶，用于测定谷氨酸含量或生产γ—氨基丁酸；天门冬氨酸酶，催化廷胡素酸加氨生成L—天门冬氨酸；苄青霉素酰化酶，生产新的半合成青霉素或头孢霉素；β—半乳糖苷酶，用于分解乳糖；限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶，在基因工程方面应用。3.黑曲霉(Aspergillusniger)黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生胞子球形，平滑或粗糙。黑曲霉可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。如，糖化酶、α—淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核搪核酸酶、脂肪酶、纤维素酶、橙皮苷酶、柚苷酶等。4.米曲霉(Aspergillusoryzae)米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般为黄绿色，后变为黄褐色，分生袍子头呈放射形，顶裹囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑少数有刺，分生孢子梗长2mm左右，粗糙。米曲霉可用于生产糖化酶和蛋白酶，这在我国传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用。此外，米曲霉还用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶P1、果胶酶等。5.青霉(Penicillium)青霉属半知菌纲。营养菌丝无色，淡色，有横隔，分生孢子枝亦有横隔，顶端形成扫帚状的分枝，小梗顶端串生分生孢子，分生孢子球形，椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。青霉菌分布广泛，种类很多。其中产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶(主要作用于青霉素V)、果胶酶、纤维素酶Cx等；桔青霉(Penicilliumcitrinum)用于生产5’—磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核竣曲Sl、核酸酶P1等．6.木霉(Trichoderma)木霉属于半知菌纲。生长时菌落呈棉絮状或致密丛束状，菌落表面呈不同程度的绿色。菌丝透明，有分隔，分枝繁复，分枝末端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或单生，分生孢子由小梗相继生出，靠粘液把它们聚集成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形或椭圆形，透明或亮黄绿色。木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉产生的纤维素酶中包含有Cl酶、Cx酶和纤维二糖酶等。此外，木霉中含有较强的l7α羟化酶，常用于甾体转化。7.根霉(Rhizopus)根霉生长时，由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐枝的末端生出假根，在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊，囊内生孢子囊孢子，孢子呈球形、卵形或不规则形状。根霉用于生产糖化酶、α—淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。根霉有强的ll—α羟化酶，是用于甾体转化的重要菌株。8.毛霉(Mucor)毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，苗丝体上直接生山孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针状的草酸钙结晶。毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。9.链霉菌(Streptomyces)链霉菌是一种放线菌。形成分校的菌丝体。有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝体不断裂，只有气生茵丝体形成孢子链。链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白面、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可用于甾体转化。10.啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)啤洒酵母是在工业上广泛应用的酵母，细胞由圆形、卵形、椭圆形到腊肠形。在麦芽汁琼脂培养基上菌落为白色，有光泽，平滑，边缘整齐。营养细胞可以直接变为子囊，每个子囊含有l~4个圆形光亮的子囊孢子。啤酒酵母主要用于酿造啤酒、酒精、饮料酒和面包制造。在酶的生产方面，用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。11.假丝酵母(Candida)假丝酵母的细胞圆形、卵形或长形。无性繁殖为多边芽殖，形成假菌丝，可生成厚垣孢子、无节孢子、子囊孢子。不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上菌落呈乳白色或奶油色。假丝酵母是单细胞蛋白的主要生产菌。在酶工程方面可用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶。假丝酵母具有烷类代谢的酶系，可用于石油发酵；具有较强的17羟基化酶，可用于甾体转化制造睾丸素等。菌种的分离筛选与遗传育种菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。优良菌种不仅能提高酶制剂产量、发酵原料的利用效率，而且还与增加品种，缩短生产周期，改进发酵和提炼工艺等密切相关。自然界是生产菌种的主要来源；但直接分离得到的往往不能立即用于生产，还需经过一系列的遗传育种步骤。优良菌种的性状也不是固定不变的，因此在使用过程中要建立科学的管理制度和保藏方法，防止菌种的污染和退化。从自然界分离筛选（1）含菌样品的采集；（2）富集培养；（3）菌种纯化：稀释法和划线法。菌种变异（1）用物理或化学方法诱变（2）用基因操作技术提高菌种的产酶能力酶的发酵工艺条件及控制酶的发酵生产是以获得大量所需的酶为目的。为此，除了选择性能优良的产酶细胞以外，还必须满足细胞生长、繁殖和发酵产酶的各种工艺条件，并要根据发酵过程的变化进行优化控制。活化与扩大培养性能优良的产酶细胞选育出来以后，必须尽可能保持其生长和产酶特性不变异，不死亡，不被杂菌污染等。保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力，这就叫做细胞活化。（二）培养基的配制培养基是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。培养基有多种多样，千差万别。但培养基的组分一般包括碳源、氮源、无机盐和生长因素等几方面。1．碳源碳源是指能够向细胞提供碳素化合物物的营养物质。通常碳源同时也是提供能量的能源。在选择碳源时，必须考虑原科的供求和价格问题。目前，在酶发酵生产中最常用的碳源是淀粉及其水解物，如：糊精、麦芽糖、葡萄糖等。2．氮源氮是组成细胞蛋白质和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要功组成元素。凡能够向细胞提供氮元素的营养物质称为氮源。氮源可分为有机氮源和无机氮源两种。有机氮源主要是各种蛋白质及其水解产物。无机氮源是含氮的各种无机化合构。此外，碳和氮两者的比例对酶的产量有显著的影响。所谓碳氮比(C／N)一般是指培养基中碳元素(C)的总量与氮元素(N)总量之比。可通过测定或计算培养基中碳和氮的含量而求出。有时也采用培养基中碳源总量和氮源总量之比来表示碳氮比。–使用时要注意两种比值是不同的。3．无机盐无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位和渗透压起调节作用。根据细胞对无机元素需要量的大小，可分为主要元素(大量元素)和微量元素两大类。主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但需要量很少，过量反而会引起不良效果，必须严加控制。4．生长因素生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化合物，主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动植物生长激素等。pH值的调节培养基的pH值与细胞的生长繁殖以及发酵产酶都有密切关系，故必须进行必要的调节控制。不同细胞生长繁殖的最适pH值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适pH值为中性或微碱性（pH6.5~8.0)；霉菌和酵母的生长最适pH值为偏酸性(pH4.0~6.0)；植物细胞生长的最适pH值为5~6。细胞发酵产酶的最适pH值通常接近于该酶反应的最适pH值。所以在细胞培养和发酵过程中，必须对培养基的pH值进行适当的控制和调节。pH值的调节可以通过改变培养基的组分或其比例来实现。必要时可使用缓冲溶液，或添加适宜的酸、碱溶液，以调节控制培养基中pH值的变化。（四）温度的调节控制温度是影响细胞生长繁殖和发酵产酶的重要因素之一。不同的细胞有各自不同的最适生长温度。细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所不同，而月往往低于最适生长温度，这是由于在较低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。在细胞生长和发酵产酶过得中，由于细胞的新陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温度降低，两者综合，决定了培养基的温度．–温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温，故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。（五）溶解氧的调节控制细胞的生长繁殖以及酶的生物合成过程需要大量的能量。为了满足细胞生长和发酵产酶的需要，培养基中的能源物质(一般是碳源提供)必须经有氧降解才能产生大量的ATP。为此，必须供给充足的氧气。在培养基中生长和发酵产酶的细胞，一般只能利用溶解在培养基中的氧气——溶解氧。由于氧是难溶于水的气体，培养基中含有的溶解氧并不多，很快就会被细胞利用完。为此，必须在发酵过程中连续不断地供给无菌空气，使培养基中的溶解氧保持在一定水平，以满足细胞生长和产酶的需要。调节溶氧速率的方法，主要有下列几种：(1)调节通气量(2)调节氧的分压：(3)调节气液接触时间：(4)调节气液接触面积(5)调节培养液粘度（六）提高酶产量的措施在酶的发酵生产过程中，为了提高酶产量，除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条件并根据需要和变化情况及时加以调节控制以外，还可以来取某些行之有效的措施，诸如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表面活性剂或其他产酶促进剂等。1.添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。诱导物一般可分为3类：(1)酶的作用底物(2)酶的反应产物(3)酶的底物类似物2.控制阻遏物浓度如前所述，有些酶的生物合成受到阻遏物的阻遏作用。为了提高酶产量，必须设法解除阻遏作用。阻遏作用有产物阻退和分解代谢物阻遏两种。阻遏物可以是酶催化反应产物，代谢途径的末端产物以及分解代谢物(葡萄糖等容易利用的碳源)。控制阻遏物浓度是解除阻遏、提高梅产量的有效措施。3．添加表面活性剂表面活性剂可分为离子型和非离子型两大类。离子型表面活性剂又有阳离子型．阴离子型和两性离子型之别。由于离子型表面活性剂有些对细胞有毒害作用，特别是季胺型离子表面活性剂(如“新洁而灭”等)是消毒剂。不能用于酶的发酵生产。4．添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但作用机理并未阐明清楚的物质。添加产酶促进剂往往对提高酶产量有显著效果。动、植物细胞发酵产酶利用植物细胞和动物细胞发酵生产各种天然产物，是生物工程研究和开发的新领域。动物细胞和植物细胞均可以在人工控制条件的生物反应器中，如同微生物细胞那样，发酵生产而获得各种所需的产物。微生物、植物、动物细胞之间有不同的特性。植物细胞发酵产酶1.发酵的特点–植物细胞发酵技术首先从植物组织中选育出植物细胞，再经过筛选、诱变、原生质体融合或DNA重组等技术而获得高产、稳定的植物细胞。然后，用植物细胞在人工控制条件的植物细胞反应器中，如同微生物细胞那样，进行发酵而获得各种所需的产物。植物细胞发酵生产天然产物与从植物中提取分离这些物质相比较，具有如下特点：1．提高产率使用高产稳定的植物细胞进行发酵，可明显提高天然产物的产率。2．缩短周期3．易于管理，减轻劳动强度4．提高产品质量2.植物细胞发酵产酶的工艺条件控制（1）植物细胞生长和发酵所使用的培养基（2）温度和pH值（3）通风与搅拌（4）前体的添加（5）刺激剂的应用动物细胞发酵动物细胞可以产生各种有较高价值的物质。特别是激素、疫苗、单克隆抗体和酶等各种动物功能蛋白质，通过动物细胞培养和发酵得到的动物功能蛋白主要有如下几种：1.疫苗：脊髓灰质炎(小儿麻痹症)疫苗，牲畜口蹄疫疫苗，风疹疫苗，麻疹疫苗，腮腺炎疫苗，黄热病疫苗，狂犬病疫苗，肝炎疫苗等。2.激素：催乳激素，生长激素，前列腺素，促性腺激素，淋巴细胞活素，白细胞间质素，干扰素，胰岛素等。3.酶：胶原酶，血纤维蛋白溶酶原活性剂等。4.单克隆抗体：通过杂交瘤细胞等动物细胞培养生产各种单克隆抗体。动物细胞培养方法可分成两大类。一类是来自血液、淋巴组织的细胞、肿癌细胞和杂交瘤细胞等，可以采用悬浮培养。另一类是存在于动物复杂的器官中的细胞，与其周围的细胞互相依存，即有所谓“定位依存’关系，这一类细胞不宜采用悬浮培养，而必须依附在固体或半固体的表面才能生长和进行正常的新陈代谢。定位依存关系的细胞一般采用固定化细胞培养方式。动物细胞的固定化宜采用吸附法或包理法。酶的分离纯化酶的分离纯化是酶工程的主要内容，也是酶学研究过程中必不可少的环节。酶的分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，以获得符合研究或使用要求的酶的过程。其主要内容包括细胞破碎、酶的提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、结晶等。细胞破碎酶的种类繁多，已知的约4000种，它们存在于不同生物体的不同部位。除了动物和植物体液中的酶和微生物胞外酶之外，大多数酶都存在于细胞之中。为了获得细胞内的酶，就得收集细胞并进行细胞或组织破碎。对于不同的生物体，或同一生物体的不同组织的细胞，由于结构不同，所采用的细胞破碎方法和条件亦有所不同，必须根据具体情况进行适当的选择，以达到预期的效果。细胞破碎的方法很多，可以分为机械破碎法、微量破碎法、化学破碎法和酶促破碎法等。机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法，称为机械破碎法。常用的破碎机械有：（1）组织捣碎机（2）细胞研磨器（3）匀浆器物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。常用的物理破碎法方法有：（1）温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热胀冷缩的作用而破碎。（2）压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。（3）超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的10~20kHz的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（cavitation）而使细胞破碎。化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法，称为化学破碎法。–常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。–有机溶剂处理–表面活性剂处理酶学破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的目的。–利用细胞本身的酶系的作用，在一定的pH值和温度条件下保温一段时间，使细胞破坏，而使细胞内物质释出的方法，称为自溶法。自溶法效果的好坏取决于温度、pH值、离子强度等自溶条件的选择与控制。–根据细胞外层结构的特点，还可以外加适当的酶作用于细胞，使细胞壁受到破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。例如，革兰氏阳性菌主要依靠肽多糖维持细胞壁的结构和形状，外加溶菌酶，作用于肽多糖的β-1，4-糖苷键，而使其细胞壁破坏；酵母细胞的破碎是外加!-葡聚糖酶，使其细胞壁的β-1，3-葡聚糖水解；霉菌可用几丁质酶机械细胞破碎；纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的混合使用，对植物细胞壁有良好的破碎效果。酶的提取酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。酶都能溶解于水，可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取。有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中要注意控制好温度、pH值等提取条件。根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。酶提取的主要方法1.盐溶液提取大多数蛋白类酶（P-酶）都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度增加，这称为盐溶现象，所以一般采用稀盐溶液进行酶的提取。例如，固体发酵生产的麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞外酶，用0.14mol/L的氯化钠溶液或0.02~0.05mol/L的磷酸缓冲液提取；枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1mol/L氯化镁溶液提取等。有少数酶，如霉菌脂肪酶，用清水提取的效果较好。核酸类酶（R-酶）的提取，一般是在细胞破碎后，用0.14mol/L的氯化钠溶液提取，得到核糖核蛋白提取液，再进一步与蛋白质等杂质分离，而得到酶RNA。2.酸溶液提取有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。例如，胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取。3.碱溶液提取有些在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好的酶，应采用碱溶液提取。例如，细菌L-天冬酰胺酶可用pH11~12的碱溶液碱性提取。4.有机溶剂提取有些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的P-酶，可以采用与水可混溶的丁醇等有机溶剂提取。例如，琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶等的提取。在R-酶的提取中，经常采用苯酚水溶液。一般是在细胞破碎、制成匀浆后，加入等体积的90%苯酚水溶液，振荡一段时间，结果DNA和蛋白质沉淀于苯酚层，而RNA溶解于水中。酶提取过程的注意事项在酶提取过程中，为了防止酶变性失活，温度不宜高，尤其是采用有机溶剂提取时，温度应该控制在0~10℃。有些酶对温度的耐受性较高，可在室温或更高一些的温度条件下提取。为了提高酶的溶解度，提取时pH酶的分离纯化分离纯化提取活性的酶或蛋白质必须保持天然活性状态；分离纯化的一般步骤：材料的选择→原料的预处理→蛋白质的抽提→从抽提液中沉淀蛋白质→纯化→蛋白质的结晶；分离纯化的方法主要根据蛋白质分子的大小、溶解度、带电荷不同等性质。根据分子大小不同的分离方法1.离心离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。离心机多种多样，按照离心机的最大转速的不同可以分为常速（低速）、高速和超速等3种。–常速离心机的最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104g–高速离心机的最大转速为1×104~2.5×104r/min，相对离心力达到1×104g~1×105g，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。超速离心机的最大转速达2.5×104~8×104r/min，相对离心力可以高达5–超速离心可以采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。超速离心可用于酶分子的分离纯化。在离心过程中，应该根据需要，选择好离心力（或离心速度）和离心时间，并且控制好温度和pH值等条件。离心方法可分为差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心等。–差速离心是采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。差速离心主要用于分离那些大小和密度差异较大的颗粒，操作简单、方便，但分离效果较差。–密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带离心方法。–当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心力作用下，不同浮力密度的物质颗粒或向下沉降，或向上飘浮，一直移动到与它们各自浮力密度恰好相等的位置（等密度点）形成区带，即为等密度梯度离心。过滤与膜分离（1）过滤过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等，其中以各种高分子膜为过滤介质的过滤技术称为膜分离技术。微滤、超滤、