马尔堡病检测方法

本标准规定了马尔堡病检测方法。本标准适用于马尔堡病抗体水平的检测。2缩略语下列缩略语适用于本标准。ELISA酶联免疫吸附试验。IF免疫荧光试验。MBG马尔堡病。PBS磷酸盐缓冲液。TCID₂半数细胞感染量。CPE细胞病变效应。将感染MBG病毒的细胞固定在带面的载玻片上，在特异性抗体存在时，利用抗原抗体反应具有高度特异性这一特点，再加上荧光色素标记的二抗，与结合在抗原上的抗体结合，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。将抗原包被在酶标板上，在特异性抗体存在时，抗原抗体结合，再加入酶标二抗，形成抗原抗体酶标二抗复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时，催化底物分解，产生有色物质。根据有色物质的有无及其浓度，间接推测抗体是否存在以及其效价。4试剂和材料试剂和材料的准备如下：—MBG病毒：由指定单位提供；—包被用重组核蛋白抗原；由指定单位提供；—阴，阳性血清；由指定单位提供；——细胞抗原片；由指定单位提供或自制；2——被检血清：用真空管采集血液，无菌分离血清，-20℃保存。用前60℃灭活1h;—酶标二抗：由指定单位提供；——底物溶液：由指定单位提供；——荧光素标记二抗：由指定单位提供；——细胞背养液、维持液、细胞分散液、包被液、洗涤液、稻释液、终止液、PBS的配剖见附录A。5器械和设备器械和设备的准备如下：——荧光显微镜；——酶标仪；——96孔酶标板；——带圈载玻片；——单道和多道可调微量移液器20pL～200pL;——倒置显微镜；6操作方法6.1.1细胞抗原片的制备将Vero细胞培养成单层，用无菌PBS洗一遍，接种10*TCIDg/0.05mL～10TCIDa/0.05mL量的MBG病毒，6d后，20%～40%感染细胞出现CPE,例掉液体，用细胞分散液漂洗一次，加入细胞分散液，37℃作用3min~5min,待细胞开始脱落前将分散液倒掉，(150mL细胞瓶)加入10mL.PBS(含5%犊牛血清，防止细胞成团),用吸管用力吹打。取5mL细胞悬液加到直径10cm的平皿内，紫外线照射20min灭活病毒，将细胞悬液稀释成1.2×10°个细胞/mL,在带圈载玻片上每孔加0.015mL,保证大多数细胞未感染，少部分细胞为带毒细胞。将载玻片空气干燥后，丙酮固定10min,放在塑料袋内，Co照射(200000rnds),以消除病毒的传染性，后保存于一70℃备用，以上步骤必须在生物安全N级实验室内进行，6.1.2正式试验取出细胞抗原片，温至常温。将持检血清和阴，阳性血清用PBS作1:2、1:4、1:8等倍比稀释，加到细胞抗原片上，每个稻释度的血清加两孔，量以不溢出为宜，置湿盒内，37℃感作30min,取出用PBS冲洗三遍，加用PBS作(1:10)～(1:50)稀释的荧光素标记二抗(内含伊文斯兰1:1000),置湿盒内，37℃感作30min,取出用PBS冲洗三遍，空气干燥后，用pH9,0的碳酸缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。按照提供的重组核蛋白抗原所附说明书要求，用包被液将抗原稻释，包被96孔板，每孔100pL,置4℃冰箱过夜，6.2.2血清稀释将待检血清和阴，阳性血清用稀释液作11400至116400的倍比稀释。取出96孔板，用洗涤液洗涤三次，每孔加100μL稀释血清，每个稀释度的血清加两孔，37℃感作倒掉血清，用洗涤液洗涤三次，每次5min。6.2.5加酶标二抗用稀释液将酶标二抗按说明书要求稀释，加到96孔板内，每孔100μL,37℃感作1h,倒掉酶标二抗，用洗涤液洗涤三次，每次5min。每孔加100pL底物溶液，酶标板置暗盒内15min。6.2.8加终止液取出酶标板，每孔加50pL终止液。用酶标仪在410nm下测定每孔光密度值。7结果判定当阴性血清孔细胞内无绿色黄光，所有细胞呈红色，阳性血清孔感染细胞的胸浆内出现特异性绿色荧光，其他未感染细胞呈红色时，可以判定结果。待检血清114以上稀释度，胞浆内有特异性绿色荧光者判为阳性。血清校正OD值一测得OD值-无抗原孔OD值判定值-阴性样品校正OD值+3倍标准差待检血清1:400以上稀释度的校正OD值高于判定值的判为阳性，反之为阴性。(规范性附录)A.1细胞营养液按说明书要求配制E-MEM培养基，抽滤除菌，加10%健康胎牛血清、青霉素200IU/mL,链霉素A.2细胞维持液同细胞营养液，只是健康犊牛血清加2%。A.3细胞分散液(10倍浓缩液)氯化钠40.0F氯化钾2.0g葡萄糖5.01碳酸氨钠2.9r乙二胺四乙戬二钠1.0g以上成分依次溶于450mL二级水中，然后加入1%酚红1mL,加二级水至500mL,抽滤除菌，分装后—20℃保存。临用时用除菌二级水稀释。0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液碳酸氧钠1.46R碳酸钠0.97g二级水500ml,本标准指0.01mol/LpH7.4PBS氯化钠4.0g磷酸二氢钾0.1g十二水磷酸氧二钠1.45g氯化钾0.1g二级水500ml.A.6洗涤液0.01mol/LpH7.4PBSPBS5