分光光度分析法辅导

关于分光光度分析法辅导分析测试人员所从事某项技术工作的能力考核技术基础仪器和操作标准方法与应用数据处理书面考核书面考核书面考核试验结果考核操作考核现场考核正确使用正确结果第2页,共60页，2024年2月25日，星期天

紫外-可见分光光度分析基础

前言分光光度法的特点分光光度分析的基本理论分光光度法分析条件的选择分光光度法中主要显色剂类型及其应用※分光光度法的主要测定方式分光光度计的仪器原理和结构分光光度计的仪器安装和调试第3页,共60页，2024年2月25日，星期天前言

自然界中很多物质都是有颜色的，它是因其对不同颜色的光的吸收或反射所产生。很多化合物在溶液中也常常具有不同的颜色，而且即使本身没有颜色也会因其与某些试剂发生反应而显现颜色。同时这些颜色的深浅与物质的浓度有关，因此人们便利用比较颜色深浅来测定物质的含量。这就是古老的比色分析法。最初采用目视比色，接着出现了光度计，采用了光电比色法。随着科学技术的发展和人们对物质选择性吸收不同波长光的深入研究，出现了各种类型、性能优越的分光光度计和高灵敏显色体系，发展成为目前广为应用的紫外-可见分光光度分析技术。

第4页,共60页，2024年2月25日，星期天分光光度法的特点

分光光度法是采用分光器(棱镜或光栅)获得纯度较高的单色光，是基于物质对单色光的选择性吸收来测定物质组分的分析方法。分光光度法具有灵敏度高、准确度和稳定性较好、操作简便、适用范围广、所需仪器简单价廉等特点：

(1)灵敏度高，用于微量组分的测定，其浓度下限为10-5~10-6mol/L，测定下限可达10-3%~10-4%。第5页,共60页，2024年2月25日，星期天

(2)准确度和稳定性较好，尽管准确度不及滴定分析法和重量分析法，但精密测量,相对误差可在1~2%,适合低含量成分测定。

(3)操作简便快速，该法主要包括试样的溶解,被测组分的显色和吸光度的测量三部分,一般可不经分离直接测定。

(4)适应范围广，不仅能测定微量组分，也能测定含量较高的组分，例如采用差示分光光度法或光度滴定法等。(5)所需仪器简单价廉，所采用的分光光度计是各实验室广泛使用的仪器。第6页,共60页，2024年2月25日，星期天分光光度分析的基本理论

1、分光光度分析的原理

光是一种电磁波，具有波动性，能产生折射、衍射、偏振和干涉等现象(光波)。同时具有微粒性，能产生光电效应(光子)。—普朗克公式.理论上，将具有某一波长的光称为单色光，由不同波长的光组成的光称为复合光。人眼能产生颜色感觉的光区称为可见光区，其波长范围约为380～760nm。200～380nm范围的光称为近紫外光。第7页,共60页，2024年2月25日，星期天具有不同分子结构的各种物质，有对电磁辐射显示选择吸收的特性。有色物质的溶液对不同波长的入射光线有不同程度的选择性吸收。分光光度法就是基于这种物质对电磁辐射的选择性吸收的特性而建立起来分析法，属于分子吸收光谱法。在冶金分析上广为应用的是紫外-可见分光光度法。碳硫分析属于红外吸收光谱法。第8页,共60页，2024年2月25日，星期天2、物质的颜色和光的选择性吸收普朗克公式

光子的能量E决定于光的频率：

E＝h·

＝h·c/

式中:E为光子能量,J；h为普朗克常数(6.626×10-34J·s)

分子吸收光谱形成中所吸收的能量与电磁辐射的频率成正比，符合普朗克条件：

E＝E2－E1＝h

＝h·c/

式中，

为辐射频率；c为光速；

为波长。第9页,共60页，2024年2月25日，星期天当分子吸收了外来辐射能之后,它的能量变化

E,为其振动能变化(

E振)、转动能变化(

E转)、电子运动能量变化(△E电子)的总和，即：

E＝

E振+

E转

+

E电子

其中：

E电子最大，一般在1～10eV。若设

E电子为5eV，相应的吸收光谱中被吸收光波的波长应该是：

＝hc/

E电子＝2.48×10-5cm＝248nm

因此，由于分子内部电子能级变化而产生的光谱位于紫外区或可见区及红外区内。第10页,共60页，2024年2月25日，星期天3、光吸收的基本定律有色溶液对光的吸收程度，与该溶液的液层厚度、浓度以及入射光的强度等因素有关。第11页,共60页，2024年2月25日，星期天朗伯-比尔定律—光吸收的基本定律如果保持入射光的强度不变，则光吸收程度(A)与液层厚度及溶液的浓度有关。其定量关系式为：

式中：I0为单色光通过待测溶液前的强度；

I为单色光通过待测溶液后的强度；

K为吸光系数,为一常数。其数值与溶液的性质及入射光波长有关；

c为待测物质的浓度；l为待测溶液的厚度第12页,共60页，2024年2月25日，星期天上式:称作朗伯-比尔定律，它是分光光度分析的定量基础。这个关系式仅适用于单色光及均匀非散射的液体、固体和气体。朗伯-比尔定律—是由表示液层厚度和光吸收关系的朗伯定律(A=lgI0/I=K1l)及表示溶液浓度与光吸收关系的比尔定律(A=lgI0/I=K2c)合并而得。第13页,共60页，2024年2月25日，星期天分光光度分析是建立在朗伯-比尔定律关系式上，此时吸光度与浓度呈线性关系。但也有发生偏离情况，必须引起注意。在吸光光度分析中,导致偏离朗伯-比尔定律的原因很多，但基本上可分为物理和化学两个方面。属于物理原因的主要是入射光的单色性不纯所造成的；属于化学方面的主要是由于溶液本身化学变化所造成的。第14页,共60页，2024年2月25日，星期天即导致偏离朗伯-比尔定律的原因多为：

a.单色光不纯

b.溶液本身引起的偏离

(1)溶质和溶剂的性质。

(2)介质不均匀性。

(3)溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化。第15页,共60页，2024年2月25日，星期天4、表征光度法灵敏度的参数

a、摩尔吸光系数(

)

—指当有色物质溶液浓度为

1mol/L,液层厚度为1cm时的吸光度。其单位为:L/(mol·cm)即(mol/L)-1·cm-1

。摩尔吸光系数是有色化合物的重要特性，也是鉴别光度法灵敏度的重要标志。它与入射光的波长、溶液的性质和温度、仪器的质量有关,而与溶液的浓度和液层的厚度无关。在一定条件下它是一常数,可以表明有色溶液对某一特定波长光的吸收能力。灵敏的光度法的摩尔吸光系数

的值通常在104～105

第16页,共60页，2024年2月25日，星期天b、质量吸光系数(a)—是指吸光物质浓度为1g/L时，在最大吸收波长处，光程为1cm时的吸光度,其单位为L/(g·cm)即(g/L)-1·cm-1。质量吸光系数越大，反应灵敏度越高。

a与

的关系为：

单位表示：a—L/(g·cm)即(g/L)-1·cm-1

—L/(mol·cm)即(mol/L)-1·cm-1第17页,共60页，2024年2月25日，星期天桑德尔(Sandell)灵敏度S：早期文献对显色反应的灵敏度用桑德尔(Sandell)灵敏度表示。它的定义是：产生0.001的吸光变时,单位截面积(cm2)的光程内所含吸光物质的微克数,其单位是

g/cm2。S值越小，显色反应的灵敏度越高。S与摩尔吸光系数

的关系是:S＝M/

※光度法表示灵敏度的参数

以前还用另外两种表征其灵敏度的参数第18页,共60页，2024年2月25日，星期天早期文献还使用另一个表征其灵敏度的参数：比吸光度a*－是指吸光物质浓度为1mg/L或1

g/mL时，在最大吸收波长处，光程为1cm时的吸光度。比吸光度值越大，反应灵敏度越高。比吸光度与质量吸光系数相同，仅浓度单位不同。比吸光度指1

g/mL(1mg/L),质量吸光系数指1g/L。更适合于光度法测定低浓度物质时的比较。a*与摩尔吸光系数

的关系为：

a*＝

/M×10-3

式中：M为摩尔质量，g/mol第19页,共60页，2024年2月25日，星期天※由摩尔吸光系数计算桑德尔灵敏度S及比吸光度a*实例例：应用硅钼蓝法测钢中硅含量时

810＝2.19×104

应用双硫腙萃取光度法测量铜时

＝4.5×104，测定铅时

＝6.8×104。计算其桑德尔灵敏度S及比吸光度a*。硅钼蓝直接光度法测钢铁中硅：

S＝＝0.0013a*＝＝0.780双硫腙萃取光度法测铜：

S＝＝0.0014a*＝＝0.708

双硫腙萃取光度法测铅：

S＝＝0.030a*＝＝0.328第20页,共60页，2024年2月25日，星期天5、吸收曲线和工作曲线

朗伯-比耳定律A=

lg(I0/I)=

lg(1/T)=K·c·l中溶液的吸光度及透过率随着波长的变化而变化。显色络合物的吸收曲线用不同波长下溶液中吸收物质对应的吸光度A或透过率T作图,可得波长与A或T的曲线，称为吸收曲线。吸收曲线可以确定光度法时应采用在什么波长处进行测定，可以得到最大的吸光度值。第21页,共60页，2024年2月25日，星期天吸光度：溶液对光的吸收程度，用符号A表示。光度法中，将lgI0/I定义为吸光度。

A＝lg(I0/I)

透过率：入射光透过溶液的程度(%)，称为透光度。用符号T表示。

T＝I/I0

即用透射光强度与入射光强度之比。吸光度与透过率的关系为：

A

＝lg(I0/I)

＝lg(1/T)=－lgT溶液的吸光度与透过率第22页,共60页，2024年2月25日，星期天例：高锰酸的光谱吸收曲线第23页,共60页，2024年2月25日，星期天朗伯-比耳定律A=

lg(I0/I)=

lg(1/T)=K·c·l中溶液的吸光度与溶液中吸光物质的浓度呈线性。工作曲线以溶液中吸收物质浓度对其吸光度作图，可得工作曲线。当用吸收物质的标准溶液绘制工作曲线时也可称为标准曲线。在一定范围内，吸光度A与溶液中吸收物质的浓度呈正比，符合比耳定律呈线性关系。第24页,共60页，2024年2月25日，星期天图：分光光度法的工作曲线第25页,共60页，2024年2月25日，星期天6、吸光光度法的分析步骤吸光光度法分析待测组分含量最常用的方法就是工作曲线法(又称标准曲线法)。其分析步骤如下：

(1)首先配制一系列不同浓度待测元素的标准溶液，显色后于一定波长(通常是最大吸收波长)处测量吸光度。然后以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得一过原点的直线，即工作曲线。

第26页,共60页，2024年2月25日，星期天(2)将试样经化学处理后，与标准溶液相同条件下显色并测量其吸光度。在工作曲线上查得该溶液中待测元素的浓度，从而计算出试样中待测组分的含量。实际工作中有时用标准样品绘制工作曲线。即取一系列待测组分含量不同而基体成分与待测试样相同的标准样品，按分析方法与待测样品同时溶解、显色、测量吸光度，绘制工作曲线，从工作曲线上直接查得试样中待测组分含量。第27页,共60页，2024年2月25日，星期天如果没有与待测试样成分相近的标准样品,可以采用基体匹配法,

即在工作曲线的标准系列溶液中加入与试样相同量的基体成分。也可以采用加入法进行：即称取相同量待测试样多份，按分析步骤处理试样，然后在处理后的试样中加入定量的待测元素，与未加入待测元素的试样同时显色、测量吸光度，通过计算可得到待测试样中待测元素浓度。这些方法能抵消共存元素的影响，是一种准确、快速的测量方法。第28页,共60页，2024年2月25日，星期天为获得正确的分析结果绘制工作曲线时应注意的问题：(1)标准系列的浓度范围应服从朗伯-比耳定律。待测元素的浓度应在此范围内，不得将工作曲线任意延长。(2)为减少仪器测量误差，吸光度读数以0.2～0.7之间为宜。（高档的光度计可以有较宽的读数范围）

第29页,共60页，2024年2月25日，星期天(3)标准系列与待测溶液应经相同的化学处理,只有充分验证,确认省略某些操作对测定结果无影响时，才可省略某些操作。(4)工作曲线随试剂、温度、仪器稳定性等各种实验条件的变化而有所改变,因此工作曲线的绘制应与试样分析同时进行。第30页,共60页，2024年2月25日，星期天光度法分析条件的选择

为使光度法的测量结果有较好的灵敏度和准确度，应合理选择吸光度的测量条件。如显色剂与显色反应的选定；测定波长的选择；显色剂的用量；最佳显色酸度的控制；显色时间及显色液稳定时间的确定；共存离子的干扰及其消除；参比的影响及参比液的选择；测量条件的优化等。当显色体系确定后，通常应考虑：

(1)测定波长(通常选择最大吸收波长为测定波长)(2)测定狭缝的选择(以不减少吸光度时的最大狭缝)(3)吸光度的测量范围(一般读数选在0.2～0.7之间)(4)选择合适的参比溶液第31页,共60页，2024年2月25日，星期天有关参比溶液的选择1)当试液、显色剂及所用其他试剂在测定波长都无吸收时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比溶液；2)当试液无吸收，而显色剂或其他试剂在测定波长处有吸收时,可用不加试样的试剂空白作参比溶液;3)若待测溶液本身在测量波长处有吸收，而显色剂等无吸收,则采用不加显色剂的试样空白做参比溶液;4)如显色剂和试液在测量波长都有吸收，可将一份试样溶液加入适当掩蔽剂，将待测组分掩蔽起来，使之不与显色剂反应，然后按相同步骤加入显色剂和其他试剂，所得溶液作为参比溶液。第32页,共60页，2024年2月25日，星期天由于透过率T与待测溶液浓度呈负对数关系，因此相同T的读数误差所造成的浓度误差是不一样的。如果读数误差为1%时,要求浓度测量的相对误差小于5%,则待测溶液的透过率应在70%～10%(吸光度为0.15～1.00)范围内。吸光度测量范围的选择可以证明，当T=36.8%(A=0.434)时，测量的相对误差最小,实际工作中一般控制吸光度读数在0.2～0.7之间。为达到此目的，一是调节待测溶液浓度，包括称取试样量和稀释倍数；二是选用适当厚度的吸收池；三是在可能的情况下变化入射光波长。第33页,共60页，2024年2月25日，星期天光度法中显色剂类型及其应用

1、光度分析对显色反应的要求应用光度分析法测定的无机离子中，以离子本身的颜色进行测定的情况很少。一般是把待测离子通过一个显色反应，转变为一种有色化合物进行测定。要求显色反应具有较高的灵敏度和较大的对比度;具有较好的选择性;反应进行得较完全;有色配合物具有固定的组成。第34页,共60页，2024年2月25日，星期天光度分析对所用的显色反应的一般要求如下：

(1)反应具有较高的灵敏度和较大的对比度。即生成的配合物应具有较高的摩尔吸光系数，同时试剂与配合物的最大吸收波长应有较大的差别。

(2)反应具有较好的选择性。即干扰离子少,只有少数离子产生同样的反应,或干扰容易消除。

(3)反应进行得较完全。即生成的有色配合物具有较大的稳定常数。

(4)有色配合物具有固定的组成。即标准溶液与试剂中的有色配合物的组成应是相同的。第35页,共60页，2024年2月25日，星期天2、显色反应条件的选择显色反应条件的选择，是为使待测组分在所选择的反应条件下，能有效地转变为适于光度测定的化合物，具有稳定的组成和相对稳定的时间。

a显色剂的用量

b反应体系的酸度

c显色温度

d显色时间

e溶剂

第36页,共60页，2024年2月25日，星期天主要显色剂类型及其在冶金分析中的应用

1、无机显色剂离子本身的颜色

MnO4-

硫氰酸盐（SCN-）钼酸盐（杂多酸络合物）2、有机显色剂

a.偶氮类变色酸,偶氮氯磷Ⅲ,PAR,5-Cl-PADAB

b.三苯甲烷类铬天青S,二甲酚橙,半二甲酚橙,苯基荧光酮

c.含氮试剂丁二肟,亚硝基R盐,二安替比林甲烷

,

二硫代二安替吡啉甲烷,邻二氮杂菲

d.含硫试剂双硫腙,铜试剂,铋试剂第37页,共60页，2024年2月25日，星期天※光度法的主要测定方式及其应用

单波长测定方式—常规法—萃取光度法—浮选光度法及固相光度法—长光路毛细管光度法差示分光光度法差示吸光光度法是用一已知浓度的标准显色溶液与未知试样的显色溶液相比较，测量吸光度，从测得的吸光度求未知浓度。

A差＝－lg(Ix/I)＝K·l(c－cx)

以A差对(c-cx)作图,可以求出c－cx，c为已知,则cx可求得。

第38页,共60页，2024年2月25日，星期天常规分光光度法常规分光光度法为采用单波长对显色液直接进行测定萃取光度、浮选光度和固相光度法这三类方法都是将待测组分先分离、富集到另一相后再进行光度测定，从而提高测定灵敏度和选择性。A萃取光度法萃取光度法就是将溶剂萃取与光度测定相结合的一种分析方法。它将水相中的有色物质直接萃取到少量与水不互溶的溶剂中后进行吸光度测量，是一种提高灵敏度和排除干扰的测定方法。冶金分析中常用于萃取法测磷。

B浮选光度法C固相光度法第39页,共60页，2024年2月25日，星期天差示分光光度法差示分光光度法可以提高光度法的精确性，从而实现用光度法对物质中某一含量较高组分的测定。例如对高含量成分的测定，有时可达到与重量法、滴定法同等的精确度。故实际应用多在对高含量成分的测定。在差示分光光度法的测量中，要求一个实际具有较高吸收的参比溶液的表观刻度读数为A=0或T=100%故所用的仪器必须具有出光狭缝可以调节，光度计灵敏度可以控制或光源强度可以改变等性能。

第40页,共60页，2024年2月25日，星期天※差示法对较低组分的测定，其降低分析误差的主要依据就是对刻度标尺的放大作用。例如，假定用普通光度法测量参比溶液的透光度为10%，试样溶液的透光度为7%，仅相差3%。若用示差法，将参比溶液的透光度调到100%，则试样溶液的透光度为70%，两者之差增为30%，相当于放大读数标尺10倍。从而相对地增大了这种测量方法的精确性。但实际应用并不多见。第41页,共60页，2024年2月25日，星期天分光光度计的仪器结构原理、结构

分光光度计通常由光源、单色器、样品室、检测系统(检测器和显示仪表或记录仪)等组成。光源单色器样品室（吸收皿）检测系统

光源单色器样品室检测系统第42页,共60页，2024年2月25日，星期天(1)

光源：一般采用钨(350~2500nm，可见光区用)和氘灯(190～400nm，紫外光区用)，根据不同的波长要求选择使用。(2)单色器：从光源发射的复合光中分出单色光的光学装置。单色器由入射狭缝、准直元件、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等五部分组成。常用的色散元件有棱镜和光栅。

第43页,共60页，2024年2月25日，星期天(3)样品室：样品室内装有吸收池架。吸收池由玻璃或石英制成，有不同形状和光程长。玻璃吸收池只能用于可见光区，而石英池既可用于可见光区、亦可用于紫外光区。(4)检测系统（接受器）：通过样品池后的光由检测器接收，产生的电信号，经由显示仪表和信号处理系统记录下吸光度值。第44页,共60页，2024年2月25日，星期天分光光度计的类型分光光度计仪器根据分光光路及所用波长数目，可以分为：单光束和双光束分光光度计；单波长或双波长分光光度计。其光路的示意如右图所示。第45页,共60页，2024年2月25日，星期天双波长分光光度计第46页,共60页，2024年2月25日，星期天典型的分光光度计：721型分光光度计

721型分光光度计－波长范围360～800nm，色散元件为三角棱镜。波长精度：360～600～800nm±3、6、8nm;透射比正确度：±2.5%;透射比重复性：0.5%。该型号的仪器较老了,但仍在实验室中常规使用第47页,共60页，2024年2月25日，星期天典型的分光光度计：TU-1901型紫外可见分光光度计采用全息光栅分光,波长范围：190～900nm。双光束动态反馈分光系统,基线稳定。采用单片微机控制,数字显示,自动调零、调100%功能。三点曲线浓度计算方法。具有光谱扫描,单波长,双波长,三波长及微分定量等功能。配备通用并行打印或微机接口,配RS-232接口双光束动态反馈比例记录测光系统第48页,共60页，2024年2月25日，星期天※紫外可见分光光度计的发展趋势紫外-可见分光光度法的灵敏度高,相对其他光谱分析方法，其仪器设备和操作都比较简单，费用低，且分析速度快。因此，紫外-可见分光光度法在冶金、地质、化工、生物医学、食品、环境保护等诸多领域有着广泛的应用。近些年来紫外可见分光光度计的发展趋势：波长范围向短波近红外区方向拓展；杂散光低，吸光度范围大；多种附件可供选择，以满足多种类型样品分析的要求。在仪器构型方面，从单光束发展为双光束，现在几乎所有高级分光光度计都是双光束的，有些高精度的仪器采用双单色器，使得仪器在分辨率和杂散光等方面的性能大大提高。现在的分光光度仪器从仪器的精密程度和使用性能上均得到很大的提高，均带有电子计算机控制，数据处理、存储、直接数字显示和比色测定的自动化操作等功能。分析软件发展迅速。第49页,共60页，2024年2月25日，星期天分光光度计仪器的安装和调试分光光度计是光学、精密机械和电子技术三者紧密结合而成的光谱仪器，正确安装、使用和定期检查仪器的性能，加强维护和保养是保证仪器处于正常状态获得准确可靠的分析结果的前提，也能延长仪器使用寿命和提高仪器使用效果。1、安装分光光度计实验室的基本要求(1)室温保持在20±2℃为佳，没此条件最高温度也不宜超过28℃，最低不低于15℃。(2)湿度一般宜控制在45～65%，上限不超过70%。

(3)防尘、防腐蚀(4)防震和防电磁干扰第50页,共60页，2024年2月25日，星期天2、分光光度计性能测试分光光度的性能对分析结果的质量影响极大，对于尚未投入使用的新仪器，必须对其主要性能指标进行全面检测。在使用期间，也要定期检查，测试项目包括：

(1)波长准确度

(2)波长重复性

(3)单色器分辨率

(4)仪器的杂散光

(5)光度计线性

(6)光度准确度

(7)光度重复性

(8)噪声

(9)基线的稳定性和平直线分光光度计的性能测试可根据相关仪器的检定规程进行。第51页,共60页，2024年2月25日，星期天※波长校正通常厂家均配有镨钕滤光片以方便用户进行定期校正.推荐使用529nm的吸收峰作为校正的标准，允许波长差为±3nm。超过此值需要进行校正。在没有镨钕滤光片的情况下，可以用标准溶液来对波长进行校正：溴甲酚绿溶液pH8时

max＝615nm；酚红溶液pH11时

max＝558nm；溴酚红溶液pH10时

max＝574nm；0.05mol/L铬酸钾溶液

max＝370nm;氯化钕溶液有两个吸收峰：

1521.8nm；

2582nm;氯化镨溶液有三个吸收峰：

max=444.5nm；这些物质的吸收光谱峰值波长不变，特别是稀土氯化物吸收峰很窄，有利于波长校正。第52页,共60页，2024年2月25日，星期天分光光度计仪器的保养和维护

分光光度计的维护、保养和调试的根本目的在于保持和改善仪器的工作性能，其中主要是保持分光光度计单色光纯度和准确度以及测量灵敏度和稳定性。为此，必须对分光光度计的主要组件作正确使用和保养,必要时作适当调整。对光源部件，应注意如下几点：

(1)光源灯有一定寿命,仪器不工作时不要开灯,若工作间歇时间短，可不关灯和停机，一旦停机，则应待灯冷却后再重新启动，并预热15min