临床微生物学实验手册

临床微生物学实验手册

刖百

临床微生物学实验须知

-实验规则

临床微生物学实验的对象大多为致病性微生物，工作中经常使用电源和易燃物品，为了

防止发生实验室感染与火灾、烧伤、触电等意外事故外，必须严格遵守下列规则。

1进实验室应穿工作服，只带必要的文具和讲义等。

2实验室内保持肃静、整洁，禁止饮食、吸烟和开玩笑。实验时严肃认真、集中精力完成

实验操作，操作过程中，不应谈话，不旁视，养成在室内手不触及口腔、头发及身体的习惯,

长头发者消将头发向后扎紧或戴工作帽，以防头发被污染或烧焦。

3发生操作事故，工作环境被带菌材料污染，立即报告教师进行处理。

4实验用过的带菌材料（如吸管、玻片等）必须立即放在指定的消毒缸内，不得放置实验台

上。待消毒或废弃物品放在指定地点。实验室内任何物品不得带出室外。

5实验完毕时，必须整理清洁实验台和实验室，关好水、电、门窗等。

6离室前应用肥皂和水洗手，并用消毒剂擦手。

二实验课的基本要求

1实验前必须认真做好预习，教师将检查预习情况。

2实验时严格遵守实验规则，认真做好每个实验。

3实验后必须按本人所得实验结果如实写出实验报告，并通过复习有关理论知识，对自己

的实验结果作出分析和解释。

4实验课是本门课程的重要内容，教师将根据实验课表现，实验结果、实验报告及实验考

核评定成绩，并作为总成绩的重要组成部分。

第一章临床细菌学基本技术

第一节普通光学显微镜

显微镜的光学原理、使用方法和保养详见有关教材。

第二节形态学检查技术

1.2.1不染色细菌标本的检查法

不染色的细菌标本的镜检，虽可观察细菌的大小、形态，但主要用于观察细菌的动力。

（-）悬滴法

【操作方法】

I取凹玻片，于凹窝内周围涂凡士林（可浆糊）少许。

2在盖玻片中央放一接种环细菌的肉汤培养物。

3将凹玻片反转，使凹窝对准盖玻片中央并盖于其上，然后翻转玻片，以小镜子或接种环

柄轻加压力，使盖玻片与凹窝边缘沾紧。如无凹玻片时，亦可在载玻片之适当位置上加凡士

林，其中垫以其他物体，然后使盖玻片重叠于玻片之上.

4将制好的悬滴标本置于显微镜载物台中央，先以低倍镜找到悬滴的边缘以后，将集光器

下降缩小光圈，再换高倍镜观察。

【结果】有鞭毛的细菌为真正运动，无鞭毛的细菌则为布朗运动。

【用途】用以观察的形态及动力。

（二）悬滴法

【操作方法】

1用接种环取菌液（或将少许固体培养物悬于一滴生理盐水中）2-3环。置于载玻片中央。

2用镜子夹好盖玻片、覆盖开菌液上，在放置时，先将盖玻片一边接触菌液，缓缓放一，

以不产生气泡为泡佳。

3先以低倍镜找好位置，再以高倍镜观察。

【结果】与悬滴法相同。

【用途】用以观察细菌的形态及运动，本法较悬滴法简单，但标本容易干涸，不易长时间观

察。

1.2.2细菌染色的基本步骤

1涂片

1.1于洁净无油脂载玻片中央加一滴生理盐水。

1.2用经火灭菌的接种环挑取标本少许，放在生理盐水滴内研匀涂成菲薄的菌膜，若为液

体标本，直接挑取少许涂抹即可。

1.3若为多标本而行用一染色时，可事先用蜡笔在玻片上划为数格，并于玻片的背面标明

标本编号。

2干燥一般在室温中待其自然干燥，若须加速干燥，可在火焰上方的热空气中加温干燥,

但切勿紧靠火焰，以防标本烤枯，不堪检视。

3固定固定的目的主要使细菌的细胞质凝固，杀死细菌，使菌体与玻片粘附得较牢，以

及改变菌体对梁料的通透性，通常用加热法，即将涂片迅速通过火焰2-3次，以玻片反面触

及皮肤，热而不烫为度。

4染色将涂片置染色架上，滴加染液以覆盖标本为度。

5媒染主要是增强菌体与染液间的作用力，其方法有用热、金属盐、碘等。

6脱色目的在于测知染料与被染物之间结合的牢固程度，起鉴别鉴别细菌的作用，将脱

色剂(例如酒精和酸等)滴加于经过染色的标本上，作用一定时间后除去脱色剂。

7复染目的在于使己脱色的菌体重新染色与前染液颜色呈明显对比之颜色。

8染色标本的保存与卦片法，观察细菌染色标本均用油浸镜。如需要保存标本，可于观察

后，拭镜纸沾二甲苯轻轻将镜油擦去即可，若长期保留，最好于标本中央滴一滴加拿大树胶,

上覆盖一洁净载盖片。待其自然干燥后，保存于玻片盒内，可多年不变色。

1.2.3革兰氏染色法

【染色液】

1结晶紫溶液称取结晶紫4-8g,溶于95%酒精100ml中，制成饱和液，再取饱和液20ml

与10g/L的草酸镂溶液80ml混合即成。

2卢戈氏碘液先溶碘化钾2g于10ml蒸镭水中，再加碘1g,待碘全部溶解后，加蒸储水

200ml即成。

3脱色剂

(1)95%酒精

(2)丙酮乙醇溶液(95%乙醇70ml加丙酮30ml)。此两种脱色剂均可应用，但混合脱色剂比

单用95%酒精好，易于掌握，反应准确。

4复染液

(1)稀释石炭酸复红液：取萋-尼二氏抗酸染色液中的石炭酸复红液(碱性复红酒精饱和液

10ml与5%石炭酸90ml混合)10ml加入蒸储水90ml即成。

（2）沙黄溶液（25g/L的沙黄乙醇溶液10ml加蒸储水90ml）«

【操作方法】

1将结晶紫染液滴加在已固定的涂片上，染Imin后水洗。

2加卢戈氏碘液适量，染Imin后水洗。

3用95%酒精脱色，摇动玻片至紫色不再为酒精脱落为止（根据涂片上之厚薄约需0.5-lmin）

后水洗

4用稀释石炭酸复红染30s至Imin。

5用水冲洗，待干，镜检。

【结果】革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。

【注意事项】

新配制的染液应先用已知的革兰氏阳性菌和阴性菌（通常用金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的

16小时培养物）进行对照试验。以检查染色液的质量是否适用。

结晶紫与草酸镂溶液混合后不能保存太久。如有沉淀出现，应重新配制使用。

第三节高压蒸汽灭菌技术

高压蒸汽灭菌法是细菌室对实验室材料进行灭菌的主要手段。主要设备是蒸汽高压锅。

有卧式和立式两类。此外还有手提式小型高压锅，使用比较方便。

高压灭菌的原理是利用增加锅内蒸汽的压力而提高蒸汽温度，达到全部杀灭微生物的作

用。压力与温度的关系见表1—3—1

压力

温度（℃）

公斤/CM磅

0.355108

0.7010116

1.0515121

1.4020127

表1—3—1压力与温度的关系

现在最常用的培养基灭菌条件是15磅15分钟,时间过长有可能破坏培养基的营养成分。

含糖的生化培养基的灭菌条件是10磅15分钟，或用流动蒸汽法灭菌。器皿的灭菌可以15

磅20分钟。高压灭菌操作方法如下：

欲灭菌物品放入锅内，关闭锅门，拧紧螺丝。确认己经密闭，可进行下一步操作。

打开排气阀。

开蒸汽开关，向锅内送蒸汽或电源，使产生蒸汽。

观察排气阀的排气情况，待排出的气体由冷空气变为蒸汽，温度为105℃时，可关

闭排气阀。

高压灭菌时须注意，必须待锅内冷气完全排出后才可关闭排气阀加压，不然达不到灭菌

效果。有数据表明，在15磅含有40%空气的温度约为105℃。由此可见，如果锅内残留有

冷空气，即使压力达到15磅，温度也达不到121℃,不能杀灭微生物。

观察压力表升至15磅时，开始记住。

压力达到15磅后，可调节进气阀，减少进气量。维持压力稳定在15（1公斤/cm?）磅。

电加热时，可以断和接通电源、维持压力。持续15分钟，至少不能超过30分钟，否则营养

物破坏。

关掉进气阀门或切断电源，让锅内物品自然冷却，不可马上打开排气阀，以免发生意外。

待锅内压力降为零时，才可以打开锅门，取出物品。灭菌培养基时，必须及时打开锅盖,

不然培养基的颜色回变深。

第四节培养基制备技术

传统的制备培养基方法是在实验室内由自己配制。但现在越来越多的实验室使用成品干

燥培养基。由于成品培养基由生产厂统一购制原料生产。如果有较好的产品质量保证，质量

是可靠的。使用干燥培养基有不少优点，但使用时还有些技术问题应当注意。

1）溶化配制的培养基必须在玻璃器中进行。如用铜、铁器器皿，会影响细菌生长。一般

先将需要的蒸播水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉，放入水中，静置10-

20分钟。除琼脂外，一般成分均可自然溶解。注意不可先加干粉后加水，这不利于溶解。

搅拌或振荡器皿后或延长放置时间以促进溶解。只有不得已（或需要）的情况下加热溶解。

但加热时间不宜过长。温度不宜过高。因高热对琼脂及某些营养成分有破坏作用。

2）调节pH：商品干燥培养基一般已校正PH用时须再验证。常用的分离培养基PH为7.2

-7.4o高压灭菌前，可用PH计校正。由于高压灭菌可影响PH,所以验证PH还应在高压

灭菌后进行。最简便的方法是用精密PH试纸插入起倾制好的琼脂平板或分装试管的液体培

养基中，判断是否符合要求。

3）分装：液体培养基一般在灭菌前分装，分装是应注意每管的分装量不应高于试管的2/3。

在灭菌后，还要加入成分的液体培养基及半固体培养基，要在高压灭菌后分装。

琼脂平板是在培养基高压灭菌之后制备，应等培养基冷至50—60℃再倾平板，否则水

蒸汽多。加入培养基中的血液如果保存在冰箱，用前应提前取出。暖至室温后，再加到培养

基中。

一般倒在玻璃平皿中的琼脂平板在无菌室中放置3-4小时或过夜，平皿内的水蒸汽会

自然蒸发。如果用塑料平皿，因密闭较严，须在35℃培养基中烘烤30—60分钟。方法是将

平板放入卵箱，正面向下。以防细菌落入而污染。卵箱门不要关严。应留一点缝隙，使水蒸

气排到箱外。用这种烤法要定时检查。以免烤干。琼脂平板放4℃冰箱保存。

4）质量检查

（1）无菌试验：可将制好的培养基在35℃卵育过夜，判定是否灭菌合格。另一种简便的方

法是制作的平板在无菌室放置室温（20℃—30℃）过夜。一方面可使水蒸气干，另一方面可

以判断是否有污染。

（2）效果检验：按不同的培养基要求接种相应的菌株。观察细菌的发育、菌落形态、色素溶

血等特征，判断培养基是否符合要求。

5）保存：液体培养基如无特殊要求可在室温中保存，两周内用完。过于干燥的地区应缩短

保存期。琼脂平板须在4℃保存，一般不超过4天。如用塑料袋密封，保存期可延长，但至

多两周。

保存的培养基是否能用，须视培养基中水份蒸发程度及有无污染而定。

第五节指示剂的配置技术

指示剂一般是加在培养基中，来指示细菌代谢后培养基PH的变化。常用指示剂如见表

1—5—1。

指示剂PH范围酸色一碱色

甲基红4.2—6.2红一黄

澳甲酚紫5.2—6.8黄一紫

溪麝香草酚兰6.0—7.6黄一兰

酚红6.8—8.7黄一红

中性红6.8—8.0红一黄

表1-5-1常用指示剂的变色性

配置指示剂用的溶剂有两种：乙醇和蒸储水。两种溶液各有不同用途，使用时应注意.

指示剂的乙醇溶液多用于培养基的PH滴定。由于指示剂在乙醇中溶解度较大，所以在

需制备高浓度溶液时用乙醇作为溶剂。制备生化反应培养基，要慎用乙醇做溶剂。因为某些

细菌可以利用乙醇进行代谢，产生酸性反应。如果用乙醇液的指示剂制备发酵培养基，将会

影响试验结果的可靠性。所以，制备生化培养基以水溶液为佳

指示剂的水溶液往往不易完全溶解，实际上是混悬液。此液可用来制备培养基，但应注

意在取液前，必须充分摇匀，以保证取量正确。

每种指示剂的具体配制浓度见各有关部分。

配制指示剂的一般步骤：

1.称一定量指示剂化学品。

2.放入研钵中，加入少量溶剂研磨。

3.吸取溶解的研磨液，置试剂瓶中。

4.加入溶剂，继续研磨。

5.如此反复，至所有指示剂均磨细并成为溶液。

6.加溶剂补足定量。

第六节接种和移种技术

接种和移种是细菌实验工作中最基础最常用的操作技术。正确掌握这项技术可以保证细

菌传代的成功和防止自然环境的污染，获得纯培养物。

(1)左手的操作要点：左手负责持琼脂平板、试管、烧瓶等物品。操作中，左手尽量减少

移动，否则，不利于保持物品的无菌状态。要点如下：

①、左手持物品时，不应随时移动。最好固定在一个空间方位上，这可避免因移动使空气中

的细菌进入器皿

②、左手所持的试管、平皿、烧瓶应尽量避免使其入口向上。持平皿时，可以让琼脂平板的

表面与地面尽量垂直。持烧瓶和试管也可倾斜，使瓶口表面与地面垂直。当从平板上挑菌落

时，每次取菌完毕应立即扣回盖上。只有需再取菌时，左手才可将平皿持起。

(2)、右手的操作要点：右手持接种工具取菌并划种。右手的小指负责打开试管或烧瓶的塞

子，并持在手中。此时应注意塞子始终向下，并不触及任何物品。待从试管中取菌或接种完

毕，立即塞上塞子。

在每次取菌或接种前及操作后，均须烧灼接种器具。烧灼时，接种环指向地面，由环或

针头开始过火焰，并逐渐移向整个环和针。烧红为止。稍待片刻冷却后，可使用或放回。

接种环在使用时，应先在氧化焰中烧红银丝。再平持，使金属柄在火焰中通过3次灭菌。

如直接将接种环在氧化焰中烧灼，环上细菌或标本可因受高热爆烈四溅。做结核菌实验时，

接种环应采用煮沸灭菌。即使用后的接种环也应直接放入沸水中，煮沸灭菌。因结核菌体本

身易爆烈溅出，近年来有电热接种环灭菌。灭菌时细菌不致四溅。

(3)、移种或接种的基本步骤

1右手持接种工具，在火焰上烧灼灭菌。

2左手持起标本盒或原代培养物的平皿试管等。

3用工具挑取适量标本或细菌。挑临床标本时，应注意选择真实反映感染情况的饿部分，

如痰液需挑脓块，避开口水；痢疾粪便挑取脓血部分等。从原代培养物上挑菌，用于分纯做

生化反应的，应挑取单个菌落；用于分离的，应挑取多种菌混合生长区域的；用于药敏试验

的，应多取几个菌落。从液体中取菌，只需将环在培养液中蘸取一满环即可。

4接种到新的培养基上。如接种到平板上，可按目的用分区划线或区域涂布的接种法。接

种到液体中时，可将接种环挑出的菌落在试管有液体的管壁上研磨，细菌可转入液体中。做

穿刺接种时，可垂直刺入高层琼脂中，并沿线取出，须注意不要一直穿刺到管底。

5接种后，在火焰上烧灼接种用具，放回原处。

第七节分离和纯化技术

分离和纯化是细菌学实验技术中两个不同的概念。分离是指从原始材料（临床标本）或

多种细菌的混合培养物中将各种细菌彼此独立地分离开，以得到纯净的单一菌落。纯化是对

单一菌落进行大量扩增，以得到大量的纯培养物。因为两种概念的目的不同，得到的产物也

不同。

做分离时，一般须用一只完整的琼脂平板。划平板多采用分区划线法，在一只平板中可

划4〜5区。划法有两种。从含菌数较少的临床标本中分离细菌时，可用接种环取一标本涂

布在平板边缘，然后从此区开始密划线至1/3平板，为第一区，环上的标本应全部涂在此区

内。接下来以第一区的一角为起点，密划线至1/3平板为第二区。此区的部分划线须与第一

区的部分划线重合，这样，第一区划线上的部分被按此法划第二区。须注意，第三区的划线

只能接触第二区的划线。而不能触及第一区，否则达不到进一步稀释的目的。还可以划第四

区乃至第五区。分区划线的效果及几个区合适是以最后出现单个菌落为依据。

另外一种方法与前述的基本相同，用与由混合细菌培养物的分离。用接种环挑取混合培

养物。在平板边缘密涂。然后用火焰烧灼接种环，使无菌。以密涂区域为起点，做分区划线。

但仅第一划线接触涂在细菌的区域。划完第一区后，烧接种环使无菌。然后再划第二区，烧

接种环，再划第三区，依此类推，做法如图1-7-1所示。

图1-7-1平板分区划线（左）及培养后菌落示意图

纯化是指欲获得大量纯培养物的方法，造作比较简单，所用平板大小可根据需要的菌量

而定。

如需要大量的纯培养物，用接种环挑单个菌落，在平板上密涂划线，经过孵育即得到大

量纯培养物。如果需要的纯培养量不大，仅是为了作生化反应等，可采用另一种方法.即用

一接种针顶部弯一段成约30°角，弯部长约5mm..做纯化操作时，用针在菌落上蘸几下，

然后在琼脂平板上划一竖线，使针上的细菌接种在培养基上.接着用接种针的弯部沿划线做

垂直方向的密涂，由于用长约5mm一段接种针涂菌，对平板的利用程度高，划线液方便，

见图如此，一只平板可纯化6〜8株细菌。

纯化不应使用选择平板。

第八节细菌血清学试验

1.8.1玻片法凝集试验

本法系用已知免疫备血清（诊断血清）。在玻片上直接与细菌培养物或菌悬液混合，在电

解质存在下，若有相应细菌，则出现肉眼可见的凝集块或颗粒。这是鉴定细菌最常用的方法。

【方法】

1取一洁净载玻片，用蜡笔划分二等分。

2取1：5或1:10免疫血清（市售诊断血清已作稀释，用前不必再稀释）1接种环置于玻

片的左端。在右端放1接种环生理盐水（阴性对照用）。

3用接种环取待鉴定菌培养物，分别于免疫血清及盐水混匀。反复倾倒玻片，约1-3

分钟后观察结果。

【结果判定】

阴性：试验一侧及对照一侧均匀混浊。

阳性：试验一侧明显凝集，对照一侧均匀混浊。

自凝：试验一侧及对照一侧皆凝集。

【应用】本法简单易行且特异性强。主要用于鉴定菌种及菌型，如沙门氏菌、志贺氏菌、

布鲁氏菌、致病性大肠埃希氏菌、霍乱弧菌，脑膜炎奈瑟氏菌，肺炎链球菌和链球菌等的鉴

定。

【注意事项】

1、有些细菌表面常有一层表面抗原、如伤寒沙门氏菌的vl抗原及志贺氏菌属的k抗原等。

它能阻抑菌体抗原与免疫血清的凝集。而导致错误的判定。此时应将菌悬液于100C中煮沸

1小时、以破坏其表面抗原，然后再作试验。若为伤寒沙门氏菌，亦可用抗Vi免疫血清直

接检测。

2、每作一次鉴定，至少须从一个平板上挑选3〜5个以上的S型菌落作试验，以免遗漏。

3、霍乱弧菌易出现自凝，故应改用0.3%盐水稀释免疫血清作试验及对照；链球菌不易制成

均匀悬液，可改用无盐肉汤及在室温培养以制成均匀细菌悬液。

4、试验后的细菌仍有感染性，故在判定后及时放入消毒缸内。

1.8.2伤寒和副伤寒血清学检查

伤寒和副伤寒的经典血清学检查法为肥达氏反应（试管法）。目前，己可采用微量凝集试验。

【原理】

用标准伤寒、副伤寒菌液与稀释的待测血清反应，根据凝集效价判定待测血清中有无抗伤

寒或抗副伤寒杆菌抗体。与传统肥达氏反应不同，此试验在微量血凝反应板上操作。

【试剂】

取伤寒0、H和副伤寒甲、乙、丙诊断菌液（70亿菌/ml）,分别用生理盐水稀释成10亿菌

/ml。为便于观察，每10ml此种稀释菌液中加入石炭酸复红（抗酸染色用染液）10ul,或加

20.0g/L美蓝溶液50ul。

【操作】

1、于血凝反应板孔内稀释待测血清，用每滴25ul的校准滴管滴加生理盐水9滴于孔内，

再加待测血清1滴混匀（I：10稀释）。

2、于8X12孔V型孔血凝反应板上操作，每份待检血清用5排孔，分别标以0、H、甲、

乙、丙。每排自第二孔开始每孔注加生理盐水25uL至第8孔。

3、吸取1：10稀释待测血清。分别滴入各排第1、2孔中各1滴（25ul）。用稀释棒从第2

孔开始作双倍连续稀释到第7孔，第8孔不加血清，留作菌液对照。

每批试验可用伤寒、副伤寒诊断血清作阳性对照，同法稀释。

4、各排分别滴入相应的染色菌液,每孔1滴(25ul)o此时各孔液体总量为50uh1~7孔血

清最终稀释度为1：20T：1280。

5、于混匀器上混匀1分钟，血凝反应板加盖，37c6小时后观察结果。

【结果判断】

阳性结果表现为液体澄清，有红色或蓝色细颗粒，均匀平摊于整个孔底。阴性表现为蓝

或红色菌体集中一点，沉积于孔底，与菌液对照相同。以出现50%(2+)凝集的血清最大

稀释倍数的倒数为待检血清滴度。

【参考值】

与传统肥达氏反应相同，即O凝集价>80,H凝集价>160才有诊断价值。如双份血清

效价有4倍以上增长更有意义。

1.8.3链球菌感染的血清学检查

A族溶血性链球菌(A链)在生长过程中可产生多种毒素和酶；如链球菌溶血素O(S

LO)、脱氧核糖酸酶、链激酶、透明质酸酶等。检测血清中的相应抗体，有利于A族溶血

性链球菌感染的诊断。其中，以抗链球菌溶血素O(AS0)应用最广泛。常规应用的Todd

氏溶血法已沿用多年，但操作较繁琐。此处介绍较简便的胶乳凝集法

【原理】

被测血清中如有ASO胶乳试剂反应时，可引起后者凝集。如预先用25结合单位/ml溶血

素中和，不出现凝集者说明血清中的ASO<250单位。仍出现凝集者，说ASO>250单位。

【试剂】

1、ASO胶乳试剂：将竣化聚苯乙烯胶乳与纯化SLO用炭化而亚胺交联。离心洗涤后，用

PH.7.6磷酸盐缓冲液配成1%悬液，加1.0g/LNaN3防腐.此试剂有商品供应.

2、2.5结合单位/mlSLO：用生理盐水将液体SLO稀释到2.5结合单位/ml(标定方法按常用

Todd氏溶血法，滴度为250单位的被测血清。1：50稀释后，与等容积2.5结合单位/mlSLO

混合，其ASO恰被中和)。

【操作】

1、被测血清用生理盐水1：50稀释后56C30分钟灭活。

2、于方格涂黑玻璃板上滴加灭活的稀释待测血清1滴。再滴加2.5结合单位/mlSLOl滴，

摇动玻片2〜3分钟，使血清与SLO充分混匀。

3、滴加ASO胶乳试剂1滴。轻轻摇动玻片8分钟。

【结果判断】

无凝集者为阴性；有明显凝集者为阳性。阳性血清应复试，将中和用的溶血素O改为

5.0结合单位/ml,再按上法检测，如结果仍为阳性则报告为强阳性。

第二章细菌鉴定工作必须遵循的原则

从事细菌鉴定的工作者应该掌握并及时更新细菌学分类知识。常规鉴定工作应该抓住细

菌的主要特征，通过较简单的实验步骤达到正确鉴定目的。

细菌鉴定工作的基本原则核方法

1基本原则

（-）必须用纯的细菌培养物作鉴定。因为不同的细菌生化反应的结果相差较大，而反应

结果是以阳性或阴性表示的。一旦用混合菌做生化反应，结果不可分析。如：大肠杆菌与肺

炎克雷伯氏菌混合，IMViC的结果可均呈阳性，而实际上存在这样的生物种模式。用纯培

养物做鉴定，在使用编码鉴定系列时更为重要。

尽可能用一外菌落接种全部生化反应培养基。如果不够，应考虑采用纯化的方法。由一

个菌落得到大量培养物。

（二）鉴定试验的选择：测定细菌特征的实验方法很多，临床细菌实验工作的目的是准确检

出病原菌，并根据细菌的主要特征给予正确鉴定。因此，并不是做的实验越多越好，根据鉴

定目的选择适当的试验项目，既能完成鉴定，试验项目又尽可能少，一般须考虑以下几个问

题。

I）选择有价值的试验：鉴别两种细菌选择的试验应该其一为阳性，另一为阴性，且阳性和

阴性的概率大于90%。否则，试验无鉴别价值。

2）选择快速简便的试验.

因为是常规实验室，选择的方法应快速方便，如鞭毛染色、氧化酶、凝固酶等应为首

选方法。鉴定一个细菌如果有几种特异的方法，选其中一或两种便可，多选无价值。如鉴

定B群链球菌有CAMP、黄色素、马尿酸钠三个试验，一般用CAMP就可以了。常规试验

选用复合培养基很方便，如三糖铁、MIU等，一个试验可观察几种试验结果，节省人力物

力。

3）测定细菌的一种生物特性可能有几种不同方法。应该了解所用方法的敏感性，否则

会导致错误的鉴定。如H2S试验、醋酸铅试纸法最灵敏。此法阳性的菌株，三糖铁上不一

定阳性。另外，一个重要的注意点是糖分解力测定试验，不同的菌类用的基础培养基不同。

肠杆菌科用Ewing的方法，非发酵菌用Hugh-Leifson的方法，葡萄球菌用Jame的方法，而

念珠菌的培养基中含糖量为2%,如果各种菌混合用同一配方，鉴定结果将出现错误。

2分析方法

鉴定是将一个未知菌株按其生物学特征，经过与所有已知的菌种进行比较后划归到一

个己知菌种的分析过程。在这个过程中，应该从分类单位的高级到低级按次序进行。即按门、

纲、目、科、属、种的次序。临床细菌鉴定是从科开始的，以下按属、种做鉴定。为了使

这样一个分析过程显易可见，常以双歧索引来表示。以下是将临床上常见菌分到科（群）水平

的双歧索引以供参考。

革兰氏染色

十—

球菌杆菌球菌杆菌

触酶动力DNA酶发酵

+——+——+一+——

卡拉氧化酶

葡链李棒,,奈非

+

萄斯状发

9!瑟氏弧普

球球特菌酵

菌菌属二菌菌田菌

汉,,菌

科菌属等菌属科群

科

临床常见菌的初步分群

临床上常见细菌用革兰氏染色、镜下观察、OF试验、触酶和氧化酶试验就可以初步

分科，经过这样的区分后，再按科内各个属和种的鉴别方法鉴定到种。

第三章葡萄球菌属常规鉴定

第一节鉴定过程

葡萄球菌的鉴定过程分为两个主要步骤：首先须与其它的革兰氏阳性球菌鉴别，然后在

作属内的鉴定。

（一）与其它革兰氏阳性球菌鉴别

临床标本中可以见到的革兰氏阳性球菌，除葡萄球菌属外，还有链球菌属和微球菌属。

所以，在菌属内菌种鉴定之前，首先与这两属细菌鉴别。

I、与链球菌鉴别：葡萄球菌与链球菌的区别，可通过镜下形态触酶试验。在镜下，葡萄

球菌以单、双、葡萄状排列。菌体呈圆形。而链球菌以成单、双、链状排列，菌体形态为椭

圆形。两个菌属的主要区别是葡萄球菌触酶试验阳性，链球菌则阴性。

2、与微球菌的鉴别：微球菌科有3个属：葡萄球菌属、微球菌属、动球菌属。动球菌属

与人类关系不大，勿需与此鉴别。主要应与微球菌鉴别，两者的区别详见表3-1。实验室常

用的鉴别依据是形态和发酵葡萄糖产酸。在镜下，葡萄球菌以葡萄状排列为主，菌体较小,

微球菌以四联排列为主，且菌体较大，葡萄球菌发酵葡萄糖产酸试验阳性，微球菌阴性。

项目葡萄球菌微球菌

形态以葡萄状为主以四联排列为主

发酵葡萄糖产酸+——

溶葡萄球菌素+—

分解甘油（含0.4ug/ml的红霉素）+一

表3-1葡萄球菌与微球菌的鉴别

（二）葡萄球菌三个种的鉴别

虽然目前葡萄球菌的种不少，但现今临床鉴定一般要求鉴定到3个种：金黄色葡萄球

菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌。三者的区别一般可用简便的血浆凝固酶试验以及新生霉

素敏感性试验。首先用凝固酶试验将其分为凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性的葡

萄球菌，然后用新生霉素敏感区分。新生霉素敏感的为表皮葡萄球菌。新生霉素耐药的可初

步定为腐生葡萄球菌。也可用其他的特性来区别三者。详见表3-2。

试验金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌

血浆凝固酶+——

甘露醇发酵+——

新生霉素敏感性SS—

A蛋白+——R

表3-2葡萄球菌三个种的鉴别

（三）葡萄球菌常规鉴定流程

革兰氏阳性球菌

触酶

微球菌科链球菌属

葡萄糖发酵

+—

葡萄球菌属微球菌属

凝固酶玻片法

金黄色葡萄球菌__________凝固酶试管法___________

--

金黄色葡萄球菌新生霉素敏感试验

SR

表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌

第二节试验方法

（一）过氧化氢酶（触酶）试验

【目的】：

主要用于细菌属间的鉴别：微球菌和葡萄球菌属（+）,而链球菌属（一）。

【原理】：

2H202----A2H202+02

【试剂】

3%H2O2溶液，置棕色瓶内于4寸阴暗处保存。

【方法】：

用接种针挑取孵育18-24小时单个菌落，置于洁净的载玻片上，用滴管在玻片的细菌上

加一滴3%2H202。1分钟内产生大量气泡为阳性，不产生气泡为阴性。玻片在试验后放在消

毒剂中处理。

【质控】：

阳性对照：金黄色葡萄球菌

阴性对照：链球菌

【注意事项】：

1从血平板上挑取菌落做试验时，不能将血琼脂带到玻片上，因红细胞含有过氧化氢酶会

引起假阳性。

2操作顺序（先菌后H2O2）不能颠倒，否则会出现假阳性。

3浓H2O2（30%）是一种强腐蚀性溶液，万一沾到皮肤上，要立即用70%乙醇（不能用水）冲

洗以中和它的作用。

（二）葡萄球菌氧化发酵试验（S-OF）

【目的】：

S-OF培养基按葡萄球菌和微球菌分类小组所推荐的方法制备，用于检测过氧化氢的

阳性球菌发酵葡萄糖的能力。S-OF用于鉴别葡萄球菌与微球菌。

【原理】：

S-OF培养基是为了克服采用Hugh和LelfssonOF试验培养基检测葡萄球菌发酵葡萄

糖所遇到的问题而设计的。与OF培养基比较，S-OF培养基营养更高，并且采用不同的

PH指示剂，因而增强了某些种的葡萄球菌产生轻微PH变化的检出能力。在S-OF培养基,

葡萄球菌发酵葡萄糖，而微球菌或氧化或不分解葡萄糖。

【培养基】：

1、1.6%漠甲酚紫：漠甲酚紫800mg,0.01M的氢氧化钠14.8ml,加水至50ml。

2、培养基的成分及制备

胰蛋白陈10g

酵母膏1g

溪甲酚紫1.6%2.5ml

琼脂3.5g

蒸播水980ml

PH7.0

121℃灭菌15分钟，待冷却至50℃时。加入过滤除菌50%葡萄糖20ml分装试管2—3ml

备用。

【方法】：

用接种针挑取部分菌落于S-OF管穿刺接种4次，穿刺深度约为琼脂表面下1cm,每

种待检菌接种两管，接种后一管加液体石蜡约1cm高，1管不加。35℃培养。每天观察是否

产酸，连续观察4天，然后在第七天作出最后判断。

【结果判断】：

发酵：两管均变黄

氧化：开放管变黄，石蜡封闭管仍为紫色

不分解：两管均为紫色

【质控】：

金黄色葡萄球菌一一发酵

藤黄微球菌一一不分解

（三）血浆凝固酶试验

【目的】

用于鉴别金黄色葡萄球菌于其它葡萄球菌。

【原理】

金黄色葡萄球菌产生两种形式的凝固酶，即结合凝固酶和游离凝固酶。结合凝固酶和细

菌细胞壁结合，不存在于滤过培养液中，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，产生纤维蛋白凝

块。玻片法可检出此酶。游离凝固酶为胞外酶，为菌细胞所分泌，因而存在于滤过的培养基

液中为试管法所检出。于结合凝固酶不同，有游离凝固酶首先作用于血浆中的饿凝固酶因子

（CRF）形成凝固酶一一凝固酶反应因子复合物，然后该复合物作用于纤维蛋白原，产生不

溶性的纤维蛋白凝块。玻片法简便快述。用于实验室常规筛选。试管法准确可靠。玻片法阴

性或可疑（迟缓）阳性或自凝时，应用试管法进一步确定。

【试剂】

兔血浆：从家兔心脏采血，以EDTA抗凝离心后吸取血浆，分装每管0.5mL冻存备用。

【方法】：

1、玻片法

取一滴生理盐税于洁净的玻片上，用接种环挑取待检菌一环置于盐水中，制成浓的菌悬

液，若出现自凝现象则采用试管法。若无自凝发生，则加一环血浆混入，立即观察结果，出

现明显凝块的为阳性，否则为阴性。阴性或迟缓反应（20〜30秒）应以试管法加以证实。

2、试管法

用生理盐水将血浆1：4稀释，取0.5ML,然后挑取3-5个菌落于稀释血浆中，制成浓

悬液，置37℃水浴，在最初4小时内每30分钟观察一次。凝固者为阳性，阴性结果则于室

温孵育过夜，以便检出缓慢产生或量少的凝固酶。

【质控】

金黄色葡萄球菌一一阳性

表皮葡萄球菌一一阴性

【注意事项】

1、试管法检查凝块形成时，不要振动或摇动试管，因为凝固初期的凝块易破坏，即使

继续孵育亦不再形成凝块。这可引起可疑或假阴性结果.

2、不能使用含盐的抑制培养基上的生长物做实验。例如甘露醇含盐琼脂培养基。

（四）新生霉素敏感实验

【目的】

用于腐生葡萄球菌与凝固酶阴性的其它葡萄球菌的推测性鉴别。

【原理】

腐生葡萄球菌能在含有新生霉素的培养基上生长，经过适当的接种和培养后，在含5ug

的新生霉素纸片周围形成的抑菌圈在15mm或以下，表现为耐药，据此将实验菌鉴定为腐

生葡萄球菌，特别是待鉴定菌来自尿培养时。虽然孔氏葡萄球菌，木糖葡萄球菌，赛氏葡萄

球菌也对新生霉素耐药，但这些菌种很少自尿液中分离出。

【试剂】

新生霉素纸片（商品供应），每片含药5ug。

【方法】

用棉签蘸取实验菌菌液并接种于半块药敏或血平板上。待菌液干后，在接种区域的中央

贴上含5ug/片的新生霉素纸片。35℃培养13-24小时后，根据抑菌圈大小作出判断。耐药

----抑菌圈W15mm,敏感----13mm.

【质控】

应用以下菌种检查每批纸片，是否符合预期结果。

腐生葡萄球菌一一耐药

表皮葡萄球菌一一敏感

第四章链球菌属常规鉴定

第一节鉴定过程

链球菌属的鉴定分两个主要步骤，首先与其它革兰氏阳性球菌鉴别，然后再作菌属内鉴定。

（一）与其它革兰氏阳性球菌鉴别

临床标本中，常见的革兰氏阳性球菌除链球菌外，有葡萄球菌和微球菌、链球菌与后两

类菌的鉴别可依据其形态的特点和触的反应。链球菌再镜下其形态排列以成双或成链状为

主，触酶试验阳性。葡萄球菌也可成双排列，但是与链球菌不同，成双的葡萄球菌大小相等、

圆形、而成双的链球菌是椭圆的或是杆菌样的。

（二）链球菌的属内鉴定

1、初步分群：虽然本属内包括的菌种数量很多，如果以几个主要的生物学特征先分成

几群，然后在群内再进一步区分，鉴定到种使会简化鉴定过程。最简便的方法是根据溶血

性及胆汁七叶甘试验把链球菌初步初为三群。

1群乙型溶血链球菌群，再血平板上呈溶血

2群胆汁七叶甘试验阳性菌群。

3群其它草绿色链球菌，血平板上溶血或不溶血，胆汁七叶甘试验阴性。

2、乙型溶血链球菌的鉴定：溶血链球菌可用血清学反应结合生理生化反应进行鉴定,

但由于试剂的缺乏，常规实验室难以进行血清学鉴定。而生理生化方法仅用几个简单的试验

也可初步鉴定，因此是目前大多数常规实验室采用的方法。这一类菌以A、B、C,F、G群

与临床有关，应予鉴定。

A、B、G、D群一般可用杆菌肽，CAMP、胆汁七叶甘、七叶甘等几个试验初步鉴定,

详见表4-1。

表4-1A、B、G、D群链球菌的鉴别

试验A群B群G群D群

杆菌肽+———

CAMP—+——

七叶甘——++

胆汁七叶甘————+

黄色素—+——

SXT———+—

F、C群的鉴定目前除了血清学以外，尚无理想的生化方法。

3、胆汁七叶甘阳性链球菌的鉴定：本群所包括的菌种除鸟链球菌抗原属Q群外，其

它均为D群，共有五种。胆汁七叶甘试验是将这五种细菌与其它草绿色链球菌区别的最好

方法。这五种细菌还可分成两类，即肠球菌和非肠球菌。由于肠球菌对青霉素的敏感性与非

肠球菌不同，肠球菌是耐药的，非肠球菌是敏感的，故D群链球菌引起的心内膜炎的治疗

用药就有所不同，应予以区别。临床实验室可根据情况将D群链球菌鉴定到种或只鉴定到

亚群。6.5%NACL试验是鉴别肠球菌和非肠球菌较好的试验。

4、其它草绿色链球菌的鉴定：一般说来非溶血链球菌都属这一类，如肺炎链球菌、

血链球菌、唾液链球菌等

肺炎链球菌与其它草绿色链球菌的鉴别,可根据Optochin敏感试验以及胆汁溶菌试验.

（三）链球菌属常规鉴定流程

第二节试验方法

（-）溶血性检查：

溶血性检查是链球菌鉴定过程中非常重要的一步。

【培养基】

羊血平板。

【方法】

将菌接种于羊血平板上，用接种针在已接种的血平板上刺数次，使细菌接种到琼脂深处。

35℃培养过夜。

【结果判断】

a一溶血：在血平板上，菌落周围的红细胞被部分破坏，呈现一个不清晰的环，菌落

周围的培养基带绿色或褐色。

P一溶血：在血平板上，菌落周围红细胞完全溶解，呈现一个无色透明环。

不溶血（丫一溶血）：菌落周围无明显红细胞溶解，因而无溶血环。

【注意事项】

1、血琼脂基础应采用胰化大豆肉汤，心浸液，Todd—Hewitt肉汤或示蛋白陈。上述培养基

不但提供了链球菌必需的营养成分，而且不含可发酵的糖类（这些糖可影响0—溶血性链球

菌的溶血性）。

2、血液的种类与浓度对溶血性亦有影响。肠球菌在马、兔或人血琼脂上可产生p—溶血；

而在绵羊血琼脂上则为a—溶血。血液的浓度一般采用5%。培养基的厚度为4mm为宜。

3、气体条件可影响溶血性。A群。一溶血性链球菌可以产生两种溶血素。溶血素0对氧敏

感，溶血素S对氧稳定。大多数A群p—溶血性链球菌产生溶血素S。胆少数分离株仅产生

溶血素O。因此在有氧条件下就不表现『溶血。厌氧培养，倾注培养，或在初次分离平板

接种后进行穿刺。这些方法均可降低氧分压有利于检出仅产生溶血素S的菌株

（二）杆菌肽敏感试验

【目的】

该试验用于A群B—溶血性链球菌的推测鉴定。

【原理】

杆菌肽是一种革兰氏阳性菌所产生的一种抗生素。P—溶血性链球菌对该药物的敏感性

不同，A群敏感，而其它群溶血性链球菌为耐药。

【试剂】

0.04u杆菌肽纸片、羊血平板

【方法】

将0—溶血性链球菌的纯培养物接种于半块羊血平板，然后在接种区贴上含0.04u的杆

菌肽纸片。35℃培养18-24小时，在纸片周围有抑菌圈（不论大小）即解释为该菌敏感。

【质控】

A群p—溶血性链球菌——敏感

B群0—溶血性链球菌——耐药

【注意事项】

1、该试验只适用于0—溶血性链球菌。因为许a—溶血性链球菌也对杆菌肽敏感。

2、杆菌肽纸片含药量应为0.04U,而不应采用抗生素敏感试验的纸片。

（三）CAMP试验

【目的】

CAMP试验用于B群链球菌的推测鉴定.

【原理】

CAMP因子是由B群链球菌所产生的一种可扩散的、热稳定的胞外蛋白质。CAMP因

子与葡萄球菌产生的0—溶血素协同作用，使绵羊（或牛）的红细胞快速溶血。但对人、马

或兔红细胞则无此作用。

【材料】

1、产生「溶血素的金黄色葡萄球菌。

2、绵羊血平板。

【方法】

将产生B—溶血素的金黄色葡萄球菌接种于羊血平板中央一条长直线。将实验菌和对照

菌沿着与金黄色葡萄球菌垂直的方向接种，长约2-3cm。注意勿接触金黄色葡萄球菌接种物。

二者间隔约3cm。35℃孵育过夜。

【结果判定】

在实验菌和金葡菌接种线之间有一加强溶血区，可表现为箭头状、半月形或火焰形。此

即CAMP试验阳性。

【质控】

B群链球菌一一阳性

A群链球菌一一阴性

【注意事项】

1、血液基础应采用胰化大豆肉汤。血液应采用绵羊血。

2、所采用的金葡菌应能产生p—溶血素。

3、接种前羊血平板应使冷凝水干燥，否则接种物易于扩散或混合。

4、应在大气或烛缸中孵育。不应在厌氧条件下孵育。有些A群链球菌株在烛缸培养可表现

为CAMP阳性。若做厌氧培养。则有更多的A链表现为CAMP阳性。

5、经适当的孵育后应立即观察并记录结果。置室温时经过B—溶血素作用的绵羊红细胞会

发生冷热溶血，就难判断CAMP试验结果。

（四）黄色素产生试验

【目的】

用于B群链球菌的推测性鉴定。

【原理】

在含淀粉和血清的培养基上，B群链球菌产生黄色素，而其它链球菌无此特征。该试验

是B群链球菌数个推测性鉴定试验中特异性最好的。

【培养基】

1、成分：

胶蛋白陈2.0g

酵母膏粉1.0g

淀粉2.0g

NACL0.2g

NAHCO30.2g

NAHPO4-12H2O0.1g

蒸福水100ml

2、制备：

①淀粉2.0g加蒸储水50ml加热溶解。

②余成分混合，溶于50ml蒸镭水中。

①+②调pH7.4,加入0.2g琼脂，115℃灭菌20分钟冷却至50℃,加1%血清（牛、羊、

马血清均可）制成半固体。

【方法】

用接种针挑取分离的实验菌落，于黄色素半固体培养基穿刺接种数次。35℃孵育24-48

小时。穿刺线出现黄色为阳性，否则为阴性。

【质控】

B群链球菌——穿刺线呈现黄色（阳性）

A群链球菌一一穿刺线不呈现黄色（阴性）

（五）胆汁七叶甘试验

【目的】

胆汁七叶灵琼脂用于鉴定D群链球菌。D群链球菌能耐受40%的胆汁（4%的胆盐）并

且能将七叶灵水解成七叶素和葡萄糖。

【原理】

该培养基具有选择性，只有耐受40%胆汁的那些细菌能够生长，大多数革兰氏阴性杆

菌、葡萄球菌、D群链球菌能在该培养基生长。D群链球菌水解七叶灵，所产生七叶素与枸

椽酸铁形成褐黑色的产物。据此可将D群链球菌和其它链球菌区别。

【培养基】

1、成分

蛋白陈5g

牛肉膏3g

七叶甘1g

枸檬酸铁1.5g

胆盐40g

琼脂15g

蒸储水1000ml

2、制备：

①先将柠檬酸铁在适量蒸懦水中加热溶解。

②溶解胆盐以外的其它成分。

③将①和②混合，调pH7.0,加入胆盐、琼脂粉、加热溶解。

分装试管。12JC15分钟灭菌。斜置凝固成斜面。

【方法】

用吸管吸取已孵育24小时Todd-Hewitt肉汤纯培养物2滴接种于斜面上。35℃培养。

可以定时检查，若阳性可报告结果；阴性者需孵育72小时后最终判定结果。

【结果判定】

1、阳性：斜面的一半或大部分变为暗棕色到黑色。

2、阴性：斜面不变黑；孵育72小时斜面变黑不到一半（+/—反应）。

有生长物时，并不表示七叶甘水解。仅表示胆汁浓度不能抑制除D群链球菌以外的细菌生

长。

【质控】

肠球菌一一生长，培养基变黑（阳性）

草绿色链球菌一一不生长（阴性）

（六）6.5%NaCl生长试验

【目的】

用于鉴别肠球菌和D群肠球菌。

【原理】

6.5%Nacl肉汤含有大量蛋白陈和Nack能够在6.5%Nacl肉汤生长是肠球菌的一个重要

特征。试验时间以不含高盐的肉汤作生长对照。如果在含盐培养基不生长或生长很差，但在

不含盐的培养基生长良好，则为阴性结果。

【培养基】

蛋白陈20g

牛肉膏粉10g

葡萄糖2g

NAHCO32g

NACL2g

Na2Hp04•12H2O1g

蒸储水1000ml

溶解调pH7.8,取500ml分装试管，余加6.3%NaCl分装试管，115℃20分钟灭菌，

备用。

【方法】

将实验菌接种于两管培养基，一管为含6.5%NaCI,另一管不含所加的盐，35e孵育

24-72小时，观察生长情况。

【质控】

肠球菌一一阳性

草绿色链球菌一一阴性

（七）Optochin敏感试验

【目的】

该试验用于肺炎链球菌的推测鉴定。

【原理】

对Optochin（奥普托辛为乙基氢化羟基奎林的商品名）敏感性被用于a-溶血性链球菌

和肺炎链球菌的鉴别。肺炎链球菌对Optochin敏