动物细胞工程制药研究现状和展望

第第10页动物细胞工程制药争论现状和展望：当前动物细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培育技术等方面[1].本文综合论述了动物细胞工程制药的进展简史,争论近况和制造实例,并在此根底上探讨了动物细胞工程制药的将来进展趋势和前景.:动物细胞工程制药;细胞融合;细胞大规模培育;核移植21世纪,生物技术制药是制药行业的亮点,近25年来,世界生物技术工业飞速进展,制造了35种重要的治疗性生物技术药物.中国生物技术产业是紧跟世界产业同步进展的.2023年全球生物技术药物市场销售额已到达828亿美元.基因工程、细胞工程和酶工程组成三驾马车行驶在现代生物技术进展大道的前列.动物细胞工程在生物制药的争论和应用中起关键作用,目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过80%,例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等.所以对动物细胞工程制药的争论具有重要意义.一、进展简史开头疫苗是动物细胞技术的开头,在疫苗产业早期,往往利用动物来生产疫苗,如用家兔人工感染狂犬病毒生产狂犬疫苗,用奶牛来生产天花疫苗,用某些细菌接种到动物身上来生产抵抗该种细菌的疫苗.在1920年至1950年,已经开发了多种病毒或细菌疫苗,如伤寒疫苗、肺结核疫苗、破伤风疫苗、1950年月,已经能够利用动物细胞培育技术来生产病毒.先在反响器中大规模培育动物细胞,待细胞长到肯定密度后,接种病毒,病毒利用培育的细胞进展复制,从而生产大量的病毒,这一突破是动物细胞技术或细胞工程的真正开头.基于动物细胞技术生产的病包括减毒的活病毒,或是灭活的病毒.在过去的30多年时间内,用动物细胞技术生产的疫苗挽救了几百万人和动物的生命.1950年至1985年期间,细胞工程及其他技术的进步,生产了多种人用疫苗来预防脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、乙肝和带状疱疹等,并用于生产多种兽用疫苗[2].但是,这段时期对细胞表达水平的争论仍旧很低,因而用这种工艺生产蛋白制品产量低、本钱高,因此早期的动物细胞技术只用于疫苗及少量的干扰素和尿激酶的生产.进展1970年月的两项划时代的科学觉察基因重组技术和杂交瘤技术大大促进了动物细胞技术的进步以及在工业领域的应用,使得动物细胞大规模培育技术在生产疫苗,尤其在生产自然的用于诊断和治疗疾病的生物制品中具有举足轻重的作用.动物细胞技术还用于生产很多诊断和治疗疾病的单克隆抗体.用于生化检测的单抗有几千种,而单抗用于人体疾病治疗是近几年来生物制药的一个重要领域,有几十种单抗药物正处于临床试验中.从1986年FDA批准第一种单抗治疗药物用于器官移植治疗、可以抑制排斥反响的抗CD3单克隆OK-T39FDA外,很多将病毒的抗原打算簇基因转染到宿主细胞体内,用于生产安全性更高、疗效更好的基因工程疫苗也正在开发之中.二、争论现状动物细胞工程制药主要涉及细胞融合技术、细胞器移植尤其是核移植技术、染色体改造技术、转基因技术和细胞大规模培育技术等.细胞融合是用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程.可用于产生的物种或品系及产生单克隆抗体等.在我国目前动物细胞工程的进展中,技术最成熟的当数细胞融合.其中淋巴细胞杂交瘤在国内已普遍开展,并培育了很多具有很高有用价值的杂交瘤细胞株系,它们能分泌产生在诊断和治疗病症方面发挥重要作用的单克隆抗体.如甲肝病毒单克隆抗体[3]、抗人IgM单克隆抗体[4]、肿瘤疫苗[5]等可用于治疗疾病;抗人结肠癌杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体[6],巨噬细胞集落刺激因子受体)胞外区的单克隆抗体等[7]则对诊断疾病具有重要价值.由于技术已趋成熟,目前很多单克隆抗体已经进入产业化的生产阶段.细胞核移植细胞核移植就是将一个动物的细胞核,移植到卵细胞中,并发育生长.核移植技术可用于具有良好进展前景的生物反响器的制备.其中乳腺生物反响器的研制是最为看好的一个转基因制药方向.利用转基因动物乳腺作为生物反响器,生产基因工程人类蛋白质药物[8],其本钱较微生物发酵、动物细胞培育生产基因工程药物大大降低.但十几年来,显微注射技术始终是生产乳腺生物反响器的唯一有用手段,由于它本身固有的缺点,使得乳腺生物反响器未能有长足的步.基因打靶与核移植相结合很可能成为生产乳腺生物反响器更有效的途径,它在外源基因定点整合、消退位点效应、降低生产本钱、节约时间方面具有明显的优势.核移植技术在我国特别是培育鱼类品种方面已有多年的争论根底.目前我国在哺乳动物细胞核移植方面的争论也开展得很好,除了传统的胚胎细胞核移植外[9],体细胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物种上均获得了成功.如2023年6月,西北农林科技大学先后培育出了世界上第一只成年体细胞克隆山羊“元元“和其次只成年体细胞克隆山羊“阳阳“[10].另外,在利用转基因动物作为生物反响器生产基因工程药物方面,上海人类遗传病争论所、中国农业大学、中国科学院发育所、扬州大学、疆畜牧科学院、军事医学科学院和军需大学等都先后获得了可能有潜在生产人用药物蛋白价值的转基因动物.转基因动物转基因动物是指经人的有意干预,通过试验手段将外源基因导入动物细胞中并稳定地整合到动物基因组中,且能遗传给子代的动物.让动物成为制药工厂、制造人类急需的生物制品,这始终是人们梦寐以求的.转基因动物的消灭使得这一梦想正逐步成为现实.在21世纪制药工业中,最具迷人前景的无疑是应用转基因动物生产转基因药物.转基因动物生产药物与以往的制药技术相比,具有不行比较的优越性.哺乳动物生物反响器好比在动物身上建药厂.动物的乳汁或者血液可以源源不断地为我们供给目的基因的产品.它的优越性还有稳定的生物活性.另外,作为生物反响器的转基因动物又可无限生殖,故具有投资本钱低、药物开发周期短和经济效益高等优点.可以说转基因动物的问世,为利用基因工程手段获得低本钱、高活性和高表达的药物开拓了一条重要途径.作为生物反响器的转基因动物,主要是利用其乳腺组织和血液组织进展定位表达,特别是用乳腺组织生产具有生物活性的多肽药物和具有特别养分意义的蛋白质,已成为一个兴的转基因制药业.至今已在以下动物的乳汁中生产出一些人类蛋白质药物:牛奶中有抗凝血酶、纤维蛋白原、人血清白蛋白、胶原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基转移酶、蛋白C等,山羊奶中有抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、生育激素、血清白蛋白、组织型纤维溶原激活因子、单克隆抗体,绵羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子IX、纤维蛋白原、蛋白质C,猪奶中亦有蛋白质CIX[11].我国在这方面的争论也很活泼,并取得了一些成果.早在2023年黄淑帧等成功制备了5IX基因)整合的转基因羊(32120239月产下小羊羔,进入泌乳期,其乳汁中含有活性的人凝血因子IX蛋白,这种凝血因子是治疗血友病的贵重药物[12].而近几年来的转基因产物更是如雨后春笋般的涌现出来,如潘玲、黄俊成和黄英等,分别在转基因小鼠乳汁中成功地表达了人促红细胞生成素、人胰岛素原和人血清白蛋白.转基因动物除了可在生产基因工程药物方面发挥重要作用外,还可用于建立诊断和治疗人类疾病的动物模型、生产可用于人体器官移植的动物器官等方面.863高科技展览中展现的长有“人耳“的小鼠显示了这方面的良好前景,这将有效地解决器官异体移植的生理适应难度大的问题和大幅度地降低器官异体移植的本钱.动物细胞培育动物细胞培育是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖的过程.动物细胞培育开头于本世纪初.1962年,其规模开头扩大,进展至今已成为生物、医学争论和应用中广泛承受的技术方法,利用动物细胞培育生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等,已成为医药生物高技术产业的重要局部[13].利用动物细胞培育技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%[14].大量资料说明,生物技术药物是当前药开发的重要领域,生物技术制药工业是下一个10年制药工业的重要门类,期间将有数百种生物技术药上市[15].动物细胞大规模培育技术是生物技术制药中格外重要的环节.目前,动物细胞大规模培育技术水平的提高主要集中在培育规模的进一步扩大、优化细胞培育环境、转变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上[16].三、制造实例如今,利用动物细胞生产的生物制品已日益增多.美国自20233325下面就几个在动物细胞工程制药的进展史上具有重要意义的产品进展介绍.类淋巴细胞干扰素类淋巴细胞干扰素是由一株从Burkitt淋巴瘤的患者猎取Namalva细胞生产的干扰素,它含80%左右的IFN-α,20%左右的IFN-β.该干扰素首先由英国的Wellcome公司的Fante和Finter8000L1986先在英国获准进入市场,商品名为“Wellferon“.2023Wellferon获美国FDA批准进入美国.该干扰素获准生产在动物细胞进展技术史上是一个很重要的里程碑,由于这是第一个获准用肿瘤细胞系生产的人用药品.类淋巴细胞干扰素的生产工艺大致如下:先将细胞逐级放大4000L8000LRPMI164010%小牛血清.培育方式主要是搅拌式批次培育,当细胞密度达1×106/ml2nmol/L48h,接着用仙台病毒(50HAU/ml)诱生,18h后冷却至5~10℃,收集培育液,连续离心分别细胞,对上清液进展分别纯化.类淋巴细胞干扰素已被广泛应用于临床治疗多种病毒性疾病,如乙型肝炎、丙型肝炎,以及多种肿瘤病的治疗,如毛细血管白血病、Kaposi肉瘤等.组织型纤溶酶原激活剂据不完全统计,各种血栓病已成为很多国家人口死亡和致残的第一位缘由.我国患各种血栓病的患者估量在1300万以上.对于血栓病的治疗方法多种多样,但目前主要的疗法仍是溶血栓法.组织型纤溶酶原激活剂做为其次代特异性的溶栓药1987年被FDA批准上市.它是由美国Genetich公司用CHO细胞表达的,也是第一个用动物细胞大规模培育生产的基因工程产品.尿激酶原作为其次代的又一个特异性的溶栓药,单链尿型纤溶酶原激活剂-尿激酶原目前在很多国家进展临床Ⅲ期试验,估量不久即可上市.在国内,南京大学是用大肠杆菌表达的,而军事科学院生物工程争论所则是用CHO细胞表达的,目前正和天津天士力公司一起进展试验.尿激酶原是一种碱性蛋白,具有特异的溶血栓作用,具有很好的进展前景.促红细胞生成素促红细胞生成素,又称血细胞生成素、红细胞刺激因子,是一种酸性糖蛋白,是第一个被觉察并批准应用于临床的造血生长因子,也是迄今为止产值最高的基因工程产品.它主要用于多种贫血,包括慢性肾衰性贫血、恶性肿瘤放疗和化疗引起的贫血等.由于该药的用量很小,因此有的单位仍承受传统的转瓶生产工艺.也有单位为了到达高产目的,承受了固定化灌流培育的生产工艺.凝血因子Ⅷ由先天性缺乏凝血因子Ⅷ而引起的出血称为甲型血友病,早期治疗承受输入全血或血浆,但由于血浆内凝血因子Ⅷ的浓度很低,因此效果不抱负.20世纪80年月以后,承受单克隆抗体亲和层析,使产品的纯度进一步提高.尤其是由于争论成功了一系列血浆的病毒灭菌法后,使由血浆制备的“极纯“产品,如Monoclate乙型肝炎疫苗乙型肝炎是由乙肝病毒引起的,约占全部病毒性肝炎的40%,它可以急性发病也可以形成慢性肝炎,并进而引发肝硬化、肝癌,而其中很大的一局部人是安康的病毒携带者,不消灭病症,但外表抗原阳性,常常是重要的传染源.在我国,这样的慢性病毒携带者约有一亿人,是对公共卫生的一个重要威逼.至今已被批准的乙肝工程疫苗有两种宿主细胞的,一种是酵母表达的,另一种是CHO细胞表达的.我国病毒争论所的任贵方等在1987年就争论成功了用CHO细胞表达的疫苗.他们用的是NBS公司生产的微载体篮式生物反响器连续灌注培育CHO细胞,然后以14000r/min连续离心去除细胞残骸提取上清,再ButylSSepharoseFastFlow-SephadexG25脱盐-DEAESepharoseFastFlow阴离子交换柱层析-Sepharose4FastFlow[17].四、展望动物细胞工程制药是从疫苗开头的,迄今已有悠久的历史.动物细胞工程制药中目前运用的主要手段有:细胞融合、核移植、转基因动物、细胞培育等.随着细胞工程技术争论的不断深入,我们必能开发出更具有安全性,有效性的技术手段.目前已研发的细胞产品实例主要有类淋巴细胞干扰素,组织型纤溶酶原激活剂,尿激酶原,促红细胞生成素,凝血因子Ⅷ,乙型肝炎疫苗.随着连续深入的争论,更多的不同构造的细胞产品将应用于临床.动物细胞工程不仅可大量工业生产自然稀有的药物,而且其产品具有高效性和对疾病鲜亮的针对性.因而,动物细胞工程药物的进展必将给制药工业带来一次革命性飞跃,在人类的医疗保健中发挥越来越重要的作用.作为现代生物技术之一的细胞工程技术在近半个世纪来突如通过细胞融合技术形成的杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已广泛用于临床治疗,并显示出独特的疗效,获得了很好的社会和经济效益.随着细胞工程技术争论的不断深入,它的前景及其产生的影响将会日益地显示出来.[1]李刚,刘鹏,刘诚迅等.我国细胞工程制药的争论现状和进展前景[J].中国现代应用药学杂志.2023,8,19(4):278.[2]胡显文,肖成祖.细胞工程在生物制药工业中的地位[J].生物技术通讯.2023,5,12(2):118.[3]唐祖明,郑纪山,肖中党等.甲肝病毒单克隆抗体的研制与应用[J].东南大学学报(自然科学版),2023,30(5):21.[4]姚彩霞,李沪霞.抗人IgM单克隆抗体的争论-脾内免疫建立抗人IgM单克隆抗体杂交瘤细胞株[J].微生物学免疫学进展,2023,26(1):66.刘彦君,王皓,卫立辛等.人肝癌细胞与自体激活B淋巴细胞融合制备肿瘤疫苗[J].其次军医大学学报,2023,19(6