赤魟肿瘤抑制基因的克隆、表达及生物活性的制作方法

赤魟肿瘤抑制基因的克隆、表达及生物活性的制作方法专利名称：赤魟肿瘤抑制基因的克隆、表达及生物活性的制作方法技术领域：本发明涉及赤魟肿瘤抑制基因的克隆、表达及生物活性。更具体说，本发明涉及从赤魟尾刺cDNA表达文库总质粒出发，利用PCR方法筛选克隆出IPL全长基因，利用基因工程的方法，在高效大肠杆菌表达系统中表达并纯化出具有生物活性的赤魟尾刺IPL蛋白以及由这种蛋白构成的用于预防和治疗人类恶性肿瘤的药物。已有的研究表明IPL基因是一个具有PH功能域的肿瘤抑制基因和/或印迹基因。印迹基因是指在正常发育中显示单等位基因表达的一类基因，即表达父本等位基因者则不表达母本等位基因，反之亦然。表达母本等位基因的印迹基因趋于抑制细胞增殖；而表达父本等位基因者则趋于刺激生长。IPL基因表达的是母本等位基因，与其潜在的生长抑制效应相一致。鼠凋亡相关基因TDAG51是IPL/TSSC3的类似物，TDAG51过表达导致鼠T-细胞杂交瘤FAS介导的凋亡。在活化诱导细胞死亡的Fas表达中，IPL/TSSC3上调Fas的表达来介导凋亡，TDAG51与TCR信号联合起作用。IPL基因的表达具有生长抑制效应，其低表达可能导致细胞对凋亡信号产生抗性。结构预测表明IPL/TSSC3/BWR1C具有一类似于血小板-白细胞C激酶底物同源(pleckstrin-homology，PH)区的中心基序(motif)。象其它一些印迹基因一样，IPL基因较小且其内含子也小。PHdomain是一个与蛋白质-磷脂相互作用的信号传导途径相关的功能结构域。赤魟IPL基因是在软骨鱼类中首个被发现的肿瘤抑制基因，扩充了已知印迹基因的数量及囊括的物种范围。生物信息学分析表明赤魟CH123基因与人和小鼠同源物IPL基因的核苷酸序列相似性达78％和72％；蛋白质序列同源性达50％和48％，而其功能域PH区基本保守。本发明提供一种如序列表中序列号码1所示核苷酸序列的DNA。本发明提供一种如序列表中序列号码1所示氨基酸序列的蛋白质。本发明提供一种重组载体，该重组载体包括上述一种核苷酸序列。本发明提供一种含有上述重组载体的原核细菌。在一种实施方式中，上述原核细菌是大肠杆菌。在一种实施方式中，上述载体使是以硫氧环蛋白为融合伴体，中间插入6个His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体pETTRX-IPL。在一种实施方式中，上述载体使所述DNA在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达，其表达量为40-60mg/L。在一种实施方式中，上述重组载体的表达产物超音裂解液经过Ni-Chelating亲和柱层析，蛋白酶3C切割和凝胶过滤可得到纯度在95％以上的性质稳定的成熟蛋白，得率为5-8mg/L。本发明还提供一种用作引物的DNA片段，该DNA片段由上述核苷酸序列的一部分序列组成。本发明还提供一种含有上述蛋白的预防或治疗肿瘤疾病的药物制剂。本发明的上述蛋白可以用于制备预防和治疗肿瘤疾病的药物。本发明所选择的魟鱼属于赤魟(Dasytisakajei)，采购自广东省湛江水产品市场。赤魟尾刺cDNA文库的构建首先解剖分离到赤魟尾刺，提取总RNA；进行第一链合成，LDPCRcDNA扩增，酶切消化和柱回收cDNA构建表达文库；随机挑取小量文库克隆测序获得赤魟IPL肿瘤抑制基因的EST。然后用PCR的方法从赤魟尾刺表达文库总质粒中筛选克隆到IPL全长基因，根据所获得的肿瘤抑制基因IPL3’端和载体核苷酸序列，设计引物，PCR扩增得到目的条带，将目的条带连接到T-easy载体，并转化E.coli挑选重组克隆。本发明通过对以上重组克隆进行序列测定，克隆获得赤魟IPL肿瘤抑制基因全长基因，并通过基因工程方法表达出重组蛋白。新基因编码136个氨基酸的成熟肽，等电点约为9.68，分子量约为15,690道尔顿，具有典型的IPL基因一级结构的特征。出现了PH结构域一级结构特征性的单一且几乎不变的C末端色氨酸(Trp，W)残基。分子内含有3个半胱氨酸。本发明通过一对引物的设计，将编码赤魟IPL基因用PCR方法从T-easy载体上扩增出来，克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建成表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)(见图3)。此表达载体(pTRX-IPL3C)以T7为启动子，采用分子伴侣TRX为融合伴体，可帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有蛋白酶3C位点，以便外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，IPL3C融合蛋白的表达量可达到60mg/L，在Ecoli.中处于部分可溶状态。本发明还摸索和优化了重组IPL蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni2+ChelatingSepharose亲和色谱层析，得到纯度较高的融合蛋白，融合蛋白经3C蛋白酶切割和进一步的G50凝胶柱层析，可得到纯度在95％以上的成熟重组赤魟尾刺肿瘤抑制基因IPL蛋白。本发明获得的重组肿瘤抑制基因IPL蛋白是有生物活性的。本发明获得的重组赤魟尾刺肿瘤抑制基因IPL蛋白对体外培养的人类某些恶性肿瘤细胞具有明显的生长抑制作用。对重组赤魟尾刺肿瘤抑制基因IPL蛋白进行的活性实验，利用MTT法检测赤魟IPL重组蛋白对培养肿瘤细胞的作用，发现重组赤魟IPL蛋白对MGC803(胃癌)、RD(横纹肌肉瘤)、HL60和Jurkat(白血病)等有杀伤作用，对两个肺癌细胞则无作用。(见FIG)本发明利用分子生物学的方法，找到了1个新赤魟IPL肿瘤抑制基因，并采用融合表达系统生产出具有体外抑制恶性肿瘤细胞生长繁殖的重组赤魟IPL蛋白。本发明的含有赤魟尾刺肿瘤抑制基因IPL蛋白成熟肽编码序列的表达质粒pETTRX-IPL3C(构建过程见图3)已经保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，珞珈山，武汉大学校内)，保藏号为M201038，保藏日2001年10月26日。由该表达质粒载体经KpnI/NotI双酶切，可得到448bp的片段，即为赤魟尾刺肿瘤抑制基因IPL蛋白成熟肽编码序列(其中包含蛋白酶3C识别位点)(酶切结果见图4)本发明的表达质粒载体的复制方法参照Sambrook(Sambrook，etal.1989，Molecularcloing.ColdSpringHarborLabroratoryPress.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。图2为赤魟尾刺IPL肿瘤抑制基因的PCR电泳结果，其中1.PCR目的条带；2.200bpDNA标志(Promega)。图3为含赤魟IPL基因的重组质粒pPETTRX-IPL3C表达质粒构建图。图4为表示PH结构域的示意图。图5为含赤魟尾刺IPL肿瘤抑制基因的BSK-IPL3C中间质粒和pPETTRX-IPL3C表达质粒酶切鉴定图。其中，M1KbDNA梯式；栏1pPETTRX-IPL3C载体质粒KpnI，NotI双酶切产物；栏2pPETTRX-IPL3C载体质粒；栏3BSK-IPL3C载体质粒的KpnI，BamHI双酶切产物；栏4BSK-IPL3C载体质粒图6为重组赤魟IPL3C蛋白诱导表达、亲和层析、酶切及分子筛层析电泳图。图6A表示相同收菌时间，不同IPTG诱导浓度的蛋白表达及可溶性，其中，C未加IPTG诱导的总菌体；M蛋白质低分子标志；0、0.01、0.1、0.25、0.5和1mMIPTG浓度梯度诱导表达菌体超声上清。图6B表示纯化赤魟rIPL的SDS电泳，其中，C未诱导的总菌体；M蛋白质低分子标志；1表达总菌体；2超声上清；3150mM咪唑峰；4酶切；5纯化融合rIPL；6纯化的rIPL。图7表示重组赤魟rIPL蛋白亲和层析图谱。其中，BB液洗脱；CC液洗脱；DD液洗脱；EE液洗脱。图8表示重组赤魟rIPL蛋白分子筛层析图谱。A第1峰；B第2峰；C第3峰。图9表示用MTT法测定重组赤魟rIPL对体外培养肿瘤细胞的生长抑制作用。引物设计和PCR扩增根据文库少量克隆随机测序结果所获得的IPL肿瘤抑制基因的EST3’端和载体核苷酸序列，设计引物，T7引物5’-TAATACGACTCACTATA-3’；IPL引物5’-TCACTTCAGCCAGGTGTCA-3’。每50μlPCR反应体积加入1μl文库总质粒作为模板，PGR扩增，电泳检测，发现在850bp附近出现预期的特异性扩增带(见图2)，回收此带。实施例2重组赤魟尾刺IPL肿瘤抑制基因序列的测定和分析将回收的电泳产物连接至T-easy载体，转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。一共测定了16个克隆，Blast同源分析表明，其中有10个是IPL肿瘤抑制基因序列，这10个IPL肿瘤抑制基因序列长度都是849bp，编码1个长度为136个氨基酸的IPL蛋白，编号为Ch123。它与人和小鼠同源物IPL基因的核苷酸序列相似性达78％和72％；蛋白质序列同源性达50％和48％但不完全相同，而其功能域PH区基本保守。在赤魟中乃首次报道，是1个新的IPL肿瘤抑制基因。利用工具软件DNAtools对其碱基序列进行分析，并获得其最大读码框，在靠近5’端处出现起始密码子ATG，并且在ATG前-3位为A，可以确认紧跟其后出现的ATG为赤魟IPL基因全长序列的起始密码子；序列分析还发现，在3’端终止密码子后出现了polyA序列，由此亦可以确认此序列已经终结。故根据以上的多方面分析可以判断本实验所采用的赤魟IPL基因序列为全长序列。另外通过Clustalw分析软件可得如下比较结果Ch123_MRKTADSAQVMKEGVLEKRGDNLLQLWKKKYCVLTQDCLQLYPDSQKRSRSKTIH1MTAAATATVLKEGVLEKRSGGLLQLWKRKRCVLTERGLQLFEAKGTGGRPKHomMKSPDEVLREGELEKRSDSLFQLWKKKRGVLTSDRLSLFPAS-PRARPKMus_MASKIVMSSKTVKTSDEILCEGELEKRSDSLFQVWKKKRCVLTADRLRLFSG-KTSPAK.::******...*:*:**:******:..*Ch123_DLSLQEIRTVDCVERTGKYIYFTVVTTDNKEMDFRCLAEG-SWNAAITMAVIEFKNKKAITIH1ELSFARIKAVECVESTGRHIYFTLVTEGGGEIDFRCPLEDPGWNAQITLGLVKFKNQQAIHomELRFHSILKVDCVERTGKYVYFTIVTTDHKEIDFRCAGES-CWNAAIALALIDFQNRRALMus_ELFFHSILKVDCVEHTSKYVYFTIVTNYYKEIDFRCTVES-CWNAAITMALIDFQNRRAL:*:**:****.:::***:***:*****.****::.::.*:*::*:Ch123_QSFRSRQDAEMLSVGQQEKLLGRAPTIH1QTVRARQSLGTGTLVSHomQDFRSRQERTAPAAPAEDAVAAAAAAPSEPSEPSRPSPQPKPRTPMus_QDFPRYRYQRSESEMPSEPGEQSALGP*.::“*”表示相同；“:”表示差异较小；“.”表示差异明显；空格表示完全不同由上分析结果可以看出，本实验采用的赤魟IPL基因与其他物种的同源基因具有较高的同源性，具有典型的IPL基因一级结构的特征。其功能域PH区基本保守，出现了PH结构域一级结构特征性的单一且几乎不变的C末端色氨酸(Trp，W)残基。经功能域预测，赤魟IPL基因的PH结构域从第10至105个氨基酸，位置见图4。在PCR扩增反应中，用普通的Taq酶会出现约10-4的错配，由于目的片段不大，PCR的循环数不超过30个，降低了错误参入的概率，从实验结果来看，这个序列在多个克隆测序中重复出现，可排除错误参入，说明本实验PCR的结果有较高的可信度。实施例3重组赤魟尾刺IPL肿瘤抑制基因表达质粒的构建依据赤魟IPL基因的两端序列合成一对引物，在上游引物中引入KpnI酶切位点(GGTACC)、ATG起始密码子、以及一个PrescissionProtease切割位点，下游引物中引入BamHI酶切位点(GGATCC)及终止密码子TTA，CTA。上游引物(P1)5’-GGGGTACCCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGTCCAATGKpnIPrecisionProteasesiteAGGAAGACAGCGGATAGT-3’下游引物(P2)5’-CGGGATCCTTACTAGGGAGCCCTTCCCAACA-3’BamHI以含赤魟IPL基因的pGEM-TEasy质粒为模板，P1、P2为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在450bp左右。PCR扩增产物先以KpnI/BamHI双酶切后连接到BSK载体上构建成BSK-IPL，再以KpnI/NotI的酶切克隆到原核融合表达载体pPETTRX上。克隆载体和表达载体分别用KpnI/BamHI和KpnI/NotI进行双酶切鉴定(酶切结果见图5)。克隆载体和表达载体中的外源基因经测序鉴定正确。所设计的上游引物中含Pre-scission蛋白酶切割位点，以便切除融合分子伴侣TRX。实施例4重组赤魟尾刺肿瘤抑制基因IPL蛋白融合蛋白的表达将pETTRX-IPL转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS电泳分析表明，菌体经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件PROTEINANALYSIS预测的理论值30.1KD相符。经过对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索(见图6菌体扩大培养不同时间后诱导表达比较)，基因工程菌的培养条件为接单菌落于50ml氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物20ml接种于2L的氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.6(扩大培养约2h)，加入100mMIPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为1mM和0.2％，25℃，250rpm诱导培养10h后离心收获菌体。经SDS电泳分析分析表明，在此条件下赤魟尾刺Trx-IPL融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的20％以上，处于部分可溶状态(见图6)。实施例5重组赤魟尾刺肿瘤抑制基因IPL融合蛋白的纯化及成熟蛋白的获得将收获的总菌体用TE(pH8.0)洗涤，再用Tis(50mM，pH7.0)悬浮，超声处理后，裂解上清液经Ni2+ChelatingSepharose亲和色谱层析一步纯化，经SDS分析和薄层扫描分析表明融合蛋白的纯度达到80％(图6B、图7、图8)。以1L基因工程菌培养物为材料，最终获得约60mg纯化的融合蛋白。为了提高重组蛋白的得率和浓度，简化实验步骤，缩短对重组蛋白的处理时间，在用Ni2+亲和色谱层析纯化重组蛋白时，我们采用一步法进行纯化。根据载体质粒pETTRX所表达的外源蛋白与Ni2+亲和柱的结合能力较强的特点，选用了较简化的洗脱条件50mMTris，500mMNaCl，pH7.0(A液)；50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(B液)；50mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(C液)；100mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(D液)；150mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(E液)。重组IPL蛋白在D液和E液被洗脱下来(图7)。从SDS结果来判断分离效果最好的部分。利用Folin-酚法测定重组PLA2的蛋白浓度，收获浓度在0.7mg/ml以上的洗脱液，加入PrecisionProtease进行切割，用SDS检测酶切结果，可明显看到16kD附近代表成熟rIPL的谱带(见图6B)。将反应液用Ni2+ChelatingSepharose亲和色谱层析柱纯化(条件同前)，收获含成熟rIPL的穿流液，并用SephadexG-50进一步纯化(洗脱液为PBS)，便得纯度在95％以上的成熟重组赤魟尾刺rIPL蛋白(见图8)。实验1MTT法测定重组赤魟rIPL蛋白对体外培养肿瘤细胞的生长抑制作用MTT可与活细胞的线粒体结合形成蓝紫色甲月替，所以MTT的结晶量与活细胞数成正比。在10％FBS的RPMI1640培养液，37℃，5％CO2的培养条件下，常规培养MGC803(胃癌)、RD(横纹肌肉瘤)、HL60和Jurkat(白血病)等细胞。取对数生长期细胞，消化记数，接种相同数量细胞于96孔板。第二天加入按浓度梯度配制的重组赤魟rIPL蛋白样品，每个浓度梯度三复孔，以PBS作空白对照。作用细胞48小时后，每孔加入20ulMTT(5mg/ml)，37℃温育4小时，吸弃上清，每孔加入100ul的DMSO。摇匀后，用酶联仪在570nm处测定光吸收值，用ORIGIN5计算IC50值，并绘制曲线图。其结果见表1和图9。表1重组赤魟rIPL蛋白对体外培养肿瘤细胞作用OD57值的变化(MTT法)序列表1.一般信息(i)申请人北京博奥环宇生物技术有限公司(ii)发明名称赤魟肿瘤抑制基因的克隆、表达及生物活性(iii)序列数目2序列号1序列长度849序列类型碱基对链数双链拓扑学直链状序列种类DNA起源生物赤魟(Dasytisakajei)株名大肠杆菌BL21(DE3)序列特征表示特征的记号有正确的读码框决定位置起始、终止密码子决定特征的方法实验存在位置起始密码子存在于第76-78位，终止密码子494-496位GAGTCAGAGAGCTGCCGCTGTGGGAGAAGTCGGAGAGCCGGTTCTAGCTTCTTTACGGCA60AGGCTTCAACTTAAAAGTTCTTAGATGAGGAAGACAGCGGATAGTGCCCAGGTGATG118MetArgLysThrAlaAspSerAlaGlnValMetAAGGAAGGCGTGCTGGAGAAGAGGGGCGATAACCTGCTCCAGCTCTGGAAG169LysGluGlyValLeuGluLysArgGlyAspAsnLeuLeuGlnLeuTrpLysAAGAAGTACTGCGTGCTGACCCAAGACTGCCTCCAGCTCTACCCGGACTCC220LysLysTyrCysValLeuThrGlnAspCysLeuGlnLeuTyrProAspSerCAGAAGCGGTCCCGGAGCAAGGACCTGAGTCTGCAGGAGATCCGGACGGTG271GlnLysArgSerArgSerLysAspLeuSerLeuGlnGluIleArgThrValGACTGCGTGGAAAGGACGGGCAAATACATCTACTTCACCGTGGTCACCACC322AspCysValGluArgThrGlyLysTyrIleTyrPheThrValValThrThrGACAACAAAGAGATGGACTTCAGGTGCCTGGCGGAAGGCAGCTGGAACGCG373AspAsnLysGluMetAspPheArgCysLeuAlaGluGlySerTrpAsnAlaGCCATCACCATGGCTGTCATTGAGTTCAAGAACAAGAAAGCCATCCAGAGC424AlaIleThrMetAlaValIleGluPheLysAsnLysLysAlaIleGlnSerTTCCGATCGCGACAGGACGCAGAGATGCTCAGTGTGGGCCAGCAAGAGAAG475PheArgSerArgGlnAspAlaGluMetLeuSerValGlyGlnGlnGluLysCTGTTGGGAAGGGCTCCCTAGGCGTACTCCACAGGTTGGTCATGTTGATCGTGGA530LeuLeuGlyArgAlaPro*AGAAACATCAGTAAGTGAACAGTGGATGAACACACCCAGGAGATTGAGAGCCATTTGAAG590TGACTTCAGTTTCGTCCTCTGCTGCTGCTGTCAGAAGGACCCAAGCTGCTGTAATCAGCC650CCAGACATTCAGGACCTGACACCTGGCTGAAGTGAGCCTGTGGGGTTGACTGGAAATCTG710CTTTATTTATTTACCTGTTGCAGAATCCAAGA