温州大学毕业设计

本文格式为Word版下载后可任意编辑和复制第第页温州大学毕业设计一、背景介绍

21世纪是生物的世纪，在这样的社会大环境下，对于生物体的讨论也是更加的超前，学者们花大量的时间和精力去讨论前人的试验以及探究发觉新的结论。通过不断的讨论来探究生命的现象的本质因素。自由基理论认为细胞的代谢过程离不开氧的存在，生物氧化的过程是细胞获得能量的过程。自由基理论把年轻与代谢联系起来，并认为呼吸代谢氧化磷酸化过程中产生过多的自由基对生物体大分子物质的氧化损伤会加速年轻的进程，从而减短了寿命。其中最主要的是活性氧（ROS）水平。因为高ROS水平会增加氧化来损伤生物大分子如蛋白质、脂质及DNA，因此高ROS水平被认为是削减预期寿命的缘由。

然而有关对鸟类的讨论表明，有些物种的代谢率越高其寿命反而越长。此外，与保持在室温下的小鼠相比，暴露在相对低温状况下的小鼠其代谢较高并且寿命也较长。对于代谢率与ROS产生的关系，在一些讨论中发觉这两者之间是存在着明显的负相关，对其的一个可能的解释是“解偶联求生存”假说。该假说提出，解偶联蛋白降低ROS的产生，通过降低线粒体内膜的电位来实现的。

UCPs是线粒体膜上的转运蛋白，迄今为止，在哺乳动物体内已发觉5种UCPs：UCP1主要分布在褐色脂肪组织中；UCP2能在白色脂肪组织、骨骼肌和免疫系统等多种组织中消失；UCP3主要存在于骨骼肌和脂肪组织里。UCP4和UCP5主要在大脑和肝脏中消失。UCP1调整机体产热，可介导任意食物诱导的产热。UCP2因为具有质子漏功能，而削减了线粒体ROS(活性氧）产物的产生。UCP3有较强的削减ROS的产生和从线粒体基质中输出脂肪酸阴离子或脂质过氧化产物的力量，这样可以进一步削减氧化应激等。总的来说，UCPs能掌握线粒体内ROS生成，与氧化应激等过程也有亲密联系。

“解偶联求生存”假说猜测，暴露在寒冷环境下动物的组织应当会降低ROS的产生而解偶联蛋白的表达量会增高。但是一些讨论结果并不符合解偶联生存假说，比如暴露在寒冷环

境下大鼠的肝脏、心脏和骨骼肌中过氧化氢（H2O2）水平增加，暴露在寒冷环境下短尾田鼠的肝脏和肌肉组织蛋白质羰基水平显著增加。

我们设计试验来测定温度对黑线仓鼠的代谢率、氧化应激、抗氧化水平和mRNA的表达的影响。我们翻阅大量的资料，认真分析之前相关试验的数据，以及之前试验的相关结论，讲究这些之间的相关性。并且参考之前试验的相关原理以及试验存在的不足之处，为我们自己的试验做好充分的预备。从前的一个讨论发觉，暴露在适度寒冷或气温相对温柔的环境中，对黑线仓鼠氧化应激和抗氧化水平并没有造成显著变化。当前讨论的目的是测定温度对黑线仓鼠代谢率、氧化应激和抗氧化水平的影响，以及与“解偶联求生存”假说关系。

二、试验材料

本试验所使用的黑线仓鼠来自于河北省的农田(115°13’E,38°12’S)，被饲养于温州高校。黑线仓鼠被单独安置在装有适量锯末的塑料笼子里(29×15×18cm)，定期更换洁净的锯末并且清理笼子；保证黑线仓鼠有充分的食物(北京科奥饲料有限公司的标准啮齿动物食物)和水。试验前全部动物都安置在21±1°C温度的环境中。

成年仓鼠3.5到4.5个月的年龄，随机分成3组，低温驯化组5±1°C(n=9)和暖和气温驯化组32.5±1°C(n=8)，对比组保存在室温下(21±1°C)(n=8)，分别饲养6周。全部动物的体重和食物摄入量是每两天测量一次并且准时记录数据。温度处理结束后，对各个组的组织样品进行收集与保存。

三、试验方法

3.1总能量摄入(GEI)，消化能量摄入(DEI)和消化率

在试验的最终两天对总能量摄入，消化能量摄入进行测定。将每个笼子中剩下的食物以及从木榍中挑出黑线仓鼠的粪便分别装好，并且将黑线仓鼠的粪便置于60°C的烘箱中烘干并且测量记录数据。食物和粪便的总能量用氧弹量热计测定。

总能量摄入(GEI)，消化能量摄入(DEI)和消化率计算使用以下方程：

总能量摄入(kJ/d)=[食物摄入量(g/d)×饲料的干物质含量(%)–食物碎屑]×食物总能量含量(kJ/g)；

消化能量摄入(kJ/d)=总能量摄入–[粪便干质量(g/d)×粪便的总能量含量(kJ/g)]；

消化率(%)=消化能量摄入/总能量摄入×100%

3.2氧化应激标记物和抗氧化酶

试验材料的提取，采纳断颈法取血，将黑线仓鼠处死，快速取其肩胛间的褐色脂肪组织

（BAT），腿部骨骼肌、肝脏、心脏和大脑，并且将这些试验材料储在液态氮中快速冷冻，以保证明验材料的活性。组织的处理方式：根据肯定的质量配比将组织放置到冰冷的0.9%的氯化钠溶液中进行匀浆，然后再放到离心机中用3000转的转速对其进行离心，15分钟后取其上清液保存在相宜的环境中待后续试验分析。用Lowry法测定蛋白质浓度。使用(南京建成生物工程讨论所)生产的试剂测定过氧化氢（H2O2）水平，并通过对过氧化氢水平的测定来分析分析黑线仓鼠的氧化应激水平。过氧化氢（405nm）的水平表示为毫摩尔/克蛋白质（mmol/gprotein）。

丙二醛(MDA)作为脂质过氧化反应的指标。MDA是脂质过氧化反应的最终产物，用硫代巴比妥酸（TBA）在532nm波进步行测定，并且产生具有粉红色的产物。组织MDA水平表示为纳摩尔/克蛋白质（nmol/mgprotein）。

3.3总抗氧化力量（T-AOC）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性

使用(南京建成生物工程讨论所)生产的试剂测定T-AOC和GSH-活性。在之前的大量预试验讨论中证明这些试剂都适用于黑线仓鼠。黑线仓鼠机体中有很多抗氧化物质，能使3价的Fe还原成2价的Fe，后者可与菲啉类物质形成稳固的络和物，通过比色可测出其抗氧化力量的凹凸。在测定过程中，将待测液按肯定要求处理后用双蒸水调零1cm光径，520nm测各种管吸光度。定义：在37℃时，每分钟每毫克待测液，使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为一个总抗氧化力量单位。

在GSH-PX活性测定的基础上还原谷胱甘肽（GSH），过氧化氢产生氧化型谷胱甘肽（GSSG）和H2O反应。GSH与二硫化碳代2硝基苯甲酸（DTNB）反应产生2-硝基-5-硫代苯甲酸，可以在412nm处被检测的黄色化合物反应。

3.4实时RT-qPCR的分析

荧光定量PCR分析使用Trizol试剂（TAKARA，中国大连）。提取褐色脂肪组织、肝、心脏、骨骼肌和脑组织总RNA，用分光光度计测定的吸光度值确定RNA样品浓度，然后调整到全都水平。取用调整过浓度的总RNA样品2μL，用MLV反转录酶（TAKARA）和oligo（dT18）引物进行cDNA的合成，反应体系为50μL。用2μL的cDNA样品作为模板，使用解偶联蛋白目的基因的特定引物进行PCR反应（表1）。

表1：用基因特异性引物序列测定实时RT-QPCR来分析解偶联蛋白在黑线仓鼠中的表达。

Table1.Gene-specificprimersequencesusedforReal-timeRT-QPCRanalysisofuncoupling

protein(UCP)expressioninthestripedhamster.

Gene

UCP1(forward)

UCP1(reverse)

UCP2(forward)

UCP2(reverse)

UCP3(forward)

UCP3(reverse)

UCP4(forward)

UCP4(reverse)

UCP5(forward)

UCP5(reverse)

Actin(forward)

Actin(reverse)

Primers(5’to3’)GGGACCATCACCACCCTGGCAAAAAGGCTTTCTGTTGTGGCTATGCTGGCGGTGGTAGGAGATTGAAGTGGCAAGGGAGGTATGGATGCCTACAGAACCGACAATGGCGTTTCTCGTGCCGAATAATGAACCAACACCAAGGGGTCATTCTCATGCCTTGTTCCGAATCTAAATCACTCCTGACACTACCCAAAGACCTCTATGCCAACAACATCTGCTGGAAGGTGG33020890150191196Size(bp)

3.5统计数据

数据都表示为平均值±标准误差，在SPSS13.0统计软件进行统计分析。体重和食物摄入量的变化检测使用重复测量方差分析。采纳皮尔森相关系数分析来检验H2O2和MDA水平并T-AOC和GSH-Px活性之间的关系。P0.05被认为是具有统计学的显著意义。运用统计学的方法处理和分析数据之间的关系。

四、试验结果

4.1体重和食物摄入量

3个小组黑线仓鼠的体重在试验开头前并没有显著的区分(d0，F2,22=0.11，P0.05，图1A)，并且经过六个星期的驯化后，3个小组黑线仓鼠的体重也没有显著的差别(d2，F2,22=0.45