大熊猫基因资源库构建技术规程征求意见稿

ICS65.020.99CCSB65DB51Technicalspecificationofgeneticresourcebankconstructionforgiantpanda四川省市场监督管理局发布IDBXX/XXXXX—XXXX 2规范性引用文件 3术语和定义 4基本要求 5大熊猫组织库构建技术 6大熊猫精子库构建技术 7大熊猫细胞库构建技术 附录A（规范性附录）器具清洗和消毒 5附录B（资料性附录）大熊猫精液与细胞资源保存相关试剂配制 6附录C（规范性附录）大熊猫资源保存登记表 7DBXX/XXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省林业和草原局提出、归口并负责解释。本文件起草单位：成都大熊猫繁育研究基地。本文件主要起草人：侯蓉、刘玉良、安俊辉、王东辉、陈依娇、陈佳松、蔡志刚、王海瑞、李媛。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：——本次为首次发布。1DBXX/XXXXX—XXXX大熊猫基因资源库构建技术规程本标准规定了大熊猫基因资源库构建的技术方法。本标准适用于大熊猫组织、精液、体细胞（皮肤成纤维细胞、精液与乳汁来源细胞）与成体干细胞（脐带与骨间充质干细胞）的采集与保存。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4143-2008牛冷冻精液GB20557-2006山羊冷冻精液GB/T31582-2015牛性控冷冻精液GB/T24863-2010畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程GB/T40365-2021细胞无菌检测通则3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1大熊猫基因资源库giantpandageneresourcebank以组织与细胞资源为载体保存大熊猫基因资源，为大熊猫种群可持续性发展提供保障，包括了大熊猫组织库、精子库以及细胞库。3.2大熊猫组织资源giantpandatissueresource在大熊猫死亡后，可获得的各种脏器组织资源，如肌肉组织、肝脏组织等。3.3大熊猫细胞资源giantpandacellresource指可从大熊猫体液或组织中分离得到的细胞资源，如精子、体细胞及间充质干细胞等。3.4电刺激采精electricejaculation通过微电流直肠电刺激，获得大熊猫精液的方法。3.5细胞分离cellseparation通过物理或化学的方法，富集大熊猫体液中的细胞或将组织解离成单个分散的细胞。3.6细胞培养cellculture2DBXX/XXXXX—XXXX将细胞在模拟体内生存环境中培养，使其在体外增殖并维持结构和功能的一种方法。3.7冷冻保存cryopreservation将组织、精液或细胞经过特殊处理后，在超低温的环境中长期保存的方法。4基本要求4.1器具的清洁与消毒所有器具在使用前需要进行清洁与消毒处理，具体方法见附录A。4.2细胞分离培养工作区条件工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成，需满足GB/T24863-2010中对于工作区条件的要求。5大熊猫组织库构建技术5.1组织采集大熊猫死亡后，获取其各类脏器组织，在RNase-free的4°C生理盐水中迅速漂洗样本，去除血渍和污物。5.2组织冷冻将组织切成0.2~0.5cm3大小的组织块，装入到组织冷冻管中，迅速投入液氮冷冻。填写大熊猫组织资源保存登记表（见附录C.1），记录采样时间、呼名、谱系号、样品编号、组织类型、采样量、保存位置。6大熊猫精子库构建技术6.1精液采精选在安静无打扰的兽舍麻醉大熊猫。麻醉后用37°C的生理盐水清洗阴茎，电极棒加涂石蜡油，插入直肠并确保电极区抵住直肠上壁。调节采精仪，电压2~6V，持续2秒后间歇性休息2秒，出现射精立刻停止刺激，将精液收集到采精杯中。6.2精液评估精液采集后，对其外观、体积、pH值、密度、活力及精子畸形率进行检测，并填写大熊猫精液资源保存登记表（见附录C.2）。a)外观：对精液的颜色及气味等一般性状进行常规检查。b)体积：用1.0mL刻度吸管准确吸取精液体积（参考GB/T31582-2015）。c)pH值：取2μL精液滴加在pH试纸上，参照比色卡读取精液pH值。型），在200×相差显微镜下计数。精子密度的计算公式为：密度=A×107，其中：A为5个中方格内精子总数（参考GB20557-2006）。3DBXX/XXXXX—XXXXe)活力：取5μL~10μL精液于载玻片上，加盖盖玻片后在37°C恒温装置的相差显微镜上观察（参考GB4143-2008）。f)畸形率：取2μL精液用398μL0.3%戊二醛固定，在200×相差显微镜下统计畸形精子（包括头部畸形、颈部和中段畸形、主段畸形和过多的胞浆残余体）的比率。6.3精液冷冻a)稀释：稀释液采用37°C水浴精液冷冻液（配方见附录B.1），按1:2（v\v）进行精液稀释（按b)平衡：将稀释后的精液置于4°C冰箱中平衡4小时。c)装管：采用0.25mL细管进行灌装并封口，管上提前打印谱系号及采精日期。d)冷冻：采用两步法进行精液冷冻。第1步：将细管放置在距离液氮面约7.5cm处1分钟；第2步：将细管放置在距离液氮面约2.5cm处1分钟，将细管投入液氮。e)登记：对照大熊猫精液资源保存登记表（见附录C.2）进行准确填写，对入库细管的数量、冷冻日期以及存放位置进行登记。6.4精液解冻将冻精细管放于50°C水浴加热10秒，剪去细管封口端，用移液枪将精液吹入离心管中，加入精液解冻液（配方见附录B.2）。填写大熊猫精液资源保存登记表（见附录C.2），对出库细管的数量，出库时间，用途进行登记。7大熊猫细胞库构建技术7.1样本采集按下列要求采集样本并填写大熊猫细胞资源保存登记表（附录C.3），对于每只大熊猫个体应至少保存1种下列细胞类型。a)乳汁：采集哺乳期1-7天大熊猫乳汁，需要量为0.3~0.5mL。b)精液：采集方法同6.1，需要量为0.2~0.5mL。c)脐带：在幼仔出生时，采集大熊猫脐带组织。d)皮肤：在大熊猫自然死亡后采集皮肤组织，大小约为2~3cm2。e)骨：在大熊猫自然死亡后采集胫骨或股骨。7.2样本运输样品均放置于4°C含有500U/mL的青霉素和500μg/mL的链霉素的PBS中，迅速运往实验室。活体样本从样本采集到细胞分离不应超过6小时；死亡个体样本从个体死亡到细胞法分离不应超过48小时。7.3细胞分离a)乳汁：4°C，600g离心10分钟收集细胞。用含有500U/mL的青霉素和500μg/mL的链霉素的PBS清洗细胞三次。4°C，600g离心10分钟收集细胞。b)精液：600g离心10分钟，弃掉精清；用含有500U/mL的青霉素和500μg/mL的链霉素的PBS清洗细胞三次，600g离心10分钟收集细胞。4DBXX/XXXXX—XXXXc)脐带：将收集的脐带样本清洗干净剪碎，37°C下先后用1mg/mlIV型胶原酶与0.25%胰蛋白酶进行消化10~15min，600g离心5分钟收集细胞。d)皮肤：将组织样品剪碎，先后用1mg/mlI型胶原酶与0.25%胰蛋白酶进行消化30~45min，600g离心5分钟收集细胞。e)骨：敲开骨两端，使用注射器吸取30mL完全培养基（配方见附录B.3~B7）反复冲洗骨腔收集细胞，600g离心10分钟收集细胞。7.4细胞培养对于分离的细胞加入对应的完全培养基（配方见附录B.3~B7）重悬后接种于培养皿，放置于37°C、5%CO2的培养箱中培养，记为原代细胞（P0）。当细胞汇合度达到70~90%时，进行细胞传代。弃去培养基，用PBS清洗2次，加入0.25%的胰蛋白酶消化2~5分钟并用胎牛血清终止消化。600g离心5分钟收集细胞后，继续使用对应的完全培养基培养，记为P1。7.5细胞冷冻a)细胞计数与活率检测：细胞消化、离心后用2mL完全培养基重悬，取10μL细胞悬液与10μL0.4%的台盼蓝溶液混合，加入血球计数池，待细胞沉入血球计数板底面，在200×相差显微镜下计数。计数方法同6.2d，分别统计细胞总数与细胞活率（未着色细胞的比率）。b)菌检：对细胞中可能携带的细菌、真菌、病毒以及支原体进行检测，参考GB/T40365-2021中的要求执行。c)细胞冷冻：用冻存液重悬并调整细胞浓度至1×106/mL，按0.5ml/管分装至1.5mL规格细胞冻存管中，将待冷冻的细胞转入梯度降温盒中，-80°C冰箱过夜后转入液氮进行长期保存。细胞冻存管在使用前需对大熊猫谱系号、细胞类型及冻存日期进行标注。对于每个样本需要至少保存5支种子细胞，代次需在P1~P3，冻前活率不低于90%。d)登记：填写大熊猫细胞资源保存登记表（附录C.3），对大熊猫呼名、谱系号、细胞类型、细胞数量及冻存日期进行登记，登记表与冻存管的信息应保持一致。7.6细胞复苏从液氮中取出细胞，迅速放入37°C水浴锅中，快速摇动，使管内液体融化。吸取液体置于10mL的完全培养基中，600g离心10分钟后接种培养。填写大熊猫细胞资源保存登记表（附录C.3），对出库种子细胞的数量及时间进行登记。5DBXX/XXXXX—XXXX（规范性附录）器具清洗和消毒A.1玻璃器皿A.1.1使用的玻璃器皿用自来水冲洗后放入5%稀盐酸中浸泡12小时，取出后立即用自来水冲洗；用蒸馏水冲洗，直至器皿光亮、无水滴附着为止。洗净的玻璃器皿用牛皮纸封口后进行湿热灭菌（120°C，20分钟）。A.1.2使用过的玻璃器皿用自来水冲洗，再用手工或超声波清洗器在加有洗涤剂的温热水中进行刷拭。洗净的玻璃器皿用牛皮纸封口后进行湿热灭菌（120°C，20分钟）。A.2毛巾及纱布清洁后进行湿热灭菌（120°C，20分钟），干燥后待用。A.3塑料制品未灭菌的枪头、离心管在使用之前应进行湿热灭菌（120°C，20分钟），干燥后待用。A.4其他制品金属镊子、剪刀、止血钳在使用之前应进行湿热灭菌（120°C，20分钟）。胶塞和吸管胶头等用75%酒精擦拭消毒，待酒精挥发尽后方能使用。细管、冷冻架使用前用紫外线消毒30分钟。6DBXX/XXXXX—XXXX（资料性附录）大熊猫精液与细胞资源保存相关试剂配制B.1精液冷冻液蔗糖所占比例为12%，卵黄20%，甘油5%，抗生素：青霉素、链霉素各10万IU。冷冻液与鲜精混合稀释，最终冷冻精液中的甘油终浓度为3.33%。B.2精液解冻液Ham’sF-10+5%胎牛血清+1%青霉素/链霉素（10,000IU青霉素，10mg/mL链霉素）+1%丙酮酸钠（100mM）B.3乳汁来源细胞完全培养基低糖DMEM培养基+10%的胎牛血清FBS+100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。B.4精液来源细胞完全培养基高糖DMEM培养基+10%的胎牛血清+100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。B.5脐带间充质干细胞完全培养基低糖DMEM培养基+10%的胎牛血清FBS+100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素+10ng/mL的bFGF。B.6皮肤细胞完全培养基高糖DMEM培养基+10%的胎牛血清+100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。B.7骨间充质干细胞完全培养基低糖DMEM培养基+10%的胎牛血清FBS+100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素+10ng/m