噬菌体展示技术的原理及应用

关于噬菌体展示技术的原理及应用一、噬菌体展示技术的原理LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表达型第2页,共44页，2024年2月25日，星期天

噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。

第3页,共44页，2024年2月25日，星期天选择方法：淘选（Panning)而不是筛选（Screening)第4页,共44页，2024年2月25日，星期天非展示系统展示系统第5页,共44页，2024年2月25日，星期天SolidphaseselectionwithimmunotubesBBBBBBvvImmunotubecoatedwithantigencoatedwithsteptavidinandbiotinylatedantigenB第6页,共44页，2024年2月25日，星期天biotinantigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigen第7页,共44页，2024年2月25日，星期天BindtoStreptavidincoatedmicrotitrewells第8页,共44页，2024年2月25日，星期天Washtoremoveunboundphageparticles.第9页,共44页，2024年2月25日，星期天Eluteboundphage第10页,共44页，2024年2月25日，星期天AmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyze a)ELISA b)Specificity c)Sequencing d)Affinity e)ActivityE.coli感染和扩增第11页,共44页，2024年2月25日，星期天

固相淘选系统完整细胞组织，器官常规法淘选方法正负法竞争法第12页,共44页，2024年2月25日，星期天噬菌体展示技术最关键的优势有三：第一，淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。第13页,共44页，2024年2月25日，星期天

噬菌体（M13,T7,T4,)

病毒（反转录病毒，杆状病毒）表面展示系统细菌（葡萄球菌，E.Coli)

酵母体外共价连接（蛋白—DNA,

蛋白—RNA)第14页,共44页，2024年2月25日，星期天第15页,共44页，2024年2月25日，星期天

诊断被动免疫抗体蛋白质结构分析药物导航蛋白质纯化应用范围：第16页,共44页，2024年2月25日，星期天

受体—配体信息传递蛋白质—蛋白质诘抗剂蛋白质—DNA抑制剂蛋白质—其他多肽诊断基因表达控制中和活力药物及药物导航酶及底物第17页,共44页，2024年2月25日，星期天噬菌体抗体库的构建第18页,共44页，2024年2月25日，星期天AntibodyIgGstructure第19页,共44页，2024年2月25日，星期天AntibodyIgGstructure第20页,共44页，2024年2月25日，星期天CLVLVHCH1VLCLVHCH1CH2CH2CH3CH3AntibodyIgGstructure第21页,共44页，2024年2月25日，星期天VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab’)2FabFcMembraneExtensionAntibodyIgGstructure第22页,共44页，2024年2月25日，星期天VHVLCLCH1CH2CH3AntibodyIgGstructure第23页,共44页，2024年2月25日，星期天VHVLCLCH1CH2CH3Fv第24页,共44页，2024年2月25日，星期天FvVHVLscFvVHVLSingleChainFragmentvariable第25页,共44页，2024年2月25日，星期天第26页,共44页，2024年2月25日，星期天第27页,共44页，2024年2月25日，星期天

单克隆抗体噬菌体抗体

杂交瘤技术展示技术宿主细胞:杂交瘤细菌筛选范围:~103107109时间:几个月几周操作:繁杂相对简单免疫:必须可避免人源抗体:+费用:高低生产量:有限无限基因获取:再克隆直接应用前景:有限不可估

第28页,共44页，2024年2月25日，星期天二、噬菌体展示技术的应用现状

抗体：抗狂犬病毒的单链抗体，抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1感染并表达有gp120的淋巴细胞,中和响尾蛇毒素的单链抗，等等。第29页,共44页，2024年2月25日，星期天疫苗：展示在噬菌体表面的HIV-1的gp120-V3环可象天然抗原一样引起显著的免疫应答,等等。第30页,共44页，2024年2月25日，星期天3.多肽类药物：如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13肽，它能中和蛇毒α-bungarotoxin；从CX7C多肽库中掏选到一个多肽能与Hantavirus结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性；等等。第31页,共44页，2024年2月25日，星期天肿瘤药物导航载体：用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药物的定向输送工具。一个成功的实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的特异性亲和力。将此多肽与细胞毒素doxorubicin偶联。结果显示，此偶联物具有更强的抑制肿瘤的效果.第32页,共44页，2024年2月25日，星期天5.酶：例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等

第33页,共44页，2024年2月25日，星期天底物与抑制剂：主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。

第34页,共44页，2024年2月25日，星期天信息传递研究:

利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80和一个Hantaviral受体；受体的配体，如血管促生素、α-bungarotoxin，和一些大蛋白分子中的折叠区域，如SH2、SH3和WW区域。从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽,因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。第35页,共44页，2024年2月25日，星期天

8.DNA结合蛋白：锌指蛋白是一类DNA结合小肽结构物，这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别和结合特殊的DNA序列。噬菌体展示技术也可以用于创造一个大的、具有识别不同DNA序列的锌指的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与DNA结合位点之间的识别规则，可以通过设计锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干扰病毒感染生活周期。第36页,共44页，2024年2月25日，星期天1．

9.蛋白质组学：噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文库的滴度可达1012。蛋白质组学的基本点就是利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术正好能符合这种要求。例：将噬菌体展示cDNA文库制成蛋白点阵，成功的应用于寻找与过敏症有关的蛋白质。第37页,共44页，2024年2月25日，星期天

疾病的发生给我国水产养殖业带来了巨大的经济损失。而疾病防治技术的开发仍远远不能满足渔业发展的要求。

我国水产病害的防治目前主要以抗生素及各种消毒化学品为主。

寻找新的病害防治途径。三、噬菌体展示技术应用于水产养殖业

第38页,共44页，2024年2月25日，星期天5.展望九十年代末，生物技术、基因和蛋白质、生物信息和分子文库系统的发展，大大促进了新药发现的技术革命，其中噬菌体展示技术表现出独特的优越性，由此而发展出的一些新方法更是大大的扩展了新药的发现和利用范围。第39页,共44页，2024年2月25日，星期天

随着噬菌体展示技术在寻找新药道路上的不断成功，这种方法不仅限于人类医药的发现，也可以用于植物病虫害的防治，畜牧业病害的防治以及水