【白凤菜多酚提取及其抗氧化性的探究6500字（论文）】

白凤菜多酚提取及其抗氧化性的研究摘要植物多酚是植物内的次生代谢产物，化学结构上具有多个酚羟基结构，在大多数高等植物都存在多类若干个羟基的复杂次生代谢产物。当今，人们对天然产物的开发越来越深入，植物多酚的功能也被大众所熟知与重视。目前对于白凤菜中含有的多酚研究尚少，因此该植物中多酚及其抗氧化性有待研究。白凤菜享有“最佳保健药膳蔬菜”的美名，本实验采用乙醇回流法提取白凤菜中的总多酚。通过单因素和正交实验优化乙醇法提取白凤菜总多酚的条件。当时间1.0h、温度为95℃、液料比为1:60、乙醇质量分数为70%的条件下，乙醇法提取白凤菜总多酚含量可达10.21mg/g。白凤菜总多酚抗氧化性实验是通过测定白凤菜总多酚对DPPH自由基和羟自由基的清除效果与总还原力的大小。当白凤菜总多酚对DPPH自由基的清除率为50%，白凤菜质量浓度约为0.42mg/mL；当白凤菜总多酚对羟基自由基的清除率为50%时，白凤菜质量浓度约为7.52mg/mL；当白凤菜总多酚质量浓度为0.6mg/mL时，白凤菜总多酚的还原力为0.621。关键词：白凤菜总多酚；提取工艺；抗氧化；目录摘要 IAbstract II前言 11.1材料与试剂 21.1.1材料 21.1.2试剂 21.2仪器设备 21.3实验方法 31.3.1标准曲线的绘制 31.3.2乙醇提取白凤菜总多酚的工艺方法 31.3.3单因素实验 31.3.4正交试验 41.3.5抗氧化活性测定 42结果与分析 52.1没食子酸溶液的标准曲线 52.2单因素实验结果 52.2.1乙醇浓度对白凤菜总多酚提取率的影响 52.2.2料液比对白凤菜总多酚提取率的影响 62.2.3时间对白凤菜总多酚提取率的影响 82.3正交实验结果 82.4抗氧化活性测定结果 102.4.1清除DPPH自由基测定 102.4.2清除羟自由基测定 102.4.3总还原力测定 113结论 12参考文献 13前言白凤菜（GynuraformosanaKitam）是菊科菊三七属植物，又被称为片仔癀草、肝炎草、白担当。菊三七属植物具有很强的药用价值及保健开发潜能，该植物我国有10种[1]。其不仅营养丰富，而且滋味新鲜可口，享有“最佳保健药膳菜蔬”美名。在福建漳州以及台湾中北部等地区较为常见[2]。植物多酚又被称植物单宁[3-4]，从化学结构角度看，它是植物中一种带有多个酚羟基结构的次生代谢产物，在大多数高等植物都存在多类若干个羟基的复杂次生代谢产物。并且在食品中被作为非营养物质，被广泛运用[5]。当前，总多酚的提取方法有：超临界流体萃取等技术、超声波或者微波辅助提取法、有机溶剂萃取法。超声波或者微波辅助提取法存在溶剂消耗过快、机械仪器耗能过高等缺点，超临界提取法存在仪器设备昂贵、成本高且实验过程中需确保系统维持于临界状态。而有机溶剂萃取法存在杂质含量高，如生物碱并且时间长、溶剂难回收等缺点，但其优点在于不会轻易破坏多酚结构与活性的基础上，又具有仪器设备成本低以及简易操作并且符合现代工业生产的要求等[6]。所以综合考虑，该实验选取有机溶剂萃取法。因为大部分多酚结构中含有羟基，而具有强极性，并可以与某些物质形成稳定结构通过氢键和疏水键的结合，如：蛋白质。因此可以利用渗透作用原理，选用亲水性的有机溶剂，如：乙酸乙酯、乙醇等[7]。提取溶剂的选择要求总多酚有良好的溶解性，并使氢键能够断裂。据文献表明：最适合总多酚的提取为有机溶剂和水的符合体系[7]。常用的有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇，考虑到安全和成本，该实验选用乙醇萃取法。因为乙醇具有易挥发，所以采用回流提取法，在水浴加热的情况下，其中的挥发性溶剂馏出后可以被冷却，再次可以重新流回容器中，这样可以达到提高总多酚提取率的目的。本实验采用乙醇回流法提取白凤菜中的总多酚，通过单因素和正交实验优化提取工艺，同时研究其抗氧化作用，这将为白凤菜的综合利用提供一定的理论依据。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1材料白凤菜全草，采摘于漳州市芗城区，清洗后，在60℃的烘箱内干燥后，再粉碎，过100目筛，密封备用。表1实验所用试剂1.1.2试剂表1实验所用试剂名称规格生产厂家无水乙醇分析纯西陇科学股份有限公司没食子酸标准品分析纯五峰赤诚生物科学股份有限公司福林酚试剂分析纯上海信裕生物科技有限公司碳酸钠分析纯西陇科学股份有限公司硫酸亚铁分析纯西陇科学股份有限公司30%过氧化氢分析纯西陇科学股份有限公司水杨酸分析纯西陇科学股份有限公司抗坏血酸分析纯上海广锐试剂有限公司1,1-二苯基-2-三硝基苯肼分析纯南昌富鑫远科技有限公司铁氰化钾分析纯西陇科学股份有限公司三氯乙酸分析纯西陇科学股份有限公司磷酸氢二钠分析纯西陇科学股份有限公司磷酸二氢钠分析纯西陇科学股份有限公司1.2仪器设备名称型号生产厂家电热恒温鼓风干燥箱DGG-9140B上海高鑫工贸实验仪器有限公司高速万能粉碎机GX-03浙江森信有限公司电子天平AR-124CN奥豪斯仪器（上海）有限公司紫外可见光分光光度计UV5100B上海长城科工贸有限公司循环水式多用真空泵SHB-III郑州元析仪器有限公司数显恒温水浴锅HH-2常州国华电器有限公司旋转蒸发仪RE-200A上海亚荣生化仪器厂冰箱BCD-249WDEGU1青岛海尔股份有限公司真空冷冻干燥试验机LG0.2武汉速冻设备制造有限公司表2实验所用仪器设备表2实验所用仪器设备1.3实验方法1.3.1标准曲线的绘制采用福林酚比色法[8]。配制质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的没食子酸标准溶液，分别量取各标准液1.0mL置于10mL比色管中，加入0.2mL福林酚试剂，3~8min加入2mL7.5%Na2CO3，用蒸馏水定容，避光静置60min。以纯水代替试剂作为对照，在760nm处测定吸光值。以吸光度A为纵坐标，以标准品浓度C为横坐标(mg/mL)，绘制标准曲线。1.3.2乙醇提取白凤菜总多酚的工艺方法精确称取白凤菜粉末1g（精确至0.001g）放入250mL磨口锥形瓶中，用量筒量取60mL的70%乙醇加入，在95℃的水浴锅中水浴1.0h，将其过滤，真空抽滤收集全部滤液。取1.0mL提取稀释液于比色管中，按照标准品加入显色试剂后，测定吸光度。根据已知标准曲线求得白凤菜浓度，按照公式算出白凤菜总多酚含量。多酚含量（mg/g）=C*V*N式中：C为白凤菜总多酚质量浓度（mg/mL），V为白凤菜总多酚体积（mL），N为稀释比例。1.3.3单因素实验通过预实验，取乙醇质量分数，时间，温度和液料比四个单因素的不同水平梯度进行实验，在单因素试验成功的基础上，确定了正交试验的参数范围，取三个主要影响因素各取三个水平进行L9（33）正交试验，通过计算分析出白凤菜提取总多酚的最佳方案。1.3.3.1乙醇质量分数对白凤菜总多酚提取率的影响取白凤菜粉末1g，提取时间为1.0h，料液比为1:50，水浴温度为65℃，乙醇质量分数分别30%、40%、50%、60%和70%的条件下，观察对比不同乙醇质量分数对多酚提取率结果的影响。（注：每组做3个平行实验）1.3.3.2料液比对白凤菜总多酚提取率的影响取白凤菜粉末1g，用乙醇质量分数获得的最佳浓度，水浴温度为65℃，提取时间为1.0h，料液比分别为1:30、1:40、1:50、1:60、1:70的条件，观察对比料液比对多酚提取率的影响。（注：每组做3个平行实验）1.3.3.3温度对白凤菜总多酚提取率的影响取白凤菜粉末1g，用乙醇质量分数获得的最佳浓度，用料液比获得的最佳料液比，提取时间为1.0h，水浴温度分别55℃、65℃、75℃、85℃、95℃的条件下，观察对比提取温度对多酚提取率的影响。（注：每组做3个平行实验）1.3.3.4提取时间对白凤菜总多酚提取率的影响取白凤菜粉末1g，用乙醇质量分数获得的最佳浓度，用料液比获得的最佳料液比，水浴提取温度获得的最佳提取温度，提取时间分别为0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h的条件，观察对比提取时间对多酚提取率的影响。（注：每组做3个平行实验）1.3.4正交试验1.3.4.1数据处理使用Officeexcel软件来绘制出单因素的实验图表，用SPSS软件进行显著性的分析。1.3.4.2实验设计根据上面单因素实验的结果，选取三个有显著性影响的因素，把白凤菜总多酚含量当作指标，来设计L9（33）正交实验。1.3.5抗氧化活性测定1.3.5.1清除DPPH·用无水乙醇溶解DPPH·，配制成浓度为2×10-4mol/L的DPPH·溶液，在试管中分别加入0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL的白凤菜总多酚溶液（质量浓度为1.0mg/mL），用蒸馏水分别补充到2mL，再加入2.0mLDPPH·无水乙醇溶液，摇匀，在517nm分别测定吸光度Ai；以无水乙醇代替白凤菜多酚溶液测得吸光度记作A0；以无水乙醇替代DPPH·溶液测得吸光度记作Aj；同时将维生素C作为阳性对照[9]。实验重复3次。1.3.5.2清除羟基自由基测定在试管中分别加入0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL的白凤菜总多酚溶液（质量浓度为10mg/mL），用蒸馏水分别补充到1mL，并且依次加入2.0mmolFeSO42.0mL、1.0mmol/LH2O22.0mL振荡摇匀。再加入6.0mmol/L水杨酸3.0mL，摇匀，在37℃条件下水浴加热15min。加热完毕在510nm波长分别测定吸光度Ai；以蒸馏水代替白凤菜多酚溶液测得吸光度记作A0；以蒸馏水替代H2O2溶液测得吸光度记作Aj；同时将维生素C作为阳性对照[10]。实验重复3次。1.3.5.3总还原力测定在试管中分别加入0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL的白凤菜总多酚溶液（质量浓度为1.0mg/mL），用蒸馏水分别补充到1mL，并且依次加入2.5mL0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液、1%铁氰化钾溶液2.5mL，振荡摇匀，在50℃下加入20min，加入10%三氯乙酸2.5mL，振荡均匀，10min静置，取2.5mL此液体，加入2.5mL蒸馏水，振荡摇匀，再加入0.1%硫酸亚铁0.5mL，10min静置，在波长700nm测定吸光值[11]。2结果与分析2.1没食子酸溶液的标准曲线根据1.3.1所选用的方法，得出如图1所示没食子酸标准品的标准曲线，确定其回归方程为：y=0.1167x+0.0129（R²=0.9999），这说明没食子酸含量在1.00~2.00μg/mL范围内呈线性关系良好的关系。样品的总多酚含量可根据吸光值代入标准曲线方程计算得到白凤菜总多酚含量。图1没食子酸溶液的标准图1没食子酸溶液的标准曲线2.2单因素实验结果2.2.1乙醇浓度对白凤菜总多酚提取率的影响如图2所示，随着乙醇质量分数的升高，白凤菜总多酚的提取率呈现先上升再下降的趋势，当乙醇质量分数为60%时，白凤菜总多酚的提取率最高。这结果表明：在乙醇质量分数较低时候，白凤菜中的水溶性物质会随着提取实验的进行，而在这个过程中被溶解出来，如糖类[12]；并且乙醇比水具有更强的溶解性，能够更有效的使植物细胞破裂，使白凤菜总多酚等营养物质溶出[13]。当乙醇质量分数继续升高的时候，白凤菜总多酚的提取率呈现下降趋势的原因可能是：乙醇质量分数的增加。使提取溶剂的极性降低，使一些非极性物质被提取出来，如某些色素或者脂溶性物质，从而影响白凤菜总多酚的提取率[14]。因此，乙醇质量分数在60%的时候，适合白凤菜总多酚的提取。图2乙醇质量分数对提取白凤菜总多酚的影响2.2.2料液比对白凤菜总多酚提取率的影响图2乙醇质量分数对提取白凤菜总多酚的影响如图3所示，随着料液比的改变，白凤菜总多酚的提取率呈现先上升再下降的趋势，当液料比为1:60的时候，白凤菜总多酚的提取率最高。该结果表明：白凤菜总多酚的提取液料比应为1:60，当乙醇的用量继续增加时，提取率并未随着增加。这现象表明：在白凤菜多酚的液料比为1:60时，白凤菜总多酚浸出液已经达到饱的状态[15]，综合效率和成本费用以及后续处理等原因，因此，白凤菜提取总多酚的实验液料比应为1:60。图3料液比对提取白凤菜总多酚的影响图3料液比对提取白凤菜总多酚的影响2.2.3温度对白凤菜总多酚提取率的影响如图4所示，随着水浴温度的升高，白凤菜总多酚的提取率呈现先上升再下降的趋势，当水浴温度达到85℃的时候，白凤菜总多酚的提取率最高。这结果表明：白凤菜总多酚是相对耐高温的物质。可能白凤菜总多酚在55℃~85℃的温度区间，白凤菜总多酚化学性质比较稳定；并且乙醇水溶液在温度升高的过程中，溶解性增强，其粘度减少，扩散性增强，这样就能够使浸提速度变快，得到的浸提量也就随之增多[16]。而继续升高温度，白凤菜总多酚提取率呈现下降的趋势原因可能是：超过85℃的时候，白凤菜总多酚在高温区间，化学性质不稳定，而且其在长时间的高温受热的过程中，可能会发生氧化水解反应或者化学结构的改变[17]；也可能是其它杂质的溶出等原因，导致白凤菜总多酚提取率的降低[18]。因此，选择85℃提取白凤菜总多酚。图4温度对提取白凤菜总多酚的影响图4温度对提取白凤菜总多酚的影响2.2.4时间对白凤菜总多酚提取率的影响如图5所示，随着实验时间的延长，白凤菜总多酚的提取率呈现先上升再下降的趋势，当时间达到1.5h的时候，白凤菜总多酚的提取率最高。这结果表明：当实验时间小于1.5h的时候，白凤菜总多酚的提取率逐渐增大，说明在这个过程，白凤菜总多酚没有被完全溶解在乙醇溶液中。而当实验时间继续延长的时候，在这个过程中，白凤菜总多酚可能会被氧化或者因为过长时间的加热使其状态不稳定被破坏等原因[19]。因此选择时间为1.5h来提取白凤菜总多酚。图5时间对提取白凤菜总多酚的影响2.3正交实验结果图5时间对提取白凤菜总多酚的影响由上述单因素试验结果可知，当液料比为1:60，乙醇浓度为70%，温度为95℃，时间为1.0h时提取的白凤菜的总多酚提取率高，为确定提取白凤菜总多酚的最佳条件，以总多酚的含量为指标，设计L9（33）正交实验因素及水平表如下：表3乙醇提取白凤菜总多酚的正交实验因素及水平表水平因素乙醇质量分数（%）料液比温度（℃）1501:50752601:60853701:7095表4正交实验结果表4正交实验结果处理号ABC多酚含量（mg/g）乙醇质量分数（%）料液比温度（℃）11116.4721236.8631326.9042136.8452226.6262316.1773126.8683216.7393337.03k16.746.726.46k26.546.746.79k36.876.706.91R0.330.020.45正交结果为表2所示，各因素对白凤菜总多酚含量的影响顺序为：温度>乙醇质量分数>液料比，根据A3>A1>A2，B2>B1>B3，C3>C2>C1，可以得出A3B2C3为优组合，即乙醇质量分数为70%，温度为95℃，液料比为1:60。该最优水平组合与实际得到的最优水平组合提取含量不一致，所以还需要做验证试验。经验证，用正交所得的优水平组合方式提取总多酚含量为10.21mg/g，其结果高于实际最优提取含量。2.4抗氧化活性测定结果2.4.1清除DPPH自由基测定如图6所示，当白凤菜的总多酚浓度在增加时，白凤菜总多酚对DPPH自由基的清除能力也在提升，在质量浓度为0.05~0.1mg/mL范围内上清除率升趋势比较明显，而当浓度为0.1~0.2mg/mL后清除率上升的速度减慢。而Vc的清除作用是呈现明显的上升状态。该实验所用马齿苋皂苷的质量浓度是Vc质量浓度的25倍大，所以，相对来说，白凤菜总多酚对DPPH的清除作用效果不太好。白凤菜总多酚对DPPH自由基的清除率为50%，由计算可估计白凤菜质量浓度为0.42mg/mL。图6白凤菜总多酚对DPPH自由基清除率的影响图6白凤菜总多酚对DPPH自由基清除率的影响2.4.2清除羟基自由基测定 如图7可知，当白凤菜总多酚浓度越大，它对羟基自由基的清除率也跟着提高，并且这种上升的趋势和Vc的清除作用效果类似。当白凤菜总多酚浓度为9mg/mL时的清除率和质量浓度为0.9mg/mL的Vc的清除率趋于相同，它们差距10倍，说明白凤菜多酚对羟自由基的清除作用不如Vc效果好。当白凤菜总多酚对羟自由基的清除率为50%，由计算可估计白凤菜质量浓度为7.52mg/mL。图7图7白凤菜总多酚对羟自由基清除率的影响2.4.3总还原力测定如图8所示，在Vc浓度为0.02~0.06mg/mL范围内的总还原力都比浓度为0.20~0.60mg/mL的白凤菜总多酚的清除效果好，白凤菜总多酚总还原力上升的速度与Vc的上升速度趋于相同。而该实验所用白凤菜总多酚浓度是Vc浓度的10倍大，相对来说，白凤菜总多酚的总还原力不是很强。当白凤菜总多酚质量浓度为0.6mg/mL时，白凤菜总多酚的还原力为0.621。图8白凤菜总多酚总还原力图8白凤菜总多酚总还原力3结论用白凤菜全草当作原料，使用乙醇法提取白凤菜总多酚，通过正交试验确定乙醇法提取白凤菜总多酚的最优工艺条件为乙醇质量分数为60%、温度95℃、时间1.0h、料液比1:60，在最优的工艺条件下提取白凤菜总多酚的含量可达到10.21mg/g，提取效果比较好。将Vc作为对照样品，与白凤菜总多酚的抗氧化实验比较分析得出，白凤菜总多酚对DPPH自由基、羟基自由基都有一定的清除效果也具有一定还原性。当白凤菜总多酚对DPPH自由基的清除率为50%，由计算可估计白凤菜质量浓度为0.42mg/mL；当白凤菜总多酚对羟自由基的清除率为50%，由计算可估计白凤菜质量浓度为7.52mg/mL；当白凤菜总多酚质量浓度为0.6mg/mL时，白凤菜总多酚的还原力为0.621。

参考文献：[1]林燕燕,张文华,黄仲庆.探讨白凤菜总黄酮应用于天然防腐剂的可行性[J].中外食品工业,2014,37(15):70-71+74.[2]袁珊琴,顾国明,魏同秦.菊叶三七生物碱成分的研究[J].药学学报,1990,25(3):191-197.[3]傅建熙.生物碱的研究概况[J].陕西林业科技,2007,33(2):234-245.[4]王桂玲,房建强,边书芹,等.超声下白凤菜总黄酮的优化提取及体外抑菌活性研究[J].右江民族医学院学报,2017,35(06):90-93.[5]YinSZ,JinHK,etal.Honey:itsmedicinalpropertyandantibacterialactivity[J].BulletinofExperientalBiologyandMedicine,2012,152(06):660-663.[6]张万明.植物多酚种类及其生理功能的研究进展[J].化学教育,2007,28(1):51-52.[7]何志超,王冬梅,李国成,