染色体工程概述

染色体工程主要内容定义多倍体育种单倍体育种：动物的单体生殖雌、雄核发育：人工单性生殖人工染色体(YAC)染色体显微镜操作技术染色体微克隆染色体转移技术第一部分Part

One染色体工程的定义染色体工程是指人们按设计有计划削减、添加和代换同种或异种染色体的方法和技术。也称为染色体操作。染色体工程的基本程序是人工杂交，细胞学鉴定，在杂种或杂种后代中筛选所需要的材料。以普通小麦为例，常用的材料如下：单体与缺体系统；三体系统；异附加系；异代换系；易位系。多倍体育种(1)定义：多倍体育种是利用人工诱变或自然变异筛选等途径，获得多倍体材料，用以选育多倍体新品种的技术。(2)历史背景植物领域：巨大月见草为第一个多倍体。三倍体欧洲山杨是最早林木多倍体。动物领域：1939年，Fankhauser和Griffiths首先成功培育两栖类三倍体。多倍体育种的优势多倍体草莓多倍体植物的性状比原来的二倍体气孔、花、果实和种子比二倍体者为大，叶肉较厚，茎秆也较粗壮。四倍体鲫鱼多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类都具有良好的生存力和生长率。多倍体技术方法秋水仙素法培育无籽西瓜010203生物诱变法：动物通过杂交方法尤其是种间杂交获得异源多倍体。种间杂交导致第二极体不排出。植物包括胚乳培养、体细胞杂交等。化学诱变法：利用化学物质诱导多倍体。常用的化学物质有：细胞松弛素B、秋水仙素，还有麻醉剂、聚乙二醇。物理诱变法：温度激变（温度休克法）、机械损伤、电离辐射、离心、水静压法和高盐高碱法等。Part

Two第二部分单倍体育种：动物的单性生殖孤雌生殖单性生殖仅由雄性配子或者雌性配子发育成单性个体的生殖方式叫做动物的单性生殖。是指精子单独发育为单倍体，或者精卵结合后，卵核在受精前失活，由精核在卵细胞内单独发育成单倍体，因此只含有一套雄配子染色体。自然界，动物的孤雄生殖几乎是不存在的。卵子单独发育为单倍体，或是指精核进入卵细胞后未与卵核融合而退化，卵核未经受精而依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为。其子代的遗传物质完全来自雌核，只具有母本的性状。孤雄生殖单倍体的特点和优越性育种上具有极高价值，可获得纯合二倍体。提高选育效率。能克服远缘杂交的不孕性，创造出新物种。可克服杂种分离的困难，缩短杂交育种时间，一年可获自交系，两年可获纯系。具有一套染色体，每个基因都能表现相应的性状，易发现产生的突变，尤其是隐性突变，所以单倍体是研究基因或基因剂量效应，进行染色体遗传分析的理想实验材料。单倍体的特点单倍体的优越性雌、雄核发育：人工单性生殖是指因经过紫外线、X射线或γ射线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育为完全为父本性状的二倍体。自然界里一些无脊椎动物和鱼类等存在此现象，用于鱼类研究。研究较少。假受精，指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，精子在染色体中很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行的一种发育方式。雌核发育雄核发育人工诱导雌核发育的方法要达到实验性二倍体雌核发育目的，必须解决两个问题：①精细胞遗传物质失活②阻止雌性个体染色体数目的减少精子遗传物质的失活物理方法：辐射方法处理包括紫外线、X射线、伽马射线。化学方法：甲苯胺蓝，乙烯尿素，二甲基硫酸等化学物质其机理是与精子DNA相互作用。显微操作方法：直接去除受精卵中雄性原核，再在第一次卵裂时期二倍体化，而得到雌核发育的二倍体。雌核染色体二倍体化利用保留卵球第二极体，或阻碍受精卵早期有丝分裂，都可二倍体化。如温度冷休克、热休克、流体静水压、细胞松弛素B、聚乙二醇处理等，已在鱼类实现。雌核发育的鉴别通常以颜色形态、生化、细胞学等指标为依据，鉴别雌核发育的个体。雌核发育囊胚细胞中只出现一套来自雌核的染色体。雌核发育的鉴别用遗传标志鉴别雄核发育的二倍体化，即由第一次有丝分裂的阻碍，还是由保留极体而来。假如二倍体源自第一次有丝分裂的抑制，杂合雌性个体的子代都是纯合型；而如果是通过阻止第二极体的外排产生的雌核发育个体，则子代的情况取决于着丝点与基因间的距离。在着丝点-基因距离远离时，将明显增加杂合型子代的比例。雌核发育的意义生产单性种群已经成功地得到100％草鱼、鲤鱼的雌性个体，但也会导致后代近亲繁殖的衰退，因此其实际应用价值有待研究。产生同源型二倍体育种为基础生物学研究提供了一种优越的研究品系。为遗传学研究提供某些致死突变种的生物品质，成为个体发育研究和遗传育种实践的好材料。农牧渔业生产通过雌核发育引入单性雌体子代，人工控制性别，获得优质高产品系。第三部分Part

Three人工染色体的定义指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。人工染色体为基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析提供了有用的工具。常见的人工染色体以BAC和YAC应用最广泛酵母人工染色体(YAC)细菌人工染色体(BAC)P1派生人工染色体(PAC)哺乳动物人工染色体(MAC)人类游离人工染色体(HAEC)保持酵母染色体稳定三个要素3复制点DNA1着丝粒DNA着丝粒DNA2端粒DNAYAC克隆技术早期插入的外源DNA片段，限制在100~200kb左右，难以获得更长的DNA片段，原因是当时所采用的生物化学方法，在提取细胞总DNA时，不可避免的要发生DNA断裂及降解，后来低熔点琼脂糖包埋法及脉冲电源技术的出现，使得对于大基因合大基因簇的分析成为可能。YAC目前是比较理想的具有最大容量的人工载体。YAC克隆技术的步骤(1)完整的染色体DNA的提取

(2)基因组DNA酶切大片段的获取

用于脉冲电泳(PFGE)的高分子量标记的制备：SCE法和EDTA法

目的DNA的酶切最适条件(控制内切酶量实现)

最适DNA大片段回收YAC克隆技术的步骤(3)YAC载体臂的制备

(4)YAC臂与目的DNA大片段的连接

(5)YAC重组体对酵母的转化

YAC克隆技术：酵母原生质体的制备

YAC重组体对酵母的转化YAC克隆技术的步骤(6)YAC基因库的保存

(7)YAC基因库的鉴定

高分子量标记的制备

随机挑取100个YAC转化子，制备完整DNA

脉冲电泳分离Southern转移

预杂交预杂交标记探针

YAC克隆技术的步骤(8)目的基因YAC克隆的筛选

PCR法对YAC克隆进行筛选

菌落原位杂交作为辅助手段进行筛选

(9)目的基因YAC克隆的鉴定

用目的基因的序列、pBR322和PCR产物微探针进行杂交鉴定

YAC的主要用途(1)YAC克隆重叠群是物理图谱的主要框架。它不仅可容纳大片段的外源DNA，而且在构建基因组文库时需要较少的克隆。

(2)用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物基因组分析和DNA测序中发挥着重要作用。目前，用YAC提供大片段DNA构建染色体图谱的技术已在人类、植物、昆虫、鸟类、两栖类等动物中得到广泛应用，相比于早期的DNA片段载体，YAC是容纳大片段外源DNA的首选载体。

YAC的主要用途(3)在基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都采用了YAC克隆系统。通过YAC嵌入的基因不仅片段长，而且嵌入的基因更适于体内表达，并有利于基因保持其固有的空间构象和功能的发挥。

YAC的缺点插入的片段较大，稳定性较差，不易操作插入的大片段常发生缺失，使文库不完整YAC与酵母天然染色体的分子结构类似，分离时难以与天然染色体分开文库中的嵌合现象严重，嵌合体往往占克隆总数的5%~50%插入片段较大，往往发生序列重排，造成序列错乱染色体显微操作技术流式细胞分类器法微细玻璃针切割法激光显微切割法染色体显微操作技术流式细胞分类器法由于染色体上DNA的碱基序列是随机分布的，各条染色体组成不同，而染料Hoechst只对A-T特异性染色，而染Chromomycin只对G-C特异性染色。因此这些特异性染料和不同染色体上DNA结合的量和比例是不同的。所以结合染料后，再经激光照射，染色体会呈现不同的荧光带。将特定染色体发出的荧光波长输入计算机，通过计算机控制就可将发出同一波长的染色体收集在一起，实现染色体的分离。

基本步骤010203细胞分裂同步处理：秋水仙素，抑制纺锤丝形成，使细胞分裂停留在中期。染色体荧光素染色：细胞温和破碎，染色。染色体分离：把制备的染色体转移到细胞分类器上进行分离微细玻璃针切割法采用特细玻璃针（直径0.17微米），在倒置显微镜下对目的基因所在染色体区段进行切割与分离，随后进行DNA扩增以构建染色体特异性文库。

优缺点：可对染色体直接进行切割分离，费用低，但技术性要求高、不易掌握。激光显微切割法染色体标本在底部贴有特殊薄膜的培养基上制作，利用激光共焦扫描显微系统，激光照射非选择染色体，只留下目的染色体。

优缺点：在一种环境中操作避免了污染，样品可长时间保存，与玻璃针相比操作简便、容易掌握；但是激光仪器昂贵，切割一次费用较高。激光共聚焦扫描显微镜第四部分Part

Four染色体微克隆酶解直接克隆法PCR介导的克隆法将切取的染色体移入含有蛋白酶的微滴中，经去蛋白酚和氯仿抽提EcoR1酶解染色体DNA，然后加入经EcoR1酶切的载体DNA，加入连接酶使染色体DNA和载体DNA结合，最后将微滴tris稀释液稀释后，进行体外包装。载体介导的PCR法

利用简并引物直接PCR法连接引物PCR法

利用单一引物PCR法染色体转移技术定义：将染色体(甚至是全套染色体)和分离提取的细胞核或DNA大分子片段，可采用细胞融合或细胞显微注射法将染色体或染色体片段导入细胞内，使该基因能得以表达，并能在细胞分裂中传递下去的技术称为染色体转移或染色体转导。染色体转移技术染色体转移技术染色体介导转移法微细胞介导的基因转移法细胞核融合转移法染色体介导转移法定义：是指分离得到相应的染色体细胞的一种技术基本步骤：诱发细胞同步分裂，用秋水仙胺阻断细胞分裂于中期，破碎细胞，通过离心收集大量的中期染色体，再通过适当的分部或进一步的分类，转移到受体细胞中，导入基因的受体细胞的分离和鉴定。筛选鉴定染色体组型分析碱性Giemsa染色法。同工酶分析对分离细胞的某些组成性同工酶如LDH等进行分析。其他方法免疫学技术测定同工酶，或者同位素标记染色体的放射自显影技术来鉴定。微细胞介导的基因转移法定义：微细胞是指含有一条或几条染色体，外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。优点：简化供体基因的表达，对受体细胞影响小，微核染色体稳定。以微细胞为供体，通过与遗传性完整的受体细胞融合，从而将微细胞内所含有的几条或一条染色体转移至受体细胞中去，而成为能够存活的杂合细胞的一种技术。微细胞的制备先用阻断有丝分裂试