一种引起坏死性筋膜炎的变异a族侵袭性链球菌的检测方法

一种引起坏死性筋膜炎的变异a族侵袭性链球菌的检测方法专利名称：一种引起坏死性筋膜炎的变异a族侵袭性链球菌的检测方法技术领域：本发明涉及一种A族侵袭性链球菌的检测方法，具体的说涉及一种引起坏死性筋膜炎的变异A族侵袭性链球菌的检测方法。背景技术：A族链球菌(groupAstreptococcus)又称化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)，是人类细菌感染中最重要的病原菌之一。引起的感染主要有急性咽炎、急性扁桃体炎，也可致肺部感染、猩红热、皮肤软组织感染，严重时可致全身性感染。该菌严重感染除致中毒性休克、败血症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)外，尚伴坏死性筋膜炎(NecrotizingFasciitis)、肌炎、深部血肿及多脏器功能衰竭。近年来由A族链球菌所引起的严重感染，尤其是侵袭性A族链球菌感染(InvasiveGroupAStreptococcusInfections)严重感染的发病率的增长，引起了人们对该细菌感染更大的关注。20世纪80年代后期，变异链球菌严重感染引起的坏死性筋膜炎(NecrotizingFasciitis)和链球菌休克综合症(STSS)造成当地的极大恐慌，其中引起坏死性筋膜炎的A族侵袭性链球菌称为“食人菌”。近年来这种极具感染性的传染病有重新流行趋势，微生物的进化是导致新病原体强毒株出现的内在因素，链球菌引起的严重感染与其基因组进化有关。对全球不同地域的链球菌全基因组测序结果表明，不同国家引起链球菌严重感染的强毒株的基因组序列存在较大差异，毒性强弱与噬菌体介导的基因组的水平转移有关。在世界上许多国家发现了许多强毒株，而且基因组发生了新的变异，如在以色列发现的M14等。对全球不同地域的链球菌全基因组测序结果表明，不同国家引起链球菌严重感染的强毒株的基因组序列存在较大差异，毒性强弱与噬菌体介导的基因组的水平转移有关。如引起NF的菌株中，美加流行的是M1、M3株，以色列是M14株。坏死性筋膜炎(NecrotizingFasciitis)的诊断主要依赖临床诊断，当前仍然缺乏引起坏死性筋膜炎(NecrotizingFasciitis)病原的实验室诊断手段。链球菌导致的严重感染发病机制复杂，迄今尚未发现一种特异的靶分子可单独应用于食人菌的诊断，需要组合多种方法对链球菌严重感染进行实验室诊断。发明内容为克服坏死性筋膜炎(NecrotizingFasciitis)病原的实验室诊断手段缺乏的不足，本发明公开了一种引起坏死性筋膜炎的变异A族侵袭性链球菌的检测方法。本发明的检测方法，通过多种方法的组合，能够诊断鉴定A族侵袭性链球菌引起的食人菌感染。本发明的检测方法，包括以下步骤(1)对分离菌株进行生化鉴定或进行针对speBPCR的检测，确定分离菌株为A族侵袭性链球菌；(2)对分离菌株进行动物模型感染，确定菌株为强毒株；(3)对鉴定的A族侵袭性链球菌进行EMM基因分型；(4)对鉴定的A族侵袭性链球菌进行SLA基因检测。本发明的方法首先通过传统的分离培养和生化鉴定方法确定分离菌株为A族侵袭性链球菌，该生化鉴定方法可为针对speB的PCR快速检测方法替代，因为半胱氨酸蛋白酶SPEB在GAS高度保守，鉴定到该基因的存在即可确定分离菌株为A族侵袭性链球菌；鉴于A族侵袭性链球菌有强毒株和弱毒株之分，然后通过动物模型感染确定菌株为强毒株。然后对鉴定的A族侵袭性链球菌进行EMM基因分型，进行SLA基因检测，以与国外流行株进行对比。本发明的链球菌的分离培养和生化鉴定的技术是将细菌在血琼脂平板上进行分离培养，取纯培养孤立菌落采用VITEK微生物分析仪使用GPI测试卡进行生化鉴定，并进行溶血试验。采用革兰氏阳性菌的自动检测卡检测，也可采用链球菌专用自动检测卡检测。本发明针对speBPCR的检测为制备链球菌DNA模板后，采用引物1(序列表中序列1所示)和引物2(序列表中序列2所示)进行，本法可替代生化鉴定用于引起坏死性筋膜炎的GAS初筛。与生化鉴定实验相比，因本方法针对样品中的DNA检测，本法可用于因抗生素治疗导致链球菌培养阴性的样品的诊断。确定链球菌强毒株的动物模型为引起坏死性筋膜炎的皮肤侵袭小鼠模型。该模型的程序为取A族溶血性链球菌分离培养后，挑取对数期生长的细菌，平板培养计数后，重悬于无菌蒸馏水中洗涤，离心后弃上清，生理盐水重悬，注射Balb/c小鼠背部皮下，观察皮肤感染情况和动物死亡情况。确定分离链球菌为强毒株后，对分离菌株进行EMM基因分型。根据M蛋白的保守序列，经PCR获得现有菌株的emm基因片段，进行序列分析，并对美国CDCemm数据库进行blast分析，建立符合国际标准的链球菌M蛋白分型方法，用于比较与引起NF的国外主要流行株的差异；具体包括以下步骤1)制备链球菌DNA模板；2)PCR反应，采用引物primer1如序列表中序列3，序列3-2所示；primer2如序列表中序列4所示；PCR反应体系10μl含15mMMgCl2的10×PCRbuffer，2μldNTP混合物(10mM)，引物1和引物2各2μl，高质量Taq酶2-5个单位，82μldH2O，模板0.5μl，混匀进行冷启动PCR反应。反应条件如下94℃1min后，进行如下10个循环94℃15s，46.5℃30s，72℃1min15s，然后进行如下20个循环94℃15s，46.5℃30s，72℃1min15s，每一个循环延伸时间增加10s，最后72℃延伸10min，4℃保温；3)DNA测序，以序列表中序列5为测序引物；4)序列分析与比对将测序结果提交美国CDCGASemm序列数据库进行比对分析，确定M蛋白类型。上述speBPCR的检测和EMM基因分型均需制备链球菌DNA模板，链球菌DNA模板制备方法包括以下程序为取新鲜细菌用无菌蒸馏水洗涤2次，用300μl生理盐水重悬，70℃加热15分钟，离心弃去上清。用50μl的TE(10mMTris，1mMEDTA，pH8.0)、10μl的变溶菌素(3,000units/ml)和2μl透明质酸酶(30mg/ml)重悬，37℃温育30分钟，100℃煮沸10分钟，离心，上清中即含有所需的链球菌DNA模板。根据最近公开的链球菌全基因组测序结果，结合生物信息学和比较生物学方法，选取引起NF的美国、英国、加拿大的M3流行株(MGAS315)特异的靶基因序列SLA(毒力因子和侵袭因子)，建立PCR检测方法，SLAPCR基因检测采用引物1序列表中序列6所示和引物2序列表中序列7所示进行检测。本发明提供了引起NF的变异链球菌的多层次的实验室检测方法，并提供适应现场快速筛查的PCR检测试剂，通过这些方法的组合，首先实现了的食人菌感染，对于控制变异链球菌的传入和播散提供了实验手段。图1为链球菌在血琼脂平板上溶血图。图2为坏死性筋膜炎小鼠动物模型，其中左图为国内分离强毒株动物实验结果，右图为国内分离弱毒株动物实验结果。图3为GAS菌株的SPEB的PCR扩增具体实施例方式实施例一变异链球菌的样品分离培养和生化鉴定通用技术的建立细菌鉴定方法按国家临床检验操作规程将细菌在血琼脂平板上进行分离培养，取纯培养孤立菌落采用VITEK微生物分析仪使用GPI测试卡进行生化鉴定，并进行溶血试验。采用上述方法，对44株GAS菌株(其中7株标准菌株，16株来自于沈阳中国医科大学临床分离，12株来自于浙江医科大学附属医学院临床分离，9株来自于北京304医院临床分离)进行分离鉴定。同时结合A族链球菌能产生β溶血的特性，确定7株标准菌株中有5株为A族溶血性链球菌，37株临床分离菌株中有33株为A族溶血性链球菌。每个菌株的生化指标鉴定符合率均在80％以上。实施例二GAS引起坏死性筋膜炎的小鼠模型建立方法借鉴国外坏死性筋膜炎的动物模型，建立了GAS引起坏死性筋膜炎的皮肤侵袭小鼠模型取A族溶血性链球菌分离培养后，挑取对数期生长的细菌，平板培养计数约108CFU，重悬于无菌蒸馏水中，反复洗涤两次，离心，弃上清，用100μl生理盐水重悬。取10g左右的Balb/c雌性小鼠，剃其背部皮毛，皮下注射，观察皮肤感染情况和动物死亡情况。按照以上方法，我们对33株A族溶血性链球菌进行小鼠皮肤侵袭性感染试验，对其侵袭性感染能力进行了评价。动物实验结果显示实验动物出现不同程度的脓肿，其中有3株细菌注射后造成实验动物在1到2天内死亡，其注射部位出现严重脓肿，与国外报道的动物模型有相似的结果。这表明在我国虽然还没有坏死性筋膜炎的报告，表1.GAS皮肤侵袭小鼠模型中不同临床分离株的小鼠感染情况表但我国确实有强毒株的存在，有导致坏死性筋膜炎发生的潜在可能性。实施例三用于PCR检测的链球菌DNA模板制备方法的建立取新鲜细菌用无菌蒸馏水洗涤2次，用300μl生理盐水重悬，70℃加热15分钟，离心弃去上清。用50μl的TE(10mMTris，1mMEDTA，pH8.0)、10μl的变溶菌素(3,000units/ml)和2μl透明质酸酶(30mg/ml)重悬，37℃温育30分钟，100℃煮沸10分钟，离心，上清中即含有所需的链球菌DNA模板。实施例四PCR法快速检测SPEB的引物设计与筛选及SPEB的快速检测方法的建立根据SPEB的DNA序列，设计系列SPEB的引物，通过序列比对分析初步筛选特异性引物，并利用现有样品进行PCR扩增分析引物的特异性，确定一对特异性引物bp1序列表中序列1所示，和bp2序列表中序列2所示，以这两条引物对DNA模板进行Speb特异性序列的PCR扩增，建立了一种针对GAS的快速、特异、敏感的检测方法。对所有样品提取的DNA模板用以上引物进行PCR扩增，并以B族、G族链球菌、炭疽杆菌和土拉的DNA模板做阴性对照做特异性分析。同时将标准菌株32177DNA模板进行1∶10倍比稀释进行PCR扩增做敏感性分析。结果表明所有GAS菌株均能扩出SPEB特异性片段，而G族链球菌、B族链球菌、炭疽杆菌和土拉均未见扩增片段，可见用此PCR方法具有良好的特异性。实施例五符合国际标准的变异链球菌M蛋白分型方法的建立M蛋白是GAS感染的一个主要的毒力因子，具有抗吞噬作用，其蛋白抗原的变异是M分型的基础，编码M蛋白的emm基因的5′端高度变异，可以应用于M蛋白分型。具体分析方法如下M蛋白分型方法1.样品处理方法同链球菌DNA模板制备方法；2.PCR引物1序列表中序列3，序列3-2所示；引物2序列表中序列4所示。PCR反应体系10μl含15mMMgCl2的10×PCRbuffer，2μldNTP混合物(10mM)，引物1和引物2各2μl，高质量Taq酶2-5个单位，82μldH2O，模板0.5μl，混匀进行冷启动PCR反应。反应条件如下94℃1min后，进行如下10个循环94℃15s，46.5℃30s，72℃1min15s，然后进行如下20个循环94℃15s，46.5℃30s，72℃1min15s，每一个循环延伸时间增加10s，最后72℃延伸10min，4℃保温。c)DNA测序，以序列表中序列5为测序引物。3.序列分析与比对将测序结果提交美国CDCGASemm序列数据库(http///ncidod/biotech/strep/strepblast.htm)进行比对分析，确定M蛋白类型。采用上述方法，对33株临床分离GAS菌株进行了M蛋白分型，结果如下表2临床分离GAS的M分型情况根据上表数据可以看出在我国流行菌株以M1为最多，占总菌数的42％。其次是M12，占总菌数的27％。在11例侵袭性感染中，有4例是M1型的，大约占36％。对所有菌株进行SLA的PCR检测，引物PLA1序列表中序列6和PLA2序列表中序列7。结果发现，我国所有菌株中没有一株细菌中含有这种基因，说明在我国没有发生国外强毒株流行的可能。实施例六针对美国强毒株GAS315特异靶基因SLA的PCR扩增方法的建立根据文献，SLA为引起全球NF流行的GAS315(M3)强毒株的特异性靶基因，根据最近公布的GAS315全基因组测序结果，调取SLA基因，设计一对引物LA1序列表中序列6和PLA2序列表中序列7，对所有菌株进行SLA的PCR检测。结果发现，我国所有菌株中没有一株细菌中含有这种基因，全合成的SLA基因序列PCR扩增阳性。侵袭性链球菌.SEQ序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所<120>一种引起坏死性筋膜炎的变异A族侵袭性链球菌的检测方法<130><160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213><400>18tggagtctctgacggcttc20<210>2<211>20<212>DNA<213><400>2gtgttttcggcacaaaaggt20<210>3<211>19<212>DNA<213><400>3tattcgcttagaaaattaa19<210>4<211>19<212>DNA<213><400>4tattggcttagaaaattaa19<210>5<211>20<212>DNA<213><400>5gcaagttcttcagcttgttt20<210>6<211>26<212>DNA<213><400>6tattcgcttagaaaattaaaaacagg26<210>7<211>28<212>DNA<213><400>7cggaattcatgaaaaaagtaataaatac28侵袭性链球菌.SEQ<210>8<211>29<212>DNA<213><400>8cgggatccttaacatcctatagaacctac29权利要求1.一种引起坏死性筋膜炎的变异A族侵袭性链球菌的检测方法，包括以下步骤(a)对分离菌株进行生化鉴定或进行针对speBPCR的检测，确定分离菌株为A族侵袭性链球菌；(b)对分离菌株进行动物模型感染，确定菌株为强毒株；(c)对鉴定的A族侵袭性链球菌进行M蛋白(EMM)基因分型；(d)对鉴定的A族侵袭性链球菌进行SLA基因检测。2.根据权利要求1的检测方法，其中步骤(a)所述生化鉴定是将细菌在血琼脂平板上进行分离培养，取纯培养孤立菌落采用VITEK微生物分析仪使用GPI测试卡进行生化鉴定，并进行溶血试验，采用革兰氏阳性菌的自动检测卡检测。3.根据权利要求1的检测方法，其中步骤(a)所述针对speBPCR的检测为制备链球菌DNA模板后，采用引物1(序列表中序列1所示)和引物2(序列表中序列2所示)进行。4.根据权利要求1的检测方法，其中步骤(b)所述动物模型为引起坏死性筋膜炎的皮肤侵袭小鼠模型；取A族溶血性链球菌分离培养后，挑取对数期生长的细菌，平板培养计数后，重悬于无菌蒸馏水，洗涤离心，弃上清，用生理盐水重悬，注射于Balb/c雌性小鼠背部皮下，观察皮肤感染情况和动物死亡情况。5.根据权利要求1的检测方法，其中步骤(c)所述EMM基因分型包括以下步骤a)制备链球菌DNA模板；b)PCR反应，采用引物1如序列表中序列3，序列3-2所示；引物2如序列表中序列4所示；PCR反应体系10μl含