天然药物化学成分提取分离鉴定方法

关于天然药物化学成分提取分离鉴定方法1第一节提取方法与技术常用的方法有：一、溶剂提取法（最常用）﹡二、水蒸气蒸馏法﹡三、升华法四、超临界流体萃取法提取：选择适宜的溶剂和适当的方法，将所要的成分尽可能完全地从天然药物中提取出来，而杂质尽可能少地被提出的过程。2第2页,共67页，2024年2月25日，星期天一、溶剂提取法（一）定义：

指根据天然药物中各化学成分的溶解性能，选择对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当的方法将所需化学成分尽可能完全从药材组织中溶解提出的方法。在实际工作中应用最普遍3第3页,共67页，2024年2月25日，星期天4

溶剂对药材组织细胞不断作往返的扩散、渗透、溶解，直至药材组织细胞内外溶液中被溶解的化学成分的浓度达平衡。扩散、渗透、溶解第4页,共67页，2024年2月25日，星期天（二）基本原理：“相似相溶”

亲脂性的成分易溶于非极性的溶剂中，亲水性的成分易溶于极性的溶剂中。（三）溶剂的极性

5石油醚＜苯(C6H6)＜乙醚(Et2O无水)＜氯仿(CHCl3)＜乙酸乙酯(EtOAc)＜正丁醇(n-BuOH)＜丙酮(Me2CO)＜乙醇(EtOH)＜甲醇(MeOH)＜水(H2O)与介电常数ε有关，介电常数越大，极性越大。极性从低到高的顺序依次是：第5页,共67页，2024年2月25日，星期天6水极性低高亲脂性有机溶剂亲水性有机溶剂与水分层的有机溶剂?能与水分层的极性最大的有机溶剂?与水可以以任意比例混溶的有机溶剂?极性最大的有机溶剂?极性最小的有机溶剂??第6页,共67页，2024年2月25日，星期天1、水：

为极性最大的溶剂，适用于提取水溶性成分。如：苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、有机酸盐、亲水性色素、无机盐。其中蛋白质不溶于热水。

优点：价廉、安全、无毒、对组织穿透力强。缺点：提取液易发霉，蒸发浓缩耗能大，含多糖类原料过滤困难。7常见溶剂的适用范围第7页,共67页，2024年2月25日，星期天2、亲水性有机溶剂（丙酮、乙醇、甲醇）：

以乙醇最常用。提取范围较广，除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉、部分多糖和油脂等外，大多天然药物化学成分能在乙醇中溶解。优点：对组织细胞穿透力强，提取全面，毒性小，易过滤，不霉变，易浓缩回收。缺点：价高、易燃，需回流设备。8第8页,共67页，2024年2月25日，星期天3、亲脂性有机溶剂：

与水不相混溶的石油醚、苯、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂。用以提取挥发油、苷元、蒽醌类、游离生物碱、黄酮等亲脂性成分。

优点：提取专属性强（提出物较纯，杂质少）,易回收浓缩。

缺点：价高、易燃、有毒、穿透性差、对设备要求高。9第9页,共67页，2024年2月25日，星期天（四）溶剂选择的原则

10基本要求：1、对所提取成分的溶解度大，对杂质的溶解度小；2、对目标组分不起化学反应；3、经济易得，低毒安全，使用方便；4、沸点适中，易回收。

选择适当的溶剂是提取步骤的关键。主要根据溶剂的极性、被分离成分的性质、共存的其它成分（杂质）的性质三个方面。第10页,共67页，2024年2月25日，星期天（五）操作方式1、浸渍法2、渗漉法3、煎煮法4、回流提取法5、连续回流提取法6、超声提取法11根据目标组分的极性、热稳定性、挥发性和溶剂的性质等选用合适的方式。第11页,共67页，2024年2月25日，星期天1、浸渍法：

将药材用适当的溶剂在常温或温热（40-60℃）的情况下浸泡一定时间，以溶出其中成分。12冷浸法：室温（15-25℃）温浸法：40-60℃多重浸渍法：重复浸提2-3次分类乙醇(最常用)水（酸/碱）第12页,共67页，2024年2月25日，星期天粉碎好的药材放入提取用的容器中，加入溶剂使没过药面，浸泡。滤出溶剂，加入新的溶剂继续提取（多重浸渍）。加入溶剂浸泡浸泡后浸渍法第13页,共67页，2024年2月25日，星期天14本法适用于有效成分遇热易破坏以及含大量淀粉、树胶、果胶、粘液质等多糖药物的药材的提取。

优点：操作方便，简单易行。

缺点：浸出效率较低，故对贵重、有效成分含量低、需制成高浓度制剂的药材的提取不宜采用；耗时长，溶剂用量大，水提液易发霉。浸渍法第14页,共67页，2024年2月25日，星期天2、渗漉法：将药材粉末装在渗漉筒中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉筒下部流出浸出液的一种浸出方法。

本法适用于有效成分遇热易破坏的药材及有效成分含量低的药材。优点：提取效率较高，浸出液较澄清。缺点：耗时长，溶剂用量大，操作麻烦。15动态提取良好的浓度差第15页,共67页，2024年2月25日，星期天渗漉法连续渗漉装置粉碎浸润装筒排气浸渍渗漉收集提取溶剂粉碎药材棉花或纱布渗漉液第16页,共67页，2024年2月25日，星期天3、煎煮法（热提取，只能用水做溶剂）：

煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。适用于有效成分能溶于水且不易被水、热破坏的天然药物的提取。

优点：

简便易行。缺点：提出杂质多；不能用于提取含挥发油成分及遇热不稳定性成分的提取；含多糖类丰富的药材，因煎液粘稠，难以滤过。17第17页,共67页，2024年2月25日，星期天18煎煮法“加水煮沸，去渣取汁”药材加水浸泡加热至沸微沸状态一定时间滤取煎液

重复1-2次合并煎液第18页,共67页，2024年2月25日，星期天4、回流提取法：

用低沸点、易挥发的有机溶剂加热提取天然药物中有效成分时，需采用回流提取法以减少溶剂的挥发损失，提高浸出效率。19乙醇、甲醇、三氯甲烷、苯适用于脂溶性较强的天然药物化学成分的提取。第19页,共67页，2024年2月25日，星期天20回流提取法优点：提取效率较高。缺点：受热时间较长，不能用于热不稳定性成分的提取；且溶剂消耗量仍大，操作较麻烦。?改进

第20页,共67页，2024年2月25日，星期天5、连续回流提取法：

为了弥补回流提取法中需要溶剂量大，操作较烦琐的不足，可采用连续提取法，即用最少量溶剂最大限度地提出有效成分。适用范围：脂溶性化合物。装置：脂肪提取器或称索氏提取器。

21第21页,共67页，2024年2月25日，星期天22

连续回流

(索氏提取)

优点：提取效率最高，最节省溶剂。缺点：回流时间长（4-10h），不能用于热不稳定性成分的提取。第22页,共67页，2024年2月25日，星期天6、超声提取法

原理：利用超声波的空化作用对细胞膜的破坏，有助于有效成分的溶出与释放；超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散；同时超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。

提取速度快、时间短、收率高、无需加热。

是一种利用超声波浸提有效成分的方法。23助溶第23页,共67页，2024年2月25日，星期天1、溶剂性质2、操作方式（方法）3、药材粉碎度4、温度5、时间6、其他因素24（六）影响提取的因素选择合适的溶剂和操作方式是关键！第24页,共67页，2024年2月25日，星期天二、其他提取方法水蒸气蒸馏法﹡25是将含有挥发性成分的药材与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的浸提方法。道尔顿分压定律：P=P水+P不溶物质P等于外界大气压的时候，混合物沸腾。因此在常压下应用水蒸气蒸馏，能在低于100℃的情况下将高沸点组分与水一起蒸出。第25页,共67页，2024年2月25日，星期天26水蒸气发生部分蒸馏部分冷凝部分接收器防止液体倒吸和系统堵塞！第26页,共67页，2024年2月25日，星期天进行水蒸气蒸馏的物质必须具备以下三个条件：27该法适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏的中草药成分的提取。主要用于挥发油的提取。1、不溶或难溶于水；2、共沸下与水不发生化学反应；3、在100℃左右时，必须具有一定的蒸气压。第27页,共67页，2024年2月25日，星期天28升华法

有些固体物质受热后会直接汽化，遇冷后又凝固为原来的固体化合物，该现象称之为升华。对于具有升华性质的有效成分，可采用升华法提取。如从樟木中提取樟脑，从茶叶中提取咖啡因。此法简单易行，但在实际提取时很少采用。因为升华所需温度很高，中草药容易炭化，炭化后产生的挥发性的焦油状物，容易黏附在升华物上，不易精制除去；其次，升华不完全，产率低，有时还伴随有分解现象。第28页,共67页，2024年2月25日，星期天29超临界流体萃取法（SFE）利用超临界流体优良的溶解性能对成分进行提取和分离的新技术。

特点：

流体密度近似液体，粘度与气体相似。扩散力和渗透性优于液体，介电常数随压力增大而增加，有利于溶质的萃取，无溶剂残留。常用作超临界流体的物质：二氧化碳、氧化亚氮、乙烷、乙烯和甲苯等。第29页,共67页，2024年2月25日，星期天表1、天然药物提取方法小结提取方法溶剂操作提取效率使用范围备注浸渍法水或有机溶剂不加热效率低各类成分，尤遇热不稳定成分出膏率低，易发霉渗漉法水或有机溶剂不加热—脂溶性成分消耗溶剂量大，费时长煎煮法水直火加热—水溶性成分易挥发、热不稳定不宜用回流提取法有机溶剂水浴加热—脂溶性成分热不稳定不宜用，溶剂量大连续回流提取法有机溶剂水浴加热节省溶剂、效率最高亲脂性较强成分用索氏提取器，时间长水蒸气蒸馏法水水蒸气蒸馏—挥发性成分，与水不相混溶工艺简单，但适用范围较窄升华法无直火/水浴/油浴

—升华性成分操作时间长，物质易分解30第30页,共67页，2024年2月25日，星期天第二节分离精制方法与技术31天然药物粗提液是多种物质的混合，需要进行进一步的分离和精制。分离精制前需浓缩提取液，减压蒸馏为最常用的方法。“去其糟粕，取其精华”旋转蒸发仪第31页,共67页，2024年2月25日，星期天32一、系统溶剂分离法：溶解度差异﹡二、两相溶剂萃取法：分配比差异﹡三、沉淀法：溶解度/酸碱度差异﹡四、结晶与重结晶法：溶解度差异﹡五、透析法：分子大小差异六、分馏法：沸点差异七、色谱法：吸附、分配以及亲和力差异﹡分离依据：共存成分的性质差异寻找差异利用差异第32页,共67页，2024年2月25日，星期天一、系统溶剂分离法﹡是一种按极性由小到大的顺序，选用不同极性的溶剂组成溶剂系统，依次分离提取液中各种不同成分，使各溶解度有差异的成分得到分段分离的方法。提取液浸膏/惰性吸附剂……第33页,共67页，2024年2月25日，星期天表3、天然药物成分及其较适用的提取分离溶剂天然药物成分的极性天然药物成分的类型适用的提取分离溶剂强亲脂性挥发油、脂肪油、蜡、脂溶性色素、甾醇类、某些苷元石油醚、乙烷亲脂性苷元、生物碱、树脂、醛、酮、醇、醌、有机酸、某些苷类乙醚、氯仿中等极性小某些苷类（如强心苷类）某些苷类（如黄酮苷类）

某些苷类（如皂苷、蒽醌苷类）氯仿：乙醇（2：1）乙酸乙酯正丁醇中大亲水性极性很大的苷、糖类、氨基酸、某些生物碱丙酮、乙醇、甲醇强亲水性蛋白质、粘液质、果胶、糖类、氨基酸、无机盐类水34第34页,共67页，2024年2月25日，星期天35此法是早年研究天然药物有效成分的一种最重要的方法，主要用于分离提纯含有极性不同的各种化学成分的中药提取液。目前仍是研究不明成分最常用的方法。此法操作繁琐，相同成分可能会散在不同的抽提部位，不易浓集。限制了微量成分、结构性质相似成分的分离纯化。特点适用范围第35页,共67页，2024年2月25日，星期天二、两相溶剂萃取法﹡36原理：利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数的差异而达到分离的方法。

分配系数

K=CU/CL

CU、CL

分别为溶质在上相、下相的平衡浓度。

K相差越大,分离效率越高。举例：A、B两种溶质在CHCl3/H2O中进行分配，如A、B均为1克，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比为VCHCl3/VH2O=1，在分液漏斗中作一次振摇分配平衡后，90%以上的溶质A将分配在上相溶剂（水）中，不到10%的A分配到下相溶剂（氯仿）中。同样的道理，溶质B分配将与A相反。第36页,共67页，2024年2月25日，星期天分离难易与分离因子β

37β≥100时一次简单萃取即可将二者分开;100＞β＞10时，需萃取10~12次;β≤2宜用逆流分溶法;β≈1不能用本法分离。定义：A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值(注：KA＞KB)。

分离因子β=KA/KB

β越大,两种溶质越易分离。第37页,共67页，2024年2月25日，星期天分配比与pH38

对酸性、碱性及两性化合物来说，分配比还受溶剂系统pH的影响。因为pH的变化可以改变它们的存在状态（游离型或解离型），从而影响在溶剂系统中的分配比。

一般pH

3时，酸性物质多呈非解离状态（HA）、碱性物质则呈解离状态（BH+）存在；但pH

12，则酸性物质多呈解离状态（A-）、碱性物质则呈非解离状态（B）存在。?如何利用第38页,共67页，2024年2月25日，星期天萃取溶剂的选择39萃取分离必须满足两个条件：（1）两相溶剂必须互不相溶；（2）被分离各成分有不同分配系数。举例：药材水提液中亲脂性成分,可用石油醚、苯、氯仿、乙醚萃取；中等极性成分用乙酸乙酯萃取；亲水性成分可用正丁醇、异戊醇等萃取。第39页,共67页，2024年2月25日，星期天1、简单萃取法2、pH梯度萃取法3、逆流连续萃取法4、逆流分溶法两相溶剂萃取常用方法与技术40第40页,共67页，2024年2月25日，星期天1、简单萃取法:萃取操作原则：“少量多次”。操作注意（1）水提液的相对密度应在1.1-1.2之间。（2）防止乳化。41实验室用分液漏斗;一般在水和亲脂性有机溶剂中进行。第41页,共67页，2024年2月25日，星期天422、pH梯度萃取法：

利用不同成分的酸碱性的差异，在某一定pH下，某些成分可以成盐或游离，改变该成分在溶剂系统中的分配系数而与其它成分分离。举例：用pH梯度萃取法的萃取剂分离某有机溶剂中的黄酮类化合物，可依次选用pH由低到高的碱液如5%碳酸氢钠、5%碳酸钠、0.2%氢氧化钠、4%氢氧化钠的水溶液做萃取剂进行萃取，使成盐而达到分离目的。第42页,共67页，2024年2月25日，星期天3、逆流连续萃取法原理：利用两相互不相溶的溶剂相对密度的不同，使相对密度小的液相做为移动相，逆流穿过相对密度大的作为固定相的相液，借以交换溶质而达到分离的目的。优点：操作简单、避免乳化、溶剂用量小、萃取效率高。43第43页,共67页，2024年2月25日，星期天例如：用氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素。将氯仿盛于萃取管内，而比重小于氯仿的水提取浓缩液贮于高位容器内，开启活塞，则水浸液在高位压力下流入萃取管，遇瓷圈撞击而分散成细粒，使与氯仿接触面增大，萃取就比较完全。44逆流连续萃取法如果一种药材的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进行萃取，则需将水提浓缩液装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。第44页,共67页，2024年2月25日，星期天454、逆流分溶法此法相当于多次萃取，对于分离具有非常相似性质的混合物效果较好。β<50时采用。在No.0漏斗中溶入溶质并加入流动相。振摇使两相溶剂充分混合，静置分层后，分出流动相，令其移入No.1管，再在No.0管中补加新鲜流动相，再次振摇混合，静置分层并进行转移。如此连续不断地操作下去，溶质即在两相溶剂中，不断地重新分配并达到分离的目的。第45页,共67页，2024年2月25日，星期天46三、沉淀法﹡指在天然药物的提取液中加入某些试剂，使部分物质生成沉淀或降低溶解性而从溶液中析出，从而获得有效成分或去除杂质的方法。分类酸碱沉淀法试剂沉淀法铅盐沉淀法可逆可逆/不可逆可逆第46页,共67页，2024年2月25日，星期天1、酸碱沉淀法47通过加入酸、碱以调节溶液pH值改变分子的存在状态，从而改变溶解度而达到分离的目的。47游离型/分子态解离型/离子态H+BH+BOH-H+A-HAOH-脂溶性水溶性第47页,共67页，2024年2月25日，星期天48A．酸/碱法（酸提取碱沉淀法）

——生物碱的提取、纯化药材（B）药渣酸水提取液稀酸水提取（BH+

）碱化沉淀（B）碱水液（水溶性杂质）（脂溶性杂质）第48页,共67页，2024年2月25日，星期天49药材（HA）药渣碱水提取液碱水提取（A-

）酸化沉淀（HA）酸水液（水溶性杂质）（脂溶性杂质）B．碱/酸法（碱提取酸沉淀法）

——黄酮、蒽醌等酚性成分的提取、纯化第49页,共67页，2024年2月25日，星期天502、试剂沉淀法：利用一些成分能与某些试剂产生沉淀的性质，或利用某些成分在不同溶剂中溶解度的差异，通过加入特定试剂或者溶剂，使生成沉淀，从而与其他成分分离。

举例1：在生物碱盐的溶液中，加入某些生物碱沉淀试剂（见生物碱性质下），则生物碱生成不溶性复盐而析出。水溶性生物碱难以用萃取法提取分出，常加入雷氏铵盐使生成生物碱雷氏盐沉淀析出。胆固醇与甾体皂苷生成沉淀；蛋白质与鞣质形成沉淀等。化学反应试剂生成不溶性物质第50页,共67页，2024年2月25日，星期天51水提醇沉法：除去多糖、蛋白质、淀粉、无机盐等水溶性杂质。醇提水沉法：除去脂溶性的油脂、树脂、叶绿素等水不溶性杂质。天然药物中大多数化学成分易溶于水和醇。加入极性不同试剂改变溶解度举例2：

第51页,共67页，2024年2月25日，星期天3、铅盐沉淀法

52铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。中性醋酸铅可与酸性物质或某些酚性物质结合成不溶性铅盐。脱铅法：（1）硫化氢脱铅法（PbS沉淀）

（2）硫酸、磷酸及其钠盐脱铅法

（3）离子交换脱铅法第52页,共67页，2024年2月25日，星期天四、结晶和重结晶法﹡53结晶和重结晶是利用固体混合物中各种成分在溶剂中的溶解度的差别，使所需成分以结晶状态析出，达到分离精制的目的,可获得较纯的单体。使物质从液态或气态形成晶体的方法即结晶法。将不纯的结晶进一步精制成较纯的结晶的过程称重结晶。

在溶液中，溶质的过饱和是其结晶的驱动力，天然药化最常采用的结晶法为降温结晶法。第53页,共67页，2024年2月25日，星期天结晶溶剂的选择54（1）不与结晶物质发生化学反应；（2）对结晶物质的溶解度随温度不同有显著差异，热时溶解度大，冷时溶解度小；对可能存在的杂质溶解度非常大或非常小；（3）沸点适中，不宜过高或过低（35~135℃）。常用溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等；（4）若无理想单一溶剂时，还可用混合溶剂。第54页,共67页，2024年2月25日，星期天采用试验的方法选择合适的溶剂55例如：取0.1g目标物质于一小试管中，滴加约1mL溶剂，加热至沸。若完全溶解，且冷却后能析出大量晶体，这种溶剂一般认为合用。如样品在冷时或热时，都能溶于1mL溶剂中，则这种溶剂不合用。

若样品不溶于1mL沸腾溶剂中，再分批加入溶剂，每次加入0.5mL，并加热至沸。总共用4mL热溶剂，而样品仍未溶解，这种溶剂也不合用。若样品溶于4mL以内的热溶剂中，冷却后仍无结晶析出，这种溶剂也不合用。

如果难于选择一种适宜的溶剂，可考虑选用混合溶剂。混合溶剂一般由两种能互相溶解的溶剂组成，目标物质易溶于其中之一种溶剂，而难溶于另一种溶剂。第55页,共67页，2024年2月25日，星期天56食盐晶体单晶冰糖薄荷醇晶体小檗碱晶体第56页,共67页，2024年2月25日，星期天

结晶的条件：溶剂、杂质的去除、有效成分的含量、溶液的浓度、温度、时间等。57判断结晶纯度的方法：1、晶形、色泽（初判）；2、熔点测定：纯品—熔距小；3、薄层色谱法：用三种以上不同展开系统，只出现一个斑点时可初步判断为单一成分；4、光谱测定（紫外光谱、红外光谱）第57页,共67页，2024年2月25日，星期天待分离混合物

饱和溶液

结晶

粗结晶溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，热过滤放置（冷藏）析晶，过滤重复上述操作（重结晶）结晶操作步骤：第58页,共67页，2024年2月25日，星期天注水孔：加入水的高度为漏斗高度的的