实验一细胞形态细胞器的显微结构的观察

关于实验一细胞形态细胞器的显微结构的观察一、实验目的1.了解普通光学显微镜的工作原理，掌握光学显微镜的使用方法。2.熟悉光学显微镜下细胞的基本形态与结构。第2页,共36页，2024年2月25日，星期天二、实验原理细胞是生物体的基本结构单位。构成生物机体的细胞是多种多样的。要对细胞进行研究，首先要从其形态结构人手。所以，要借助显微镜的成像及放大原理，在显微镜下，才能观察到细胞的基本形态结构。第3页,共36页，2024年2月25日，星期天经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。第4页,共36页，2024年2月25日，星期天显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力有关。制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。第5页,共36页，2024年2月25日，星期天显微镜的分辨率:也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离，分辨距离越大，则分辨率越低。所以，分辨率是以分辨距离来表示的。其计算公式为:D=0.61λ/N·AN·A·=n·sina/2

式中D为分辨率，A为光波波长，n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），

N·A·为物镜的数值孔径(镜口率)。镜口角总是要小于180˚，所以sina/2的最大值必然小于1。

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在物镜上，有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：物镜镜口率(N.A.)工作距离(mm)10×0.255.4040×0.650.39100×1.300.11显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积，公式为:M=K1xK2焦点深度:显微镜调焦到看清标本某一点时，不仅是这一物点，而且它的上下两侧也能看清楚两侧的厚度叫做焦点深度。看到标本的全厚度，必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。第7页,共36页，2024年2月25日，星期天厚标本和薄标本4-5um2um基础知识第8页,共36页，2024年2月25日，星期天基础知识三、显微镜概述

显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。1.光学显微镜普通生物显微镜由3部分构成：①照明系统：包括光源和聚光器。②光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。③机械装置：用于固定材料和观察方便，包括镜台(载物台)、调节器和、物镜转换器(旋转器)等。尼康E-600显微镜

第9页,共36页，2024年2月25日，星期天2.体视显微镜（可直接进行解剖及观察并具有正像立体感）第10页,共36页，2024年2月25日，星期天3.荧光显微镜

尼康E800荧光DIC显微镜

荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）

第11页,共36页，2024年2月25日，星期天荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上。2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。第12页,共36页，2024年2月25日，星期天4.激光共聚焦扫描显微镜（具有高分辨率可进行显微断层扫描）

LCSM照片蓝色为细胞核，绿色为微管

（能观察活细胞）第13页,共36页，2024年2月25日，星期天5.暗视野显微镜

暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。6.相差显微镜

一种介壳虫的染色体

第14页,共36页，2024年2月25日，星期天7.偏光显微镜（对于双折射物质进行结构研究）

偏光显微镜（polarizingmicroscope）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。8.微分干涉差显微镜（图像具有浮雕感）

DIC显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。

DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）

第15页,共36页，2024年2月25日，星期天9.倒置显微镜（组织培养中长工作距离的）组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上（右图），用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。第16页,共36页，2024年2月25日，星期天10.显微操作技术

尼康NT-88NE显微操作/注射仪

第17页,共36页，2024年2月25日，星期天四、实验用品各种组织切片第18页,共36页，2024年2月25日，星期天五、

实验步骤

(一)显微镜的使用1.观察前的准备工作

(1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。

(2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。

(3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。第19页,共36页，2024年2月25日，星期天瞳距调节2.显微镜的调节第20页,共36页，2024年2月25日，星期天屈光度调节调节第21页,共36页，2024年2月25日，星期天粗调松紧调节旋钮第22页,共36页，2024年2月25日，星期天聚光镜中心调节⑤光轴中心调节螺钉③视场光栏③孔径光栏②10X物镜①标本④聚光镜升降旋钮第23页,共36页，2024年2月25日，星期天孔径光栏调节N.A聚=(0.6-0.8)N.A物第24页,共36页，2024年2月25日，星期天孔径光栏开度与图象100%70%30%第25页,共36页，2024年2月25日，星期天孔径光栏的运用第26页,共36页，2024年2月25日，星期天操作步骤如下:(1）可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整;如果可变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它的中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。

(2)载物台上放置观察标本，把聚光器上升到它上端透镜平面稍低于载物台平面的高度，并将它的可变光栏开到最大，用低倍物镜，进行调焦到能看见标本，可调反射镜使视野得到最亮和最均匀的照明，或把光栏关小，最亮的照明区正处在视野的中央。

(3)转到高倍镜，并调焦到看清标本，然后去掉标本，拔出目镜，眼睛直接向镜筒观察，并把可变光栏关小，看其亮点是否在视野中心，如果不是，就要转动聚光器的调节螺旋，把亮点调到视野中央，再慢慢开启可变光栏，使视野看到光栏边缘和聚光镜的边缘相接为止。第27页,共36页，2024年2月25日，星期天3.观察操作：(1)低、高倍镜的使用:先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片0.5cm处，然后一边观察视野一边上升物镜，直至看到图像，再将标本移到视野中心，用细调焦螺旋把物镜调至最清晰处，若要用高倍镜观察时，把所要进一步放大观察的部位移至视野中央，直接顺时针转换成高倍物镜，然后用细调焦螺旋调焦，至看清物像。

第28页,共36页，2024年2月25日，星期天(2)兔肝细胞苏木精-伊红(H·E·)染色玻片标本的观察先在干燥系物镜下观察肝小叶的概况，辨认肝细胞，然后用油镜仔细观察肝细胞的显微结构。注意肝细胞的形状，细胞核和核仁的形状和数量，细胞核和细胞质的染色区别等。第29页,共36页，2024年2月25日，星期天（二）观察标本第30页,共36页，2024年2月25日，星期天第