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文档简介
形态学实验
实验二
石蜡切片法
(取材与固定)
生物体大部分是不透明的,不能直接在显微镜下观察,必须采用特殊的方法对其进行处理,才能观察其内部的细微结构。
切片法:根据对组织包埋介质不同分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法等。
非切片法:包括整体制片法、涂布法、压片法、磨片法、解离法等。
石蜡切片法在研究细胞、组织、胚胎以及形态等方面是最为理想的制片方法。广泛用于医院、医科院校、生物医学研究机构、农科、畜牧兽医等动植物组织研究,尤其在病理学方面是诊断疾病的重要工具之一。石蜡切片的主要步骤:一、取材二、固定三、洗涤四、脱水五、透明六、透蜡与包埋七、切片八、贴片九、染色十、封藏一、实验原理:
1、取材
材料的选择是制作切片的第一步。用于制片的动、植物材料应选择新鲜的,用陈腐的材料制片往往不能反映材料的真正情况。2、固定:
就是借助某类化学药品的作用,使细胞组织的形态保存下来,不使其改变形态和变质的过程。目的是有利于增加细胞内含物的折光程度,增加媒染作用或染色能力;同时可使材料适当变硬,并具有一定的坚硬性便于切片。二、实验程序1.取材的方法根据取材的需要,用锋利的单面刀片切取材料(动物组织有规则的四方体1.0×1.0×0.5cm3,动物的肠道、植物的根、茎、叶等组织取0.3~0.5cm长一小段)。取材要点:取材动作要迅速,以免组织结构发生变化;根据需要选择部位取材,尽可能避免损伤;切取病理材料时,连同正常组织也须切一部分,以便比较观察。2.固定的方法根据材料的种类、大小、性质与固定液的种类、性质、渗透力的强弱来确定固定时间,可以从几小时到几十小时,甚至数天。如将已切的小鼠肝组织快速放入10%的福尔马林溶液中固定12~24时即可。固定剂一般为组织块体积的10~15倍。固定材料时应注意的事项:一般固定液以新配为好,置阴凉处,以防失效;有些混合固定液会发生氧化还原作用,一定要现配现用;固定时间必须充分,对于水分较多的材料,中间应更换1~2次新鲜固定液;如标本块多时,固定时不应重叠;不要先将标本块放入容器后再注入固定液,以免标本贴付于器皿,形成固定不均匀之弊。固定材料的容器应注明固定液、材料来源、日期、操作者签名等,以免与其他材料混淆。任何固定液对人体都有损害作用,因此固定液的容器必须密闭,以防挥发损伤器官和眼睛,忌用手与固定剂直接接触,以免损伤皮肤。
三、常用固定液的种类(一)单一固定液1、酒精(C2H5OH):无色液体,可与水任意比例混合,是一种还原剂,不可随意与重铬酸钾、铬酸、锇酸等混合。酒精渗透力很强,易引起组织收缩,固定用的适宜浓度一般为70%。2、甲醛(HCHO):无色气体,易挥发,具有强烈的刺激性气味,37~40%的水溶液称为福尔马林。甲醛也是一种强的还原剂,不可与铬酸、重铬酸钾、四氧化锇等氧化剂混合。穿透力虽不如酒精,但不会象酒精那样引起组织强烈收缩,两者混合使用效果更好。常用于固定和保存标本的福尔马林浓度为5~10%。3、醋酸(冰醋酸,CH3COOH)4、苦味酸(三硝基苯酚,C6H2(NO2)3OH)5、重铬酸钾(K2Cr207)6、铬酸(三氧化铬水溶液,H2CrO4)7、四氧化锇(锇酸,OsO4)8、氯化汞(升汞或二氯化汞,HgCL2)
(二)混合固定液1、卡诺(Carrnoy)氏固定液2、FAA固定液(醋酸-酒精-福尔马林混合液)3、波恩(Bouin)氏固定液4、秦克(Zenker)氏固定液5、纳瓦兴(Nawashin)氏固定液四、实验步骤1、动物取材:分为活体直接取材、麻醉后取材、处死后取材。无论采取那种处死方法,多应避免由于痛苦引起挣扎,而造成组织结构发生变化,同时取样必须迅速,越快越好。因为动物一旦死亡,细胞便开始自溶。2、取材位置:每二人一组分别取KM小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胃、肌肉组织中的两种,
切成1.0×1.0×0.5cm3的四方体,快速放入10~15倍的10%的福尔马林溶液中固定12~24时。要求每种组织至少取2~3块。取胃肠时应将其内容物用蒸馏水冲洗干净。1-23-45-67-89-0心脏脾脏肝脏肾脏大脑肺脏肌肉胃肠肝脏五、实验用品:器材:解剖盘、解剖剪、眼科剪、眼科镊、止血钳、手术刀片、离心管(带盖)、标签纸、记号笔等。试剂:10%福尔马林固定液。材料:KM小鼠。颈椎脱臼法处死小鼠固定小鼠颈部↙颈椎脱臼法处死小鼠固定颈部、尾部用力往两侧拿,使动物死亡肝脏↗脾脏肠↑肾脏胃↖横膈膜←心脏←肺→头部↗脑六、思考题1、石蜡切片的主要操作步骤有哪些?2、取材和固定组织时应注意哪些问题?作业(实验报告)1.实验一显微镜的使用及细胞形态结构观察显微镜的原理、主要构造与使用程序
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