医疗器械无菌检验操作规程

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医疗器械产品无菌检验操作规程

1目的

通过无菌检验，确保灭菌后产品能够达到无菌的要求。

2适用范围

适用于灭菌后医疗器械产品〔列举〕的无菌检验。

3检验依据

本厂产品注册标准〔编号〕

EN1174-1996医疗器械灭菌产品中微生物数量的评估

《中国药典》〔2022年版〕

GB14233.2-2022医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法

GB15980-1995一次性运用医疗用品卫生标准

4仪器、设备

百级层流超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培育箱、霉菌培育箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪〔器〕、电子天平、PH计、冰箱、恒温水浴锅、酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管架，大试管假设干等。5无菌检验室的环境要求

5.1无菌检验应在环境干净度10000级下的局部百级的单向流空气区域内进行。

5.2缓冲区与外界环境、无菌检验室与缓冲区之间空气应保持正压，阳性对比室与缓冲区之间空气应保持负压。无菌检验室与室外大气之间静压差应大于10Pa。无菌检验室的室温应保持18～26℃，相对湿度：45～65%。

5.3无菌检验室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业干净室〔区〕悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测。每年至少检测一次。

5.4无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数：每次操作时在层流空气所及台面的左中右置3个营养琼脂平板，暴露30min，于30～35℃培育48小时，菌落数平均应不超过1CFU/平板。6无菌检验前的预备

6.1器具灭菌、消毒

6.1.1灭菌：试验过程中与供试品接触的全部器具需要采纳牢靠方法灭菌。可经电热干燥箱160℃以上干烤2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30分钟后运用〔依据灭菌效果验证决断灭菌参数〕。全部的灭菌物品不应超过2周即用毕，否那么应重新灭菌。

6.1.2消毒：凡检验中运用的器材无法灭菌处理的，运用前需要经消毒处理。如无菌检验室的试管架、电子天平、工作台面、工作人员的手、橡胶吸头等。可采纳消毒剂浸泡或擦拭。消毒剂应每月更换，以防止产生耐药菌株。

6.1.3标识：器具的灭菌、消毒后需要做好标识，标明灭菌、消毒时间和运用有效期。

6.2人员、物料进入无菌检验室

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6.2.1开启紫外线灯或臭氧发生器进行空间灭菌处理，消毒时间不得少于30min。

6.2.2物料进入无菌检验室流程

6.2.2.1脱包：进入无菌检验室的物品假设有双重包装的，需将外包装在传递窗/缓冲间拆除后，传入试验室。

6.2.2.2消毒：进入无菌操作室的全部培育基、供试品等的外表都应采纳适用的方法进行消毒处理，以避开将外包装污染的微生物带入无菌检验室。

6.2.2.3传递：查看全部进入无菌检验室的器具上的灭菌、消毒标识，是否在有效期内。符合要求的经传递窗传入无菌检验室。

6.2.3人员进入无菌检验室流程

6.2.3.1更鞋脱衣：在一更区脱去一般区工作鞋，穿上无菌检验室工作鞋；脱去一般区工作服。

6.2.3.2洗手：首先用肥皂或洗手液在手上揉擦出泡沫，再用流水连续冲洗20秒，洗净泡沫。

6.2.3.3更衣：在二更区根据从上到下的顺次穿戴无菌工作服〔包括衣、帽、口罩等〕，要求裤子掖在上衣里，口罩掩住口鼻，帽子包裹全部头发。

6.2.3.4手消毒：用消毒液浸泡双手5秒以上或用浸过消毒液的棉球擦拭双手。消毒液可用洗必泰、新洁尔灭、碘伏、75%酒精等。

6.2.3.5人员进入：经缓冲间进入无菌检验室。

6.2.4人员进入无菌检验室后，进一步用消毒液擦拭工作台面，戴无菌手套。

7无菌检验操作要求

7.1全过程需要严格执行无菌操作，防止微生物污染。

7.2运用玻璃器皿应轻取轻放，避开破损，以防培育物扩散。

7.3全部操作均应在近火焰区进行，且不得有大幅度或快速动作，以免搅动空气中的尘埃微粒。

7.4运用金属接种器具时，用前、用后均需灼烧灭菌。

7.5在接种培育物时，动作应轻、准，防止培育物溅出，产生汽溶胶，造成污染。

7.6操作过程中全部的带菌物品，用后均应作消毒、灭菌处理。可在检验过程中随用随时放入消毒液缸内浸泡或消毒桶内，或在检验完成后经传递窗传至一般区，马上用压力蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟。

8培育基制备

8.1需气菌、厌气菌培育基〔硫乙醇酸盐流体培育基〕的制备

8.1.1所用试剂

酪胨〔胰酶水解〕15.0g

葡萄糖5.0g

L-胱氨酸0.5g

硫乙醇酸钠0.5g

〔或硫乙醇酸〕〔0.3ml〕

酵母浸出粉5.0g

氯化钠2.5g

新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml

琼脂0.75g

水1000ml

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8.1.2制备

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调整pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调整pH为7.10.2。

8.1.3硫乙醇酸盐流体培育剂氧化层的颜色要求

在供试品接种前，培育基氧化层的高度不得超过培育基深度的1/5，否刚需经100℃水浴加热到粉红色消逝〔不超过20分钟〕快速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。

8.2霉菌培育基〔改良马丁培育基〕的制备

8.2.1所用试剂

胨5.0g

酵母浸出粉2.0g

葡萄糖20.0g

磷酸二氢钾1.0g

硫酸镁0.5g

水1000ml

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8.2.2制备

除葡萄糖外，取上述成分混和，微温溶解，调整pH值约为6.8，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调整pH为6.40.2。

8.3还可运用按处方生产的符合规定的脱水培育基，根据运用说明书配制。

8.4培育基配制后应尽快灭菌，避开微生物繁殖。一般采纳高压蒸汽121℃灭菌30分钟。

8.5制备好的培育基应在2～25℃保存，在3周内运用。

8.6培育基的无菌性检查

每批配制的培育基均应进行无菌性检查〔可与产品无菌检验同步进行〕。检查时，每批培育基随机取不少于5支〔瓶〕培育14天，应无菌生长。

9稀释液、冲洗液的制备

9.10.1%蛋白胨水溶液

取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30分钟后，于4℃保存备用。,分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30分钟后，于4℃保存备用

9.2pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液

取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钾7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml。微温溶解，滤清，分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30分钟后，于4℃保存备用。

9.3浸提介质：9g/L无菌氯化钠溶液，可径直从有证单位收购大输液。

10对比菌液制备

10.1无菌检验所用的菌株传代次数不得超过5代。

10.2取金黄色葡萄球的一般琼脂斜面培育物，接种一白金耳至营养琼脂培育基内，在30～35℃培育18～24h后备用，同时制备0.9%氯化钠溶液加入在6支小试管内，每支试管内加9.0ml的0.9%氯化钠溶液，在压力锅内经121℃灭菌30min备用。将已配好的金黄色葡萄球菌培育菌液取1.0ml加入第一支小试管内，稀释成浓度1:10的菌液；取第一支试管内1.0ml菌液加入第二支小试管内，稀释成浓度1:100的菌液，同法稀释成浓度1:106〔每ml含菌量≤100CFU〕即可。

10.3采纳平皿计数法测定活菌数。

11无菌检验培育温度

硫乙醇酸盐流体培育基，置30～35℃培育。

改良马丁培育基，置23～28℃培育。

12无菌检验

12.1如产品注册标准中明确“产品应经过一个确认过的灭菌过程”，那么执行12.1项下各项。

12.1.1放样

每个灭菌批次按已验证的灭菌工艺，在灭菌柜内相应的位置放置适量菌片，灭菌后对菌片进行无菌检验。

12.1.2菌片贮存

灭菌前、后菌片应按菌片说明书规定条件保存。〔REVEN公司菌贮存温度为15～27℃〕

12.1.3接种

开启超净工作台单向层流，在此环境下，分别将灭菌后的菌片成对放入已灭菌的硫乙醇酸盐流体培育基中。同时以金黄色葡萄球菌作阳性对比，以未接种的硫乙醇酸盐流体培育基和未接种的改良马丁培育基作为阴性对比。

12.1.4培育

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阳性对比管于30～35℃细菌培育箱培育48～72小时。

其余硫乙醇酸盐流体培育基于30～35℃培育7天。

改良马丁培育基于23～28℃培育7天。

12.1.5结果判定

培育后，阳性对比应有菌生长，阴性对比和被检样品未见需气菌、厌气菌和霉菌生长的为合格。12.2如产品注册标准中明确产品应进行无菌检验，那么执行12.2.1～12.2.5。

12.2.1抽样

依据各自的产品注册标准和相应产品出厂检验规程的规定，对成品库内的产品进行抽样。一般同一个灭菌批产品检验3～11个单位供试品。

12.2.2供试液预备

优先采纳将供试品或其有代表性的各部分径直投放入培育基内培育的方法，如供试品不相宜径直投放，可按以下方法制备供试液，应使浸提介质充分洗提供试品的浸提表面，供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后2小时内运用。

依据供试品详细特性选择以下方法：

a)管类器具：按管内表面积每10cm2流过管内腔1ml浸提介质，流量约为10ml/min，收集到无菌的容器内。

b)容器类器具：按容器内表面积每10cm2加入浸提介质1ml的比例，振摇数次。

c)实体类器具：实体类器具按表面及每10cm2加入浸提介质1ml，振摇数次。

收集上述冲洗液或浸提介质于无菌容器中。

12.2.3接种

12.2.3.1薄膜过滤法：优先采纳封闭式薄膜过滤器〔集菌器〕，也可运用开放式薄膜过滤器。滤膜孔经不大于0.45ｍ。滤器和滤膜运用前应采纳相宜的方法灭菌，或径直采纳无菌集菌器。

a、如采纳封闭式薄膜过滤器，取一副三联式集菌器，将供试液通过集菌仪过滤，使通过每只培育管的量基本匀称。然后通过集菌仪一只加120ml改良马丁培育基，另两只分别加入120ml硫乙醇酸盐培育基〔其中一只做阳性对比，内加金黄色葡萄球菌液1ml〕。另取一副二联集菌器，用同批的冲洗液或浸提介质120ml通过集菌仪过滤〔每只约50ml〕，同法一只加硫乙醇酸盐培育基120ml，另一只加改良马丁培育基120ml分别作阴性对比。

b、如用一般薄膜过滤器，将供试液过滤后取出滤膜，将其剪成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培育基及改良马丁培育基的容器中，其中两份作检验，一份作阳性对比。

12.2.3.2径直接种法：适用于一次性运用注射针、一次性运用静脉输液针〔包括输液器、输血器、注射器配套运用注射针〕。

a、敷料供试品：取规定数量，每个包装以无菌操作拆开，于不同部位剪取约120mg或1cm3cm的供试品，接种于各管足以浸没供试品的适量培育基中。

b、无菌针头：径直投入含15ml以上硫乙醇酸盐流体培育基及改良马丁培育基的容器中。

c、一次性运用的材料：拆散或切成小碎断，接种于各管足以浸没供试品的适量培育基中。

供试品按规定量分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培育基及改良马丁培育基的容器中，其中一份作阳性对比。

每个容器中培育基的用量应符合：接种的供试品体积不得大于培育基体积的10%，或培育基的装量足以浸没供试品。

每管培育基的最低用量——硫乙醇酸盐流体培育基每管装量不少于15ml，改良马丁培育基每管装量不

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少于10ml.

12.2.4培育、观测

上述含培育基的容器分别置规定温度的恒温培育箱中，除阳性对比管培育48～72小时外，其余管培育14天。培育期间应逐日观测并记录是否有菌生长。

如在加入供试品后、或在培育过程中，培育基涌现浑浊，培育14天后，不能从外观上判断有无微生物生产，可取该培育液适量转种至同种新鲜培育基中或划线接种于斜面培育基上，细菌培育2天，真菌培育3天，观测是否再涌现浑浊或斜面有无菌生长；或取培育液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。

12.2.5结果判断

培育结束后，阳性对比管应有菌生长，阴性对管应澄清。否那么，就判结果无