一种蜡状芽孢杆菌cpu0029菌株及用它制备石斛类生物碱的方法

一种蜡状芽孢杆菌cpu0029菌株及用它制备石斛类生物碱的方法专利名称：：一种蜡状芽孢杆菌cpu0029菌株及用它制备石斛类生物碱的方法技术领域：：本发明涉及微生物领域，具体是涉及一种石斛内生细菌(蜡状芽孢杆菌CPU0029菌株)，以及用该菌生产石斛类生物碱的方法。技术背景植物内生菌OPto加幼cfo/7te)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物,而被感染的宿主植物(至少是暂时)并不表现出外在病症。既包括互惠共利的和中性的内共生微生物,也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。近些年来,植物内生菌由于能够产生丰富多样的具有多种生物活性的次生代谢产物，在自然界中具有重要的生态学作用,受到了全世界的广泛关注并取得了极大进展。植物内生菌能够产生植物生长调节类物质，杀虫抗菌物质，抗肿瘤类物质，及其他类型的代谢产物，如一些内生真菌能产生细胞壁分解酶，用以克服宿主防御异物的天然屏障，还能产生果胶酶、纤维素酶、酯酶等胞外酶。由于内生菌和宿主植物的共生(或寄生)，其次生代谢产物往往有特殊的生物活性。人们发现有的内生菌能够产生与宿主(尤其是药用植物)相同或类似的化合物，如从南方红豆杉树皮中分离到的能够产生紫杉醇的内生真菌，从长春花、桃儿七等植株中分离到产长春新碱和鬼臼毒素类似物的内生真菌，从华重楼中分离到能够产生重楼甾体皂甙的内生细菌，在德国鸢尾根状茎中分离得到产鸢尾酮的丝状真菌等。这就为植物药物的生产提供了新的途径，并且对珍贵稀有药用植物的保护和开发有着积极作用。石斛(De"rfro&M附"oW/e""^)是中国传统中药，应用历史悠久。现代药理研究表明，石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用，因此在临床上及中药复方中被广泛应用。由于多年来的掠夺性采挖和无序开发，野生石斛已经濒临灭绝，寻找新的、可再生的石斛替代资源成为必然。发明内容本发明的目的是提供一株从新鲜石斛外植体中筛选分离得到内生菌，该菌能产生与石斛相同的有生物活性的次生代谢产物，本发明还提供了用该菌生产石斛生物碱的方》去。所说的石斛内生细菌，是蜡状芽孢杆菌(5ac说船^M泌)CPU0029，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M208020。所说的用蜡状芽孢杆菌CCTCCM208020生产石斛类生物碱的方法，包括以下步骤是(1)发酵培养以PDA培养基为种子培养基，改良PDA培养基为发酵培养基对蜡状芽孢杆菌CPU0029CCTCCM208020进行发酵；(2)分离纯化将发酵液上清碱化后过滤，经氯仿或乙酸乙酯萃取，回收有机溶剂得到浸膏。为了减少萃取时有机溶剂的用量，还可以在萃取前将滤液经过大孔树脂富集后，将洗脱液浓缩后再碱化。得到的浸膏产物还可再经硅胶柱层析进一步纯化。蜡状芽孢杆菌CPU0029CCTCCM208020能够利用多种有机碳源，如葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉等，但不能利用枸橼酸盐；该菌也能够利用多种有机氮源，如蛋白胨、酵母粉、玉米浆、牛肉膏等(除尿素外)，也可以利用含有机氮源和无机氮源的复合氮源，但不能利用单一的无机氮源，如硫酸铵、亚硝酸钠、硝酸铵等。该菌的培养温度范围宽，在10—40'C均能生长，但在25—37'C生长较好，生产次生代谢产物的最佳温度为28—3(TC。同时各种金属离子，如Mg2、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、K+、Na+等对该菌生长没有显著影响。虽然上述碳源、氮源、金属离子以及温度对该菌的生长没有明显影响，但是其碳氮源浓度、金属离子和培养温度对该菌发酵生产次生代谢产物有显著影响。通过优化，确定最佳培养条件为去皮土豆20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.25%，硫酸铵0.25%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，氯化锰0.01%，起始pH6.5，培养温度28—30°C。在上述用蜡状芽孢杆菌CCTCCM208020生产石斛类生物碱的方法中，其步骤(1)培养条件为以液体马铃薯培养基(PDA培养基)为种子培养基，3CTC培养蜡状芽孢杆菌CCTCCM20802012小时后；按照5—10%比例接种发酵液，在发酵培养基(改良PDA培养基)中28。C培养48—60小时后终止发酵；所说的发酵培养基是去皮土豆20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.25%，硫酸铵0.25%，磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%，氯化锰0.01%;pH6.5-7.0，于115。C灭菌30分钟。所说的步骤(2)具体是将发酵液离心后取上清液，用氨水碱化至pH7—ll后过滤除去沉淀，滤液经过大孔树脂吸附后，再用60—90%乙醇洗脱；将洗脱液减压蒸馏浓縮后用氨水碱化，再用氯仿或乙酸乙酯萃取，回收氯仿或乙醚后得到浸膏。所说的蜡状芽孢杆菌CCTCCM208020通过以下方法得到A.对新鲜石斛假鳞茎或叶片进行表面消毒后，进行切片或研磨，再将植物组织或研磨液至于固体马铃薯培养基培养2—5天。B.将长出的菌落逐个分离、纯化。C.对每个微生物进行培养，用氯仿对发酵液及破碎细胞中的生物碱进行提取。D.用薄层层析法对各提取物进行检测，并与石斛总生物碱进行比较。'E.经过分离、筛选和检测，得到CPU0029，其产生的生物碱与石斛总生物碱中的一个具有相同比移值。本发明的蜡状芽孢杆菌CPU0029已经于2008年1月26日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCCNO:M208020。本发明以石斛内生菌蜡状芽孢杆菌CCTCCM208020发酵生产石斛类生物碱可以在相当大的程度上缓解天然金钗石斛药源不足的问题。图l是发酵液粗提物与石斛总生物碱的TLC比较；其中1、空白液体马铃薯培养基；2、发酵液粗提物；3、石斛总生物碱。图2是初始pH的影响图3是培养温度的影响图4是接种量的影响图5是发酵时间的影响具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例一菌种的筛选及培养条件优化(l)菌种的筛选A.将新鲜石斛假鳞茎或叶片，用自来水洗净，无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干水分。常规无菌操作下，分别用75%乙醇和0.1%的升汞消毒；B.用无菌解剖刀将已表面消毒的石斛切块后，放入内置无菌玻璃珠的锥形瓶中，并加入少量无菌水，在无菌条件下珠磨30分钟；C.吸取少许上述研磨液涂布于PDA培养基平板上，在30'C培养2—5d。D.待平板有菌长出后，平板划线纯化，直至得到单菌落，用斜面保存备用。E.将菌株接种液体发酵培养基进行发酵，待发酵结束后对发酵液进行提取，用薄层层析发检测发酵产物(展开剂为正丁醇冰醋酸水=4:1:5的上层液，显色剂为改良碘化铋钾)。F.将石斛假鳞茎阴干，取2g剪碎后置于锥形瓶中，用氨水浸润30min，加入氯仿20ml，超声振荡提取2次(各20min);将氯仿层合并后用脱脂棉滤过，回收氯仿；再用lml氯仿溶解浸膏，即得石斛总生物碱，备用。G.共分离得到16个菌株，其中真菌2株，细菌14株。经TLC检测，有一株细菌的发酵液与石斛总生物碱有显色相同、迁移率相当的层析斑点，扫描结果见图1。石斛总生物碱有3个生物碱斑点，相对迁移率Rf分别为0.403、0.474和0.579;菌株的发酵液有1个生物碱斑点，相对迁移率Rf为0.474。该菌命名为CPU0029。(2)菌种的签定CPU0029属于革兰氏阳性大杆菌，宽度在lwm以上，呈链状排列在肉汤中生长混浊，有明显菌膜或壁环；在固体PDA培养基上生成的菌落不透明，灰白色，表面粗糙，微有褶皱，边缘毛玻璃状或融蜡状。生理生化试验见表1，经过形态观察和生理生化反应，该菌鉴定为芽胞杆菌属蜡状芽胞杆菌(fe"7/wscere,us)o表l生理生化试验tableseeoriginaldocumentpage5(3)CPU0029培养条件的优化培养方法将斜面培养物接种到液体马铃薯培养基在30。C培养12小时作为种子液，按5%体积转接30ml液体培养基后在3(TC空气摇床培养2天，转速180r/min;每个试验均做3个平行样品，最后结果取均值；液体发酵培养基中氮源的确定选用蛋白胨、亚硝酸钠、硫酸铵以及蛋白胨+硫酸铵(1:1),酵母粉+硫酸铵(1:1)为氮源，试验浓度为0.5%，其他组分同液体马铃薯培养基。从表2中可知，该菌以无机氮源为氮源不能生长；以复合氮源为氮源较有机氮源生物碱产量高，选择蛋白胨+硫酸铵(1:1)为氮源最佳。表2氮源的优化tableseeoriginaldocumentpage5液体发酵培养基中碳源的确定选用葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉为碳源，试验浓度为2%，氮源选择氮源优化后的最佳者，其他组分同液体马铃薯培养基；从表3中可知，该菌对碳源的利用相当广泛，从生物碱产量的角度考虑选择葡萄糖最佳。表3碳源的优化碳源葡萄糖果糖蔗糖可溶性淀粉液体马铃薯培养基终点pH4.86.57.97.06.7^6200.7350.4520.3740.330.494液体发酵培养基中碳氮比的确定采用双因素三水平的正交试验，如表4,可知，氮源的浓度过高，不利于生物碱的产生，可能是因为营养丰富不利于次生代谢产物的积累，因此确定碳源、氮源的浓度分别为2%和0.5%。表4碳氮比的确定i1%碳源浓度2%3%氮源浓度0.5%0.3560.7420.6441%0.1210.2650.2942%0.0880.1380.167不同微量离子对生物碱产量的影响考虑到微量元素如Mg^、Mn2+、FeS+等的影响，经筛选后，分别考察了0.5%硫酸镁、0.1%氯化锰和0.1%氯化铁对生物碱产量的影响。从表5中可知，Mg^和Mn"+对生物碱的产量有显著影响，而Fe"影响不大，故确定添加MgS04和MnCl2，而不必添加Fe3、表5微量元素的影响微量元素无Mg"Mg2+Mn2+Fe3+Mg2+Mn2+Fe3+液体马铃薯培养基(对照)终点pH7.134.854.964.624.716.810.4560.7480.8750.470.8970.496其他发酵条件的优化培养基的初始pH初始pH分别选择7.5,7.0，6.5，6.0，5.5进行试验。从图2可知，初始pH对发酵最终pH和生物碱产量影响不大；初始pH为6.5时最佳。温度温度分别设为25'C、28°C、30°C、32°C、35。C进行试验。如图3可知，培养温度对发酵最终pH和生物碱产量均有显著影响；随着培养温度的提高，发酵最终pH由弱酸性上升至弱碱行，而生物碱的产量显著下降。因此培养温度选择28—3(TC为宜。接种量分别按2%、4%、6%、8%、10%的比例接种种子液后进行培养。从图4可知，随着接种量的提高，生物碱产量亦上升；但达至1』6%以后，生物碱产量提高不显著，故采用6%~8%的接种量。发酵时间在250ml的三角烧瓶中装入已经确定的最佳发酵培养基并接入菌种，进行培养，分别于不同生长阶段取样测定，从图5可知，延长稳定期有利于次生代谢产物的积累，进入衰亡期后，生物碱产量提高不显著，故培养时间确定为48小时左右。培养基的干扰将液体马铃薯培养基和改良液体马铃薯培养基分别按照上述相同方法提取后再用酸性染料法测得A62Q均小于0.002，可见培养基对生物碱含量的测定几无干扰。实施例二用蜡状芽孢杆菌CCTCCM208020生产石斛类生物碱(1)培养方法种子培养基液体马铃薯培养基发酵培养基去皮土豆20%，葡萄糖2%，酵母粉0.5%，磷酸二氢铵0.1%，硫酸镁0.05%，氯化锰0.01%，起始pH7.0，培养温度3(TC。种子液于3(TC培养12小时后，按照5—10%比例接种发酵液，在3(TC培养48—60小时后终止发酵。(2)次生代谢产物的分离纯化方法将发酵液离心后取上清液，用氨水碱化至pH7—11后过滤除去沉淀，滤液经过大孔树脂吸附后，再用60—90%乙醇洗脱；将洗脱液减压蒸馏浓缩后用氨水碱化，再用氯仿或乙酸乙酯萃取，回收氯仿或乙醚后得到浸膏。用少量氯仿溶解后经硅胶柱层析进行纯化。(3)次生代谢产物的特征签别A、发酵液的氯仿提取物(浸膏)用稀盐酸溶解，分别用碘化铋钾试剂、硅鸨酸试剂、輮酸试剂等生物碱试剂鉴别，结果如表6。表6化学鉴别生物碱试剂碘化铋钾试剂硅钨酸试剂鞣酸试剂现象红棕色沉淀白色沉淀灰白色沉淀B、发酵液的氯仿提取物(浸膏)经薄层层析(展开剂为正丁醇冰醋酸水=4:1:5，显色剂为改良碘化铋钾试剂)，与石斛总生物碱有显色相同、迁移率相当的层析斑点。石斛总生物碱有3个生物碱斑点，相对迁移率Rf分别为0.403、0.474和0.579;菌株的发酵液有1个生物碱斑点，相对迁移率Rf为0.474。可见，得到的产物为石斛类生物碱。实施例三-(1)培养方法.种子培养基液体马铃薯培养基发酵培养基去皮土豆20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.25%,硫酸铵0.25%,磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，氯化锰0.01%，起始pH6.5，培养温度28。C。种子液于3(TC培养12小时后，按照5—10%比例接种发酵液，在28。C培养48—60小时后终止发酵。(2)次生代谢产物的分离纯化方法将发酵液离心后取上清液，用氨水碱化至pH7—ll后离心出去沉淀，用氯仿或乙酸乙酯萃取，回收氯仿或乙醚后得到浸膏，再用少量氯仿溶解后经硅胶柱层析进行分离纯化。(3)次生代谢产物的特征签别与实施例二相同。实施例四(1)培养方法种子培养基液体马铃薯培养基发酵培养基去皮土豆20%，葡萄糖2%,酵母粉0.5%,磷酸二氢铵0.1%，硫酸镁0.05%，氯化锰0.01%，起始pH7.0，培养温度30。C。种子液于3(TC培养12小时后，按照5_10%比例接种发酵液，在30'C培养48—60小时后终止发酵。(2)次生代谢产物的分离纯化方法将发酵液离心后取上清液，用氨水碱化至pH7—ll后过滤，滤液经过大孔树脂吸附后，再用60一90%乙醇洗脱；将洗脱液减压蒸馏浓縮后用氨水碱化，再用氯仿或乙酸乙酯萃取，回收氯仿或乙醚后得到浸膏。用少量氯仿溶解后经硅胶柱层析进行纯化。(3)次生代谢产物的特征签别与实施例二相同。实施例五(1)培养方法种子培养基液体马铃蓽培养基发酵培养基去皮土豆20%,葡萄糖2%,蛋白胨0.25%，硫酸铵0.25%，磷酸二氛钾0.1%,硫酸镁0.05%,氯化锰0.01%,起始pH6.5，培养温度28X:。种子液于3(TC培养12小时后，按照5—10%比例接种发酵液，在2S"C培养48—60小时后终止发酵。(2)次生代谢产物的分离纯化方法将发酵液离心后去菌体，取上清液用氨水碱化至pH8—ll离心去沉淀，上清液用氯仿或乙酸乙酯萃取，回收氯仿或乙醚后得到浸裔。用少量氯仿溶解后经硅胶柱层析进行纯化。(3)次生代谢产物的特征签别与实施例二相同。本发明所说的蜡状芽胞杆菌(5s""uscereus)CPU0029,已于2008年1月26日，提交位于中国武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCCNO:M208020。权利要求1、一种蜡状芽孢杆菌CPU0029(CCTCCM208020)，其具有产生石斛类生物碱的能力。2、一种发酵生产石斛类生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)发酵培养以PDA培养基为种子培养基，改良PDA培养基为发酵培养基对蜡状芽孢杆菌CPU0029CCTCCM208020进行发酵；(2)分离纯化将发酵液上清碱化后过滤，经氯仿或乙酸乙酯萃取，回收有机溶剂得到浸膏。3、根据权利要求2所说的生产石斛类生物碱的方法，其特征在于，步骤(1)中所说的改良PDA培养基是去皮土