临床酶学检验技术

临床酶学检验技术

临床酶学的实际应用可以追溯到上世纪初，至今已有百年的历史。到

上世纪30年代，脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMY）、碱性磷酸酶（ALP）、

酸性磷酸酶（ACP）开始用于临床。尤其在1959年，Karmen、LaDue、

Wroblewski等人建立了分光光度法，使得丙氨酸氨基转移酶（ALT）、

门冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LD）

等酶活性测定应用于肝胆疾病、心脏疾病的诊断。他们建立的连续监

测法和酶偶联技术直到现在仍是最常用的酶活性检测方法。酶这一生

物催化剂，在正常机体代谢中起着重要的作用。在病理情况下，尤其

一些细胞内酶，当细胞损伤时会释放到体液中造成体液中酶量或酶活

性的改变，这就是酶可作为诊断指标的依据。因为有一些酶在不同器

官、组织、细胞内的分布和定位存在明显差异，而且在细胞内外有明

显浓度梯度差，所以酶与其它指标相比具有更高的诊断特异性和灵敏

度，这就引起临床病理学家和临床医生的极大关注，使酶学得到迅猛

发展。上世纪60年代以后，人们发现同工酶及同工酶亚型比总酶活

力具有更高的诊断特异性和灵敏度，使临床酶学领域有了更广阔的发

展前景。随着免疫学和其它技术的渗透，测定酶质量成为可能。测定

酶质量与测定酶活性相比，可以测定无活性的酶，且不受抑制剂的影

响，因此，可以提供新的临床信息。酶具有高效催化性和高度特异

性决定了酶作为试剂的生物化学方法具备很多优点：如反应条件温

和，不需强酸强碱，不需高温；方法特异性高，可直接测定体液中某

组分；反应速度快；灵敏度高等等。因此，以酶试剂方法为代表的生

物化学法必将取代化学法。酶作为催化剂，在反应前后无明显变化，

即酶可反复使用，近年来以固相酶技术为核心的生物传感器技术的应

用和开发研究正如火如荼地进行，可以预测我们将很快进入生物传感

器时代。

第一节酶含量的表示方法

酶具有高效催化性，极少量的酶可催化大量底物进行反应。理论上说,

在底物足够和酶未失活的前提下，酶与底物孵育足够长的时间可以产

生足够量的产物。若检测单位时间的产物或底物变化量要比直接测定

酶蛋白量显然容易得多。这种用酶促反应的速度来间接反应酶含量的

方法就是通常所说的酶催化活性的测定。根据酶催化活性来表示酶含

量的方法也称为相对定量法。"相对”的含义还包括酶催化活性易受测

定条件的影响。由于酶催化活性的测定方法简便快速，因此绝大多数

的酶都是用此法测定。

一、酶的催化活性

(-)酶活性单位历史上曾经使用很多酶催化活性的"惯用单位"，

是以方法提出者的姓氏来命名的，他们根据当时的实验条件，提出各

自的时间单位和产物或底物量的单位。例如谷丙转氨酶就有赖氏单位

(Reitman-Frankel)>金氏单位(King)、卡门氏单位(Karmen)、穆

氏(Mohun)单位等等。1963年国际生化协会酶学委员会通过广泛讨

论，提出一个国际单位(IU)来表示酶量的多少。国际单位定义：在

特定条件下，1分钟能转化1微摩尔底物(Umol/min)的酶量为一

个国际单位。由于测定条件（如温度）不同，所转化底物的量将有明

显差异。为避免临床上误认为只要是同一国际单位的酶量在国际上无

论何处所测结果都相同，目前大多数实验工作者常省略国际二字（简

写也由IU改为U）。几乎都习惯用U/L来表示体液中酶活性即酶活性

浓度。1979年，国际生化协会为了使酶活性单位与国际单位SI制相

一致，提出了Katai单位，即每秒钟转化1个摩尔底物（mol/s）的酶

量。国际单位和katal间关系如下：

1U=1umol/min=1X10-6/60s=16.67nkatal（二）正常上限升

高倍数

酶催化活性或活性浓度是一个相对的概念，与测定方法及测定条件有

关。不同的测定方法，酶活性的结果可以相差数倍。例如，乳酸脱氢

酶用逆向反应测得的结果是正向反应的3倍。碱性磷酸酶的不同测定

方法之间仅仅缓冲液不同，其结果也可以相差1倍以上。即使方法完

全一致，配方也完全一致，由于试剂供应商的原料来源不同也会造成

较大的差别，尤其是因工具酶的纯度和工具酶活性单位不同而造成。

酶活性测定的影响因素如此之多，以至各实验室之间的测定结果难以

比较，参考值也难以统一，给临床医生带来不少麻烦。为了更直观地

反映酶含量的变化，很多实验室开始使用正常上限升高倍数（upper

limitsofnormal,ULN）这一表示方法。

所谓ULN是指用测得的酶活性结果除以参考范围上限。这样做的好

处是显而易见的，临床医生可以不要因记参考值范围而烦恼，但是对

于临界升高的病情判断将带来新问题。在目前尚缺乏统一的校正品或

标准以前，测定方法也不能完全统一的前提下，使用ULN有一定的

好处，但对其临床意义应重新进行评价。

二、酶蛋白质量

酶的含量严格来说是指酶分子的质量浓度，常以酶蛋白浓度来表示

（单位是g/L或mg/L）o人体体液中的酶有几百种，但总量不超过

lg/Lo除脂肪酶（LPL）、卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）、胆碱

酯酶（ChE）、铜氧化酶（CER）外，大多数酶的含量在Ug/L水平

甚至更低。要想从混合物的体液中分离纯化后再测定，显然是很困难

的。但利用酶蛋白的抗原性，制备特异性抗体后用免疫学方法可以直

接测定酶蛋白浓度。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）、铜氧化酶（即

铜蓝蛋白Cp）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、前列腺酸性磷酸酶

（PACP）、CK-MB同工酶等。免疫学方法测得的是酶蛋白质量，即

绝对含量。与酶活性相比，有很多优点：①灵敏度高，灵敏度达到

ng/L至ug/L的水平。②特异性高，不象酶活性测定的影响因素那么

多，几乎不受体液中激活剂、抑制剂的影响，不受药物的干扰。③可

测定一些酶活性很难测定的酶，如不表达酶活性的酶原或脱辅基的酶

蛋白或失活的酶蛋白。④与酶活性测定一起，计算免疫比活性，有可

能为临床应用提供新的资料和信息。⑤在同工酶测定中，与电泳法和

层析法相比，免疫学法测定简单快速灵敏度高，标本量少，重复性好。

与化学抑制法相比特异性好。尽管如此，由于制备具有高效价的酶

抗体非常困难，建立免疫学方法的周期和成本都相当巨大。因此，目

前能测定的酶类还非常有限，但这将是一个很有前途的领域。

第二节酶催化活性的测定方法

一、测定酶促反应速度的两类方法

酶促反应速度可以用单位时间的底物消耗量(-d[S]/min)或产物生成

量(d[P]/min)来表示。一种直接用来测定速度的方法称为连续监测

法，另一种在一定时间内通过测定总变化量再计算出速度的方法称为

定时法。

(一)定时法

定时法(Fixedtimeassay)酶活性的结果计算：假设某一样品的酶活

性为XU/L,取样品量Vs毫升与底物缓冲液Vr毫升孵育，经过t分

钟反应，加入终止液Ve毫升，检测到产物净吸光度增加为A,该产

物的摩尔消光系数为£(终点法的摩尔消光系数一般可通过带标准

求得)比色皿光径为bcm。

根据其中：C为产物的浓度，Vt为反应总体积，，[P]为产物的总

变化量，产物生成速度样品中酶催化能力表示为：

酶活性....................................2.1

若把A/t以△A/min表示，则此定时法测定酶活性的计算公式与连续

监测法相同

定时法有别于终点法(end-pointassay)和两点法(two-pointassay)。

终点法是指反应基本达到平衡，信号变化很小，但可以不需要终止反

应，例如化学反应或酶试剂测定代谢物，只能说明反应所需的某一组

分已接近耗尽。而定时法的特点是经过一定时间(固定的时间)反应

后终止反应。两点法是监测反应过程中的两个点，即某一段时间内的

底物或产物的变化。

（二）连续监测法

连续监测法（Continuousmonitoringassay）是将酶与底物在特定条件

（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2-60s）连续测定酶促

反应过程中某一底物或产物的特征信号（如NADH在340nm的吸光

度）的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。一个典型的酶促反

应过程一般包括延滞期（lagphase）、线性期（linearphase）和非线性

期（nonlinearphase）（见图3-1）。

图3-1酶促反应动力学曲线

1.延滞期对单一酶促反应而言，是指酶促反应开始到达最大反应速

度所需要的时间，包括酶催化位点的暴露、底物解离后与酶结合位点

的结合、酶与辅酶的结合、酶的激活等等；对于酶偶联反应而言，延

滞期还包括中间产物堆积到一定程度后，导致指示反应速度增加，直

到与待测酶酶促反应速度达到平衡所需的时间。一般来说，辅助酶越

多，延滞期越长。

2.线性期是指酶促反应速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响。

此期底物虽被不断消耗但还不足以明显改变酶促反应的速度，即以初

速度进行。初速度是指底物的消耗量小于5%时的速度。不过线性期

也仅仅是一个相对的概念，在实际工作中往往需要人为地设定非线性

度。

3.非线性期随着反应的进行，底物消耗越来越明显，反应速度明显

下降而进入非线性期。酶浓度越高在选定条件下线性期就越短。其他

造成进入非线性期的原因有可逆反应增强、产物抑制增加、酶变性失

活增加、酶聚合或解离增加等等。连续监测法根据连续测得的数据,

可以只选择线性期的底物或产物变化速率用于计算酶活力。而定时法

测得的酶活性是酶促反应的整个过程中的平均速度，有可能包括延滞

期和非线性期。由于酶活性只与线性期的反应速度（初速度）成正比

例，定时法很难避开延滞期，非线性期也不能完全避开，因此连续监

测法测定酶活性比定时法更准确。延滞期、非线性期的速率低于线性

期，所以定时法测得的结果往往偏低。自动生化分析仪能自动获取规

定时间内的信号，自动判断非线性度，所以连续监测法更适合于自动

化仪器。

连续监测法酶活性的结果计算：假设某一样品的酶活性为XU/L,取

样品量Vs与底物缓冲液Vr孵育，延滞期为tO分钟，测定间隔时间

为tl分钟，读数次数为n,每间隔时间吸光度变化平均值为A,该产

物的摩尔消光系数为£比色皿光径为bcm。反应速度分别用产物的

生成速度和样品中酶的催化能力来表示：

两者含义一致，经过整理，将（Vs+Vr）记为Vt,A/tl=AA/min,

可得到以下公式：

酶.........................................2.2

设：；酶活性（u/L）=△A/minXK...........................................2.3

2.3式就是自动生化分析仪测定酶活性需要设定K值的计算公式。

2.2式与2.1式对比，两者完全一致。连续监测法需要连续监测，对

仪器要求较高，需要具有恒温装置和连续记录吸光度装置。相反，定

时法对仪器要求不高，一般的分光光度计就能满足要求。由于一般的

光度计所测得的摩尔消光系数与理论值差别较大，在实际工作中常常

需带标准一起测定。连续监测法可以根据2.3式由理论的摩尔消光系

数计算出理论K值。在发表的各种酶活性测定方法中，几乎每个酶

都有定时法和连续监测法可供选择，从测定准确度出发，应优先选择

连续监测法。随着自动生化分析仪的普及，连续监测法已逐步取代定

时法，成为目前最常用的方法。

二、底物或产物浓度的检测

不管是定时法还是连续监测法，都要通过测定底物或产物来实现。测

定底物或产物的手段并不是酶促反应所特有，根据在酶促反应中任一

底物或产物有特征性的物理化学特性（如颜色、浊度、吸光度、pH、

气体、荧光、放射性等等），设计一些检测装置。常用的检测装置有

比色计、浊度仪、分光光度计、荧光分光光度计、量积仪、电位滴定

仪、生物传感器等，其中分光光度法最常用。表3-1列举了曾经使用

的一些检测技术。

表3-1酶促反应中底物或产物浓度的检测

测定项目方法原理测定手段

胆碱酯酶氯化乙酰胆碱做底物产生乙酸根电位滴定法

脂肪酶三油酸甘油酯悬乳液做底物，生成油酸甘油一酯，浊度下降

浊度法

淀粉酶淀粉做底物，一定时间后，剩余的淀粉不足以使碘呈兰色时

间滴定法

丙氨酸氨基转移酶赖氏法，利用丙酮酸与2.4二硝基苯肌形成苯腺

比色法

丙氨酸氨基转移酶IFCC推荐法，利用NADH在340nm的光吸收特

性分光光度法

丙氨酸氨基转移酶固定化谷氨酸氧化酶膜生成过氧化氢，利用过氧

化氢电极生物传感器

N-乙酰-氨基葡萄糖昔酶4-甲基伞形酮N-乙酰-D-氨基葡萄糖甘做底

物，

生成荧光物4-甲基伞形酮荧光

葡萄糖6磷酸脱氢酶NADPH在365nm激发下产生荧光荧光

三、酶活性测定方法原理

如前所述，酶促反应速度用单位时间底物消耗量或产物生成量来表

示。通过底物或产物一些特殊的理化性质设计检测方法，分为直接法

和间接法：(一)直接法是指待测酶酶促反应的底物或产物有特

征性的理化性质，然后通过特殊的仪器直接检测。常用的原理有：

1.基于NADH或NADPH的反应原理NADH或NADPH在340nm

处有特异吸收峰,而NAD+或NADP+只在260nm处有明显的吸收峰,

监测340nm吸光度变化可以反应NADH或NADPH的变化。利用该

原理可以测定以NAD(P)+或NAD(P)H为辅酶的氧化还原酶。

例如LD、葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6-PD)、a-羟丁酸脱氢酶(a-HBD)、

醇脱氢酶（AD）、山梨醇脱氢酶（SD）、谷氨酸脱氢酶（GLDH）等

2.基于人工合成色素原底物反应原理一些水解酶类或转移酶类经过

酶促反应将化合物中的某一基团水解或移去，使无颜色的底物转变为

有颜色的产物。人们把这类底物称为色素原底物。根据这一原理，人

们有意识地合成一系列底物用来测定酶活性，即人工合成色素原底

物，利用这类底物测定的酶见表3-2。

表3-2人工合成色素原底物与待测酶

人工合成色素原底物待测酶产物的毫摩尔吸光系数

4-硝基磷酸酚钠盐（PNPP-Na2）碱性磷酸酶（ALP）4-硝基酚PNP

（405nm）18.5

3-竣基-丫谷氨酰对硝基苯胺Y-谷氨酰转移酶（GGT）5-氨基-2-

硝基苯甲酸

（405nm）9.87,pH为8.10

2-氯-硝基苯-a-半乳糖-麦芽糖甘淀粉酶（AMS）2-氯酚2-CP

（405nm,pH6.0）6.1

2-氯-硝基苯-a-岩藻糖昔a一岩藻糖昔酶（AFU）2-CP（405nm,

pH6.5）6.2

甘氨酰脯氨酰-对硝基苯胺-对甲苯磺酸甘氨酰脯氨酸二***氨基***

酶（GPDA）对硝基苯胺4NA（405nm）9.88

3.基于氧的消耗氧化酶在催化反应时会不断消耗氧气，可以设计氧

电极来连续监测氧的消耗速度。

4.其他胆碱酯酶催化乙酰胆碱产生乙酸，造成pH下降，可以用pH

差示法测定胆碱酯酶。脱竣酶在反应过程中产生CO2,可以用量积法

测定。（二）间接法是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的

理化性质，需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为

有明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的酶类非常有

限，很多情况下不得不使用间接法。

1.化学法大多数定时法都是在酶促反应终止后加入另一个试剂与底

物或产物反应，转化为有色化合物，再用分光光度法检测。也有个别

酶类不终止反应，加入与酶促反应无关的试剂，但能与酶促反应的某

一产物反应生成有特征性的化合物。例如：①胆碱酯酶催化酰基硫代

胆碱类底物后，生成的硫代胆碱（SCh）与5,5-二硫代-双（2-硝基

苯甲酸）（DTNB）反应，生成黄色阴离子5-筑基2硝基苯甲酸

（5-TNBA）。②酸性磷酸酶测定，利用a-蔡酚磷酸盐做底物，经酸

性磷酸酶水解后释放蔡酚，与试剂中的固红TR发生偶氮反应，生成

黄色化合物。

2.酶偶联法在酶活性测定时，常采用另一个（指示酶）或几个酶（辅

助酶和指示酶）将测定酶的某一产物转化为新的产物，当其他酶的反

应速度与待测酶反应速度达到平衡时，可以用指示酶的反应速度来代

表待测酶的活性。可以表示为：

Ex为待测酶，Ea为辅助酶，Ei为指示酶，指示酶是指能监测反应速

度的酶，辅助酶在酶偶联反应中可以一个或多个，也可以不需要辅助

酶。由于NAD（P）+或NAD（P）H在340nm的光吸收特性，很容

易进行连续监测，因此它是最常用的指示反应，过氧化物酶（POD）

也可做指示酶。表3-3例举了需要指示酶的酶偶联方法来测定酶活性

表3-3用酶偶联方法来测定的酶

待测酶测定方法辅助酶指示酶

丙氨酸氨基转移酶IFCC推荐法无LD

门冬氨酸氨基转移酶IFCC推荐法LD*MD

肌酸激酶IFCC推荐法HKG6PD

5,-核昔酸酶5,-AMP做底物

ADA-GLDH法腺昔脱氨酶ADAGLD

淀粉酶EPS底物法无多功能a-葡萄糖甘酶

脂肪酶GK-GPO-POD法GK、GPO、共脂肪酶POD

5,-核甘酸酶5,-IMP做底物

NP-XOD-POD法核昔磷酸化酶（NP）

黄喋吟氧化酶（XOD）POD

*LD并不是真正意义上的辅助酶。

第三节酶活性测定的影响因素与最适条件的确定

一、方法因素的影响

（一）正向反应与逆向反应选择正向反应还是逆向反应，并不是

随心所欲。一般根据测定底物或产物的难易程度来决定。原则上选择

对底物亲和力大，酶转换率高的方向。当然，还应考虑内源性干扰、

底物价格和稳定性等诸多因素。肌酸激酶就是一个很好的例子，因其

逆向反应是正向反应的6倍，而且不受ATP酶、ALP、内源性丙酮

酸干扰，所以，目前普遍采用逆向反应。但是，乳酸脱氢酶的测定选

择正向或逆向反应，目前尚有争议。国内多采用正向反应（L-P）,

与IFCC在2001年发表的操作手册一致。理由是经常被组合在心肌

酶谱中，正向反应有利于LD1的活性表达，有更高的诊断敏感性，

试剂稳定性好。而以前国外常用方法却是逆向反应（P-L）,理由是

反应速度是正向的3倍，而且试剂成本低廉，虽然NADH价格高昂

但用量很少。

（二）检测底物或检测产物

同样，选择测定底物或产物的方法主要取决于哪个更方便。原则上应

选择测定产物的生成量而不是底物的消耗量。为了让全部的酶能够与

底物结合，底物量往往很高，而且酶促反应测定的是初速度，时间较

短。若测定底物的消耗量（起始底物浓度-剩余底物浓度）一方面要

求起始底物浓度不能太高，另外在很短的时间内，底物的消耗并不明

显，测定误差大。而测定产物因为产物从无到多，检测敏感度必然增

加。这也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐渐被色素源底物所取代的原因之

-o除了测定NADH减少可以看成测底物的消耗量外，已很少项目

采用测定底物消耗量。若有两个以上产物，选择测定哪个产物，也要

从测定的方便性、内源性干扰等方面综合考虑。例如ALT催化下列

反应：

丙氨酸+a-酮戊二酸——■*谷氨酸+丙酮酸

既可以测定谷氨酸的生成速度，也可以测定丙酮酸的生成速度，IFCC

推荐法是测定后者。从理论上讲，测定谷氨酸也是可行的。可以偶联

谷氨酸脱氢酶，测定NADH在340nm的增加速度。反应式如下:

谷氨酸+NAD+——fa-酮戊二酸+NH3+NADH

但是该法至少有以下缺点：①a-酮戊二酸作为待测酶ALT的底物又

是指示酶GLDH的产物。根据待测酶对底物的要求，a-酮戊二酸的

用量往往较大，这样对于指示反应来说是极其不利的，过量的a-酮

戊二酸肯定会抑制指示酶的反应速度，结果使延滞期延长，指示酶用

量必须加大。②待测酶丙氨酸氨基转移酶的最适pH与指示酶谷氨酸

脱氢酶最适pH相差较大，要快速达到平衡，也需要增加指示酶的用

量。而待测酶丙氨酸氨基转移酶与乳酸脱氢酶的最适pH接近。③内

源性干扰问题。IFCC推荐法测定丙氨酸氨基转移酶存在内源性的丙

酮酸干扰，但是，内源性谷氨酸的干扰更常见。综合以上因素，通常

测定丙酮酸的生成速度而不是测定谷氨酸的生成速度。不过，生物传

感器的方法是通过测定谷氨酸的生成速度，原因是氨电极的技术比较

成熟。

（三）定时法与连续监测法

如前所述，连续监测法可以选择线性期的反应速度（初速度）来计算

酶活性，因此，测定结果更可靠，而且一般不需做样品空白，干扰相

对较小，是首选的方法。但仪器要求相对较高，在我国基层单位还经

常使用定时法。在不具备分析仪的单位，某些酶采用定时法测定也

可以得到比较准确的结果。例如：碱性磷酸酶的测定就是一个典型的

例子。IFCC推荐法以4-硝基磷酸酚钠盐（PNPP-Na2）为底物，以

2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP）做缓冲液。由于①该法延滞期短，小

于1分钟；②线性期长，400U的样品，线性期可达15分钟；③产物

对硝基酚有标准品供应，④终止液NaOH不会对产物的摩尔消光系数

有影响。因此，很容易在酶促反应条件不变的情况下，将连续监测法

改为定时法。两法的结果准确性相当，唯一的缺点是需加做样品空白。

（四）底物启动模式与样品启动模式底物启动模式是指样品先与部

分试剂（缺乏某个底物）预孵育一定时间，然后加入这个底物，样品

中的待测酶酶促反应才开始启动。这样做的好处是在待测酶酶促反应

开始之前，可以除去某些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。

需要双试剂剂型，IFCC推荐法多采用底物启动模式。而样品启动模

式是指反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品，依靠样品中的

待测酶来启动酶促反应，只是在延滞期去除部分干扰物，可采用单一

试剂剂型，需要注意的是某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑，并

没有将底物单独作为第二试剂，也起不到消除内源性干扰的作用。

二、测定条件的影响与最适条件的确定

酶的催化活性只与酶促反应的最大速度成正比例，推导如下：

酶促反应的整个反应过程可简化为：

式中Kp可看成为ES的解离常数.Michaelis和Menten通过推导可得

出下式：

此式中V为最大反应速度，，为米氏常数。上式也可改写为:

在底物[S]»Km时;Km值由于相对很小可忽略不计:

由于底物网浓度很大，使酶饱和。ES已达极限，反应速度不再增加，

故此时反应速度为最大反应V。

此时反应速度才和酶量E成正比例。也只有在此基础上建立起来的测

定方法才是可靠的、准确的。

国际临床化学联合会(IFCC)和不少国家包括我国的一些学会建立

了测定酶活性浓度的推荐或参考方法。都毫无例外地提出酶活性浓度

测定方法所选择的测定条件应是酶反应的"最适条件"。所谓最适条件

是指能满足酶促反应速度达到最大反应速度所需的条件。包括：①合

适的底物和最适底物浓度；②理想的缓冲液种类和最适离子强度；③

反应液的最适pH；④最适反应温度；⑤合适的辅因子、激活剂浓度;

⑥若是酶偶联反应，还需要确定指示酶和辅助酶的用量；⑦合理的测

定时间，包括延滞期尽量短暂，有足够的线性期；⑧合适的样品与反

应试剂的比例；⑨足够的检测范围；⑩尽量去除各种抑制剂等。

(-)底物种类和浓度

1.底物种类的选择不同酶对底物的专一性有很大的区别。丙氨酸氨

基转移酶对底物有立体结构选择性，只能催化L型丙氨酸。若选择

DL丙氨酸，要达到同样的反应速度，则需2倍于L型丙氨酸的用量。

对于这些特异性很高的酶而言，选择底物的种类比较简单。但对于一

些特异性较差的酶来说，底物种类的选择必须要有理论依据。例如碱

性磷酸酶是一组非特异的磷酸酯酶，能将磷酸盐从一个化合物转移到

另一个化合物。历史上用于碱性磷酸酶的底物有：B-甘油磷酸钠、

磷酸苯二钠、蔡酚磷酸盐，而目前使用最多的是人工合成底物对硝基

酚磷酸盐。底物选择的原则是：（1）选择Km最小的底物：最好是

酶的天然底物，要使酶达到同样反应速度的底物用量最低，不受溶解

度和价格的限制。

（2）要有足够的溶解度：例如GGT测定，过去用Y-L-谷氨酰对硝

基苯胺做底物，由于它溶解度差而被Y-L-谷氨酰-3-竣基对硝基苯胺

所取代。

（3）酶对底物特异性高：例如淀粉酶的测定，以2-氯-4-硝基酚-麦芽

三糖甘做底物，不需要偶联酶可以直接测定淀粉酶，但因为它也是体

内a-葡萄糖甘酶的底物而不能成为淀粉酶测定的参考方法。若以2-

氯-硝基苯-a-半乳糖-麦芽糖昔做底物，就不会被a-葡萄糖甘酶所催

化，也不需偶联酶，可以直接测定淀粉酶。

（4）底物稳定性好：例如用于淀粉酶测定的人工合成底物很多，但

都存在一个共同的缺点，即底物本身可以自发水解。淀粉酶测定的参

考方法-亚乙基封闭的对硝基酚麦芽庚糖普做底物（EPS法）的优点

就是底物的稳定性好。

另外，也要考虑选有较高临床价值的底物。例如临床上测定酸性磷酸

酶主要目的是诊断前列腺癌，所选的底物应对前列腺酸性磷酸酶有较

高的特异性。在常用的底物中以麝香草酚磷酸盐最合适。乳酸脱氢酶

几乎存在于全身各个组织，对脏器疾病的诊断特异性不高。对底物的

选择性也不高，除丙酮酸外，a-酮丁酸也是它的底物。a-羟丁酸脱

氢酶测定实质上就是以a-羟丁酸做底物，反映乳酸脱氢酶的H亚基

的活性。

2.底物浓度的确定（1）单底物酶促反应：根据Michaclis-Menten

方程很容易得出以下结论：在反应速度为最大反应速度V一半时，[S]

=Km,此时的底物就相当于酶的米氏常数Km。以mol/L表示之，

大多数酶Km在10-3至10-5mol/L之间；若[S]=10Km,则反应速度

达到最大反应速度的90.9%；若凶=20Km,则反应速度达到最大反

应速度的95.2%；只有当时无穷大时，反应速度才达到最大反应速度,

这在实际工作中是不可能的。因此，底物浓度的确定原则是选择凶

=10Km〜20Km,此时反应速度基本达到最大反应速度，测定的误差

可以接受。某些水解酶如碱性磷酸酶测定，由于另一底物是水，可以

按单底物酶促反应看待。

（2）双底物酶促反应：双底物酶促反应动力学与单底物相比更复杂，

可以分为乒乓机制、序列有序机制和随机机制等，底物浓度的确定以

动力学方程为基础。有关动力学方程可以参考相关论著。所有双底物

酶促反应的动力学方程可以用下式表示：

F是指v/V,即反应速度达到最大反应速度的程度，一般要求90%〜

95%,Ka、Kb分别代表两个底物的米氏常数，在反应条件确定时，

是个常数。[A],[B]是两个待确定的变量，分别代表两种底物的浓

度，K值在乒乓机制是常数1,在其他机制是变量但接近于1,在实

际工作中为了方便，可以认为是常数1。如果规定F的值，那么:

也就是说之间的关系是一条双曲线，有无数组数据。在实际工

作中，可综合价格、溶解度等因素，先确定其中一个底物的用量，再

求出另一个底物的用量。

以上所述的底物选择原则在实际工作中有一定的指导意义，但是需要

注意，酶促反应很复杂，可逆反应，产物抑制，其他激活剂和抑制剂

的存在都影响着最适底物浓度的确定。

（二）缓冲液种类、离子强度和最适pH

为了酶与底物很好的结合，酶和底物都需要合适的解离状态。酶催化

基团作用的发挥也需要酶、辅助因子的有效解离，酶的稳定性也需要

合适的环境。这一切都离不开缓冲液的作用。一个酶促反应的表现很

大程度上依赖于缓冲液的选择是否恰当。依据缓冲液对酶活性的影响

可将缓冲液分为活性缓冲液、惰性缓冲液和抑制缓冲液三大类。

在一系列不同pH的最终反应体系中，酶促反应速度达到最大时的pH

称为最适pHo一般来说，血清中大多数酶最适pH接近中性。有些

酶在最适pH附近活性变化非常显著，但多数酶在一定pH范围内相

对稳定。测定酶活性时一定要选择在最适pH处。最适pH并非是酶

的特征性常数，易受多种因素影响而改变，如缓冲液种类、底物浓度、

反应温度、样品与反应试剂的比例、各种防腐剂和其它添加剂等等。

缓冲液的离子强度也影响着酶的活性，一般选择与生理环境的体液比

较接近的离子强度。Allert曾拟定了一种作用模式，并进行数学计算,

得出相应方程式来说明反应体系中电解质会影响最大反应速度。结论

是：离子强度越高，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，

但离子强度过低也会抑制酶活性。缓冲液的离子强度在碱性磷酸酶测

定中是个特例。按IFCC推荐法规定，以2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP）

做缓冲液，缓冲液浓度高达O.85mol/L,这在酶类测定方法学中极其

罕见。其理由是：AMP是作为磷酸转移作用中的磷酸基受体，不仅

仅起到缓冲作用，还有类似底物的作用。

理想的缓冲液应具备以下条件：①有足够的缓冲容量，较低的离子强

度就可以维持pH的恒定。缓冲液的pKa与最适pH越接近，缓冲容

量越大。有酸碱的产生或消耗的酶促反应，对缓冲容量的要求更高。

②纯度高，不含有抑制酶活性的杂质。③温度依数性小，受温度波动

pH变化小。④对酶活性表达有促进作用则更好。尽量选择活性缓冲

液或惰性缓冲液，不可选择抑制型缓冲液。⑤对酶有稳定作用。

目前酶制剂中或测定体液中酶活性方法使用最多的是GOOD氏系列

缓冲液。其它常用的缓冲液有三羟甲基氨基甲烷（Tris）、三乙醇胺

（TRA）、二乙醇胺（DEA）、2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP）,而磷酸

盐缓冲液已越来越少使用，甘氨酸缓冲液对酶有抑制作用，已几乎不

在使用。

值得注意的是，缓冲液都有温度依数性，配制缓冲液时不仅要指出其

pH值，还应说明配制温度，以避免因温度不同而引起的误差。

由于最适pH不是酶的特征性常数，在实际工作中一般做法是，先确

定大致的最适pH,再确定缓冲液的种类，最后重新确定最适pH。

（三）反应温度

温度越高，反应活化能越大，酶与底物结合的机会越多，反应速度越

快。但是，温度增高，酶的变性失活就会增加，不同酶的最适温度可

以不同，至今，对酶活性的测定温度还未统一。目前常规实验室越来

越多的使用37℃,这更多地是从实际工作方便来考虑。因为温度越

高，反应速度越快，灵敏度越高，延滞时间和测定时间都可能缩短，

有利于提高工作效率。尤其目前在常规实验室中广泛使用全自动生化

分析仪，有高效率的恒温系统，使反应系统很快升温并维持在37℃,

可避免温度差异引起的误差。对于生化分析仪而言，每个酶测定的温

度不同是不现实的。值得注意的是，在比较不同实验室测定结果时，

一定要注意温度不同带来的差异。

在1986年以前IFCC推荐酶活性测定的温度是30℃,优点是能保

证一定的反应速度，又不使酶失活，而且纯钱的熔点为29.77C,钱

作为此温度的基准物质。保证了测定仪器在30C的高度准确性。

2001年IFCC正式发表了"37C下检测酶催化活性浓度的IFCC一级

参考方法操作手册和参考制品认可系统"，包括CK、LD、ALT、AST、

GGT五个酶在内。

（四）辅酶、辅基和激活剂

根据酶催化反应最适条件的要求，原则上在酶测定体系中应加入

一定量的辅助因子。辅助因子（cofactors）是指酶的活性所需要的一

种非蛋白质成分，包括辅酶、辅基和金属离子激活剂。与酶紧密结合

的辅因子称为辅基；不含辅基的酶蛋白称为脱辅基酶蛋白

(apoenzyme),没有催化活性，必须加入足量辅基，和它结合成为全

酶(holoenzyme),才有催化活性。脱辅基酶蛋白与辅基孵育一段时

间后，酶活性才会恢复，因此，往往需要样品与试剂中的辅基先预孵

育的过程。辅基的用量往往较少。

与酶蛋白结合很松弛，用透析和其它方法很易将它们与酶分开的称为

辅酶(Coenzyme)。辅酶尽管不同于酶的底物，但在作用方式上和底

物类似，在酶反应过程中与酶结合、分离及反复循环。辅酶用量的确

定可将它们按底物处理。例如乳酸脱氢酶中辅酶按双底物动力学方程

计算。

激活剂(activator)的化学本质是金属离子，可以是酶的活性中

心，也可以通过其他机制激活酶的活性。作为激活剂的金属离子，其

影响酶促反应的动力学更加复杂。最常见的是二价金属离子如Mg2+、

Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等。重金属离子大多是酶的变性剂。金属

离子之间往往存在相互拮抗或相互抑制。在酶测定体系中经常加入

EDTA目的是螯合一部分非必要的离子。合适的金属离子浓度是必要

的，过量的离子往往抑制酶反应速度。由于激活剂的动力学往往与酶

的动力学不同，这就可以解释不同的样品与反应液的比例，造成酶活

性测定结果的不呈比例。N-乙酰半胱氨酸对肌酸激酶的激活作用与此

类似。激活剂的用量一般通过反复实验来确定。(五)抑制剂

酶活性测定过程中最常见的抑制剂有产物的抑制、底物的抑制，分析

器材或试剂中的重金属及体液中的药物等造成的抑制。抑制类型也可

以各种各样，可以是可逆抑制，也可以是不可逆抑制。按最适条件的

要求，不管哪种抑制，都要尽量去除。采取的措施包括：选用高纯度

的原料、高纯净水、器材干净，在反应液中加入金属螯合剂，甚至可

以引入一个副反应来去除产物的抑制作用。

（六）酶偶联法中辅助酶、指示酶

酶偶联反应原理：酶偶联反应的反应模式如下：

对于待测酶Ex,反应条件要求满足最适条件。反应开始后，经过一

个短暂的延滞期，不断地产生中间产物B,启动辅助酶反应Ea,同

样经过一个延滞期，产生中间产物C,最后启动指示反应Ei。由于在

最初的反应体系中，中间产物B和C的量几乎为零（不考虑内源性

存在），此时辅助酶和指示酶的反应速度很小。但是，它们的最大反

应速度却很大（由试剂中加入的酶量来决定），甚至远远大于待测酶

的最大反应速度。随着反应的进行，中间产物B和C的量逐渐增加，

辅助酶和指示酶的反应速度也相应增加，直到辅助酶和指示酶的反应

速度达到待测酶的反应速度，即进入动力学的线性期，并会维持一定

时间，在此之前的时间称为延滞期。此时，Vx=va=vi,va和vi是辅

助酶和指示酶此时的有效反应速度，并不是它们的最大反应速度。这

样我们就可以监测产物D的生成速度或中间产物C的消耗速度，既

vi来反映Vx,求出待测酶的酶活性。

1.指示酶、辅助酶的种类指示酶和辅助酶选择的依据是：①考虑特

异性，尤其是指示酶，如果指示酶存在副反应，则使测定酶的结果假

性偏高。②考虑辅助酶的数量，减少辅助酶就可以缩短延滞期。③酶

偶联反应的合理性，如能直接与指示酶偶联，就没有必要加入辅助酶。

④所选用的指示酶、辅助酶应尽量选择Km小的酶，可以缩短延滞期。

⑤考虑指示酶、辅助酶的最适条件（尤其是最适pH）尽量与测定酶

的"最适条件"接近。整个体系的测定条件必须以测定酶为准。⑥还需

考虑价格、来源和纯度及酶的稳定性。来源不同的酶，Km有明显差

别，甚至辅酶也不同，耐热性也有很大的区别，酶试剂的质量很大程

度上取决于工具酶的来源。

2.指示酶、辅助酶的浓度确定辅助酶或指示酶用量不足的后果是延

滞期延长，待测酶的可测范围变窄，严重时不出现线性期。辅助酶或

指示酶用量过大，成本增加，杂酶的干扰程度增加。所以在酶偶联测

定法中，选用适当量的工具酶是一个重要的问题。一般可用反复试验

法，即试验性地选用不同量的工具酶直到偶联酶反应中指示酶反应速

度不随工具酶的增加而升高，并在所选用?quot;最适条件"下，延滞期

合适，有足够的线性期，待测酶上限符合临床要求，酶浓度曲线线性

关系好等。

很多专业书籍还介绍了一些酶用量的估算方法，这在实际工作中有一

定的指导意义。但是应考虑到酶供应商的单位定义和测定方法之间是

否存在差别，而且酶在运输保存中会有酶活性的丧失，测定体系中的

其它条件如缓冲液、保护剂等都会影响酶的用量。实际用量往往比最

适用量增加1倍以上。

（七）延滞期、线性期的确定

在以上条件都确定以后，动力学特征和方法的性能基本确定。动力学

特征包括延滞期、线性期和非线性期。延滞期可以因酶在样品中所存

在的介质不同而略有差别，原因可能是存在内源性干扰物，也可能存

在一些抑制剂。延滞期的确定原则是多观察儿例浓度不等、病理情况

不同的标本，选择延滞期最长者作为确定值。

线性期的确定离不开酶浓度的可测上限，因为酶浓度越高，在同样时

间内消耗底物越多，产生产物越多，底物的不足和产物的抑制将导致

非线性期的提前到来。不过也与非线性度的大小有关，没有绝对意义

上的线性期，线性期是以指定的非线性度作为判断基础的。线性期如

何确定呢？主要看读数次数和读数间隔来决定，为了计算非线性度，

按最小二乘法的计算要求，读数次数应不少于4次，读数间隔按一般

仪器要求30秒就足够了，线性期在2分钟以上即可。中华医学会检

验学会规定酶活性测定要求线性期不短于2.5分钟。若规定线性期不

短于2.5分钟可以测得酶活性的最高浓度就是该法的测定上限。

（A）样品与试剂比例

样品量与反应液总量的比例与方法检测的灵敏度和检测上限有关，与

测定误差也有关。根据酶活性计算公式不难看出，改变样品与反应液

总量的比例就可以改变K值。按仪器噪音0.001计算，K值不易过大,

否则会造成检测误差加大。

值得注意的是酶活性的发挥与介质有关，经常发现改变样品与反应液

总量的比例，测定结果并不会成正比例地改变，可能与激活剂、抑制

剂、酶的解聚和聚合、酶的稳定性等因素有关。因此，样品与反应液

总量的比例一旦选定，就不能随意更改。从以上分析中不难看出：

酶促反应的影响因素很多，各因素之间有相互影响相互制约，没有绝

对的"最适条件"，但只要按照最适条件的目标，在建立方法时，努力

靠近最适条件，必将缩小方法之间、试剂之间的差别。

三、其他因素对测定结果影响

(一)仪器不同的仪器，波长的设置有区别，带宽有区别，比

色杯的透光性在使用过程中也会发生改变，这些都直接影响仪器对待

测物的摩尔吸光系数，也就影响K值的准确性。最好定期检查仪器

的摩尔吸光系数。K值的设置还需考虑稀释体积、比色杯的光径、副

波长的影响等。

(―)校准物

可用作酶活性测定用的校准物分两类。一类是产物的基准物质，如对

硝基酚、对硝基苯胺等，可用于校准仪器的摩尔吸光系数。产物NAD

(P)H的摩尔吸光系数可以用葡萄糖测定试剂(己糖激酶法)来校

正。若用双波长测定则只适用于该双波长。另一类称酶校准物

(Enzymecalibrator),多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本

比较接近。国际上已经有5个经IFCC认可的CRM酶参考物。各试

剂供应商所提供的酶校正物的定值应可溯源至CRM酶参考物。在实

际工作中，使用酶校正物的优点有：①可以缩小因试剂配方差异造成

的误差。如因保护剂、原料来源不同等造成的差异。②可以校正在试

剂稳定性稍有改变造成的误差。③可以校正仪器的某些系统性误差。

如波长带宽、温度、加样误差等。但是它无法补偿分析系统的特异性

缺陷和精密度缺陷，而且在不同的检测系统应有不同的校正物。

（三）实验参数实验参数的正确理解和编制对测定结果也有很

大的影响。样品量、试剂量、延滞期、测定时间、K值等都是很关键

的参数。对于色素原底物的方法，由于底物的自身水解作用，应采用

减试剂空白的速率法；对于辅助酶或指示酶中杂酶引起的干扰，也应

采用减试剂空白的速率法；对于内源性干扰的反应，不同的仪器应分

别对待，不能盲目采用减空白的速率法，要区分是试剂空白还是样品

空白。其他一些质量保证参数在酶活性测定中也应引起重视。

（四）副反应NAD（P）H的光吸收特性成为目前使用最多的指示

反应。但是，体内存在数以百计的氧化还原酶，它们的辅酶很多是一

致的。若存在内源性代谢物，必然会相互干扰。解决副反应的干扰，

一直是人们努力的方向。通过加入副反应抑制剂、样品进行预处理等

都是切实可行的手段。双试剂底物启动模式因不增加成本、不耗费时

间是最经济的方法。总之，酶催化活性浓度的测定影响因素多，只

有将各种影响因素都控制好，不同实验室的测定结果才具有可比性。

要实现全球可比性的目标，应从以下几个方面着手：首先，测定方法

要统一，各实验室都应选择IFCC推荐法或中华医学会推荐的方法。

其次，各试剂供应商应严格按照IFCC推荐法所规定的配制方法生产

试剂，并提供本测定系统的酶类校正物。另外，各实验室的操作人员

应合理编制分析仪参数；参加各地区组织的酶类室间质评工作，不断

提升实验室的比对能力；控制样品采集和保存等实验前因素；认真做

好室内质量控制，监控试剂质量和仪器性能。

第四节代谢物的酶法测定

酶试剂法是以酶作为试剂来检测与酶促反应相关物质的一类方法。酶

试剂法因具有反应条件温和安全、样品不需预处理可直接测定、方法

特异性高、灵敏度高等优点，已广泛应用于体液中各种有机物的测定,

如葡萄糖、尿素、肌酊、胆红素、尿酸、胆固醇、甘油三酯、胆汁酸、

乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸、氨等等，也可以用来测定无机

离子和微量元素如钾、钠、氯、无机磷、碳酸氢根、铜、锌、镁等。

一、方法分类

在所有用酶作为试剂的测定方法中，分光光度法仍然是最常用的

测定手段。根据方法设计的原理不同可以分为：

(一)直接法在相对应的氧化还原酶作用下产生可以直接检测的信

号的方法称为直接法。尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在

293nm有特异的吸收峰，胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿素造

成450nm处的吸光度下降，而乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、碳酸氢

根经氧化还原反应，使辅酶在氧化型与还原型之间转换，很容易用分

光光度法检测。体内还有很多代谢物可以直接测定，关键是需要相对

应的酶。

(二)酶偶联法与酶活性测定一样，直接法测定项目是有限的。而

酶偶联法若不限制偶联酶的数量，不考虑酶的来源和价格，从理论上

讲几乎可以测定所有代谢物。而且，每种代谢物可以使用不同的酶而

建立多种检测方法。如甘油三酯、肌醉都有多种酶试剂法。指示反应

主要分为NAD(P)H和过氧化物酶(POD)系统两大类。

（三）无辅基酶活性恢复法很多酶必需某些无机离子、微量元素或

辅酶存在才发挥其催化活性。将脱去关键无机离子、微量元素或辅酶

的酶（无活性）与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使

酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、微量元素或辅酶的

含量。成功的例子有丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾，a-半乳糖

昔酶法测定钠、淀粉酶法测定氯、超氧化物歧化酶法测定铜、碳酸甘

酶或碱性磷酸酶法测定锌、异柠檬酸脱氢酶法测定镁等。根据此原理

也可用来测定辅酶。（四）激活剂和抑制剂测定法

根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学发生改变来测定

激活剂和抑制剂的含量，成功的例子有己糖激酶法测定镁、碱性磷酸

酶法测定茶碱等。

二、测定原理

如上所述，酶试剂方法可基于不同的原理来设计方法，但从监测类型

来分，可分为终点法（平衡法）和连续监测法（速率法）。所谓平衡

法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的

底物量很小（＜1%〜5%）时，指示反应信号逐渐达到稳定，即通常

所说的终点。该法的特点是测定底物的总变化量，即测定的是"浓度"。

连续监测法是测定速度（通常指的是初速度），依据是当底物的消耗

量较小时（＜5%）,酶促反应呈一级反应，反应速度（v）只与代测物的

浓度成正比例。两种方法是相互联系的，因为平衡法的开始一段时间

都有可能遵循一级反应规律。相反，连续监测法只要时间足够长，也

会达到平衡。酶促反应速度受很多因素影响，只有在其它因素很好控

制的前提下，反应速度（V）才与代测物的浓度成正比例，该法测定

误差较大。但也具有很多优点：①因测定时间短，检测速度快，不需

把所有底物转化为产物，酶用量比平衡法小，检测成本低；②速率法

一般不需做样品空白，标本本身因素影响小。平衡法若要将代测物在

较短时间内消耗接近完全，必须使用大量的酶。但其优点是试剂酶活

性的下降对测定结果影响远没有速率法明显，仅使达到平衡所需时间

延长，检测范围变窄。试剂酶活性下降对速率法来说有时是致命的，

可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。由于以上种种原因，酶试

剂法多选择平衡法。从以上分析不难看出，对于平衡法来说关键是

确定达到终点所需的时间。对于速率法来说关键是如何使酶促反应成

一级反应。下面以单底物一个工具酶为例说明它们的测定原理：（一）

平衡法

将米氏方程改写为：...................................2.4

积分得：若反应达到平衡，假设（一般"终点"的要求），[SOHSt]

—[SO],则可简化为：

说明达到终点所需的时间与Km、Vm、SO有关，Km越小、Vm越

大（加入酶量越多）、SO越小（代测物越少）则达到终点所需的时

间越短。

若[SO]《Km,2.4式简化为：

积分得:

若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标准管与测定管反应

时间⑴一致，则有：

若两者的反应程度一致，消耗的比例、剩余的比例与起始的比例一致,

则：

............................2.5

标准管的［SO-St］与待测管的［SO-St］分别代表消耗量，也代表转化为产

物的量，可以用产物的吸光度来表示（As和Au）。标准管的［So］与测

定管的［So］分别表示为Cs和Cuo

.........................................2.6

公式（2.6）平衡法测定代谢物的基本原理，其前提条件是公式（2.5）

成立。当［S0HSt］Q［S0］,即反应基本达到平衡，Au和As基本稳定

不变，此时测定误差最小。如果测定管与标准管的反应明显存在基质

效应，两者反应程度不一，若按公式（2.6）计算就会带来误差。

（二）速率法根据米氏方程：按一级反应要求：①［S］《Km,［S］+Km

七Km,②酶量很大，在反应过程中，可将V看成不变。贝IJ：

若同时带标准管，则有：

.....................................2.7

标准管的［So］与测定管的［So］分别表示为Cs和Cu,速度用△A/min

来表示。上式改写为:

2.8

公式(2.8)就是速率法测定代谢物浓度的原理，其前提条件是测定

初速度。随着反应进行，［S］越来越小，v也越来越小。说明要使反应

速度与代测物浓度成正比例，必须做到测定的速度是初速度，越偏离

初速度测定，误差则很大。

三、常用的指示系统

除个别酶试剂法使用色素原做指示系统外，酶试剂法的指示系统主要

使用NAD(P)H或过氧化物酶(POD)系统，前者主要应用于速率

法，后者则常用于平衡法。

(一)以还原型辅酶为指示系统

常用的工具酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、

苹果酸脱氢酶等，该法的优点是可以用连续监测法，除在酶偶联反应

测定酶活性中应用较多外，像葡萄糖、尿素、肌醉、甘油三酯、胆汁

酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸、氨、钾、镁等的酶法测定

都使用该指示系统。但该法的缺陷有：

1.灵敏度较低NAD(P)H的摩尔消光系数只有6.22X103。为此,

采取一系列措施提高灵敏度。常用的措施有：

(1)利用递氢体PMS或偶联黄递酶：将NADH上的氢交给四氮唾

盐如NBT等，即提高了灵敏度，又可以在可见光范围内监测，使仪

器要求大大降低。

(2)加入另一个酶，增加供体氢的数量：如胆汁酸测定中，合并使

用3a-羟类固醇脱氢酶(3a-HSD)和3-氧-5B-类固醇-Z\4-脱氢

酶，使测定灵敏度增加1倍。

(3)酶循环法：采用酶循环法(enzymaticcyclingmethods)可大大

提高测定的灵敏度，如旭汁酸的测定，在体内的浓度只有微摩尔的水

平，远远低于其它代谢物的浓度。其原理是：3a-HSD催化胆汁酸和

3一酮类固醇之间的反应，正反应对辅酶硫代氧化型辅酶I的亲和力远

远大于辅酶I,而逆反应对还原型辅酶I的亲和力大于硫代还原型辅

酶I,在反应系统中有足够的硫代氧化型辅酶I和还原型辅酶I,只要

有少量的胆汁酸就可生成少量的3-酮类固醇，并在两者之间构成循

环，不断产生硫代还原型辅酶I(黄色)，控制好条件，反应速度与代

测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。底物足够多，时间越长产

物越多，直到系统中某一反应物耗尽为止。类似的方法还可以测定雌

二醇、微量的乙醇等。循环酶技术在试剂生产中还可以不断补充某些

不稳定的组分。

(4)荧光法：NAD(P)H的激发波长在365nm,发射波长在

460nm,用荧光监测器可以使灵敏度增加100-1000倍。但需要特殊仪

器，实用性差

2.干扰严重NADH系统是体内上百种酶的辅酶，若存在内源性

干扰物，势必造成很大的干扰，尤其是样品用量大的方法。因此，在

某些测定系统中常常加入高浓度的丙酮酸来抑制乳酸脱氢酶的内源

性干扰。

3.仪器要求高必须具备340nm的紫外监测器。这可通过还原

四氮噗盐生成甲月赞的方法来解决。

（二）以过氧化物酶为指示系统

利用POD为指示系统已广泛用于葡萄糖、肌酎、尿酸、胆固醇、甘

油三酯等项目的测定。其共用的指示反应最早由Trinder氏等人提出。

其原理是过氧化氢与4-氨基安替比林和酚一起形成红色的醍亚胺类

化合物。最大吸收峰为500nm,在可见光范围内比色，这是它的最大

优点。后来，提出了很多酚类衍生物，目的是提高生色基团的稳定性

和溶解度、产物的灵敏度和色泽的稳定性。也有些生色基团的产物是

兰色醍类，能很好避免溶血等引起的色素干扰。该法的主要缺点是容

易受维生素C、尿酸、胆红素、谷胱甘***等还原性物质的干扰，严

重时测定结果会出现假性负值。干扰机制有竞争过氧化氢、破坏色素、

延迟生色反应等，目前一般采用双试剂剂型，在试剂1中加入抗坏血

酸氧化酶、亚铁氟化钾等来消除维生素C、胆红素的干扰。表3-5例

举了一些常用的生色基团。

表3-5常用的Trinder反应生色基团

化学名英文缩写最大吸收峰（nm）

酚P500

2、4-二氯酚2、4DCP510

N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺EMAE555

N-乙基-N-（2-羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺TOOS555

N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3、5二甲氧基苯胺ESPDMA585

第五节同工酶检测技术

1952年，Nielands在乳酸脱氢酶区带电泳中发现了两种有活性区带，

1959年，Markert等人提议用"isozyme”来描述一组具有相同催化功能

而其结构或化学性质不同的酶，国内曾译为“同功酶"和"同工酶"，1964

年，国际生化学会统一用"Isoezyme"来表示"isozyme",由于"Isoezyme"

虽催化同一反应，但在不同组织中具有不同的功能，故国内译为"同

工酶"较为合适，并已得到广泛接受。

同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多***链单体、纯聚体或

杂化体，具有相同的催化作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、

生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的一组酶称为同工酶。凡

酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶，而将经加工或修饰后的同

工酶称为次级同工酶或酶的多种形式。不管是原级同工酶还是酶的多

种形式，由于它们在组织分布、细胞内定位、发生发育等方面都有可

能存在明显差异，与总酶活性相比它具有更高的诊断特异性和诊断敏

感度，所以没有必要进行严格分类。但在遗传学领域中以研究原级同

工酶为主。某些同工酶从组织进入体液后在蛋白酶作用下降解成不同

的亚型（isoform）,如CK-MB可分为MB1和MB2两个亚型，有报

道提示亚型比同工酶更有价值。

同工酶的测定方法可以分为直接法和间接法两大类。直接法是指利用

同工酶之间酶催化动力学性质或免疫原性的不同，不对同工酶各组分

预先分离，直接测定某一种同工酶的方法。多采用化学抑制、免疫抑

制、热变性等原理。而间接法是依据同工酶之间理化性质（带电性、

分子大小、糖链等）的不同先用电泳技术、凝胶层析技术、亲和层析

技术将各种同工酶组分分开，再利用酶催化性质对同工酶进行定量的

方法。两者区别是：直接法只能测定同工酶的某一组分，由于操作方

便，适合于自动生化分析仪。而间接法操作复杂，需要特殊装置，不

适合自动生化分析仪，但能同时分析同工酶的各个组分。下面简单介

绍同工酶分析的常用原理。

一、化学抑制法

市售的LD1测定试剂盒多采用化学抑制法，个别采用免疫抑制法。

化学抑制法的原理是一定浓度某些化学试剂如750mmol/L的1,6-己

二醇、240mmol/L的硫氟酸月瓜能有效地抑制LD2-LD5各种同工酶的

活性，而