DB37T 4711-2024 海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测技术规程

ICS07.080CCSZ06ICS07.080CCSZ06山 东 省 地 方 标 准DB37/T4711—2024DNA技术规程CodeofpracticeformonitoringmitochondrialDNAgeneticdiversityofmarineanimalresources2024-04-11发布 2024-05-11实施山东省场监理局 发布DB37/T4711DB37/T4711—2024II目 次前言 II112范引文件 13语定义 14测序 15测案计 26品集保与输 26.1采地点 26.2采数及法 26.3采记录 36.4样保与输 37品测 37.1方原理 3DNA提取 3DNA质检测 37.4引选择 3DNA扩增 4PCR产回、与序测定 48量制 49据析 410测告 4附录A（料）样采集录 5附录B（料）设与试剂 6B.1仪设与材 6B.2试及配制 6附录C（料）酚仿法取DNA 7附录D（料）琼糖凝电泳 8附录E（料）PCR增反体系 9附录F（料）检记录 10参考献 11DB37/T4711DB37/T4711—2024IIII前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由山东省海洋标准化技术委员会归口。DB37/T4711DB37/T4711—2024PAGEPAGE10海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测技术规程范围本文件确立了海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测程序，规定了监测方案设计、样品采集、保存与运输、样品检测、质量控制、监测报告等技术要求，描述了数据分析方法。本文件适用于海洋动物资源的遗传多样性监测。（GB/T12763.6海洋调查规范第6部分：海洋生物调查GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法下列术语和定义适用于本文件。3.1遗传样性 geneticdiversity种内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和。海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测程序包括监测方案设计、样品采集、保存与运输、样品检测、质量控制、数据分析、监测报告，程序见图1。图1 监测序图101采样地点可根据调查需求选择：GB/T12763.6GB/T18654.2300.5g；视监测生物的具体情况，无菌操作剪取部分鱼类鳍条组织约0.1g，0.5mL；0.1mL采集的每批样品分别填写样品采集记录，格式参见附录A。4～1024h10cm310（95）（polymerasechain（deoxyribonucleicDNAD-loopI（CytochromeoxidaseI，COI）DNA0.1DNADNADNACDNADNA提取的DNA用洗脱液或灭菌双蒸水溶解，取5μL经1%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA质量，电泳方法参DNA50ng/μLDNA20DNA2～3Tm值50～6018bp～24bpG+C40%～60PCRbp～600bpDNA用合成的引物对样品进行预实验。按每对引物的Tm值设定退火温度，按7.5.2进行PCR。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，选择PCR产物条带单一、清晰、且长度与预期一致的引物，作为该物种的遗传多样性监测引物。DNAPCR。PCR945min；9430s，X30s（XTm），7230s～60s，357210min，4PCR对所有样品进行扩增后，PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，选择单一、清晰、且长度与预期一致的条带，回收纯化目的片段后测序，或PCR产物直接双向测序。每批PCRDNA琼脂糖凝胶电泳时，每排样品中至少要同时加一个合适的DNA分子量梯度标准品。（MaximumComposite（、）F附录A（）海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测采样记录见表A.1。表A.1样品采集记录表种名样品编号样品数量样品规格采样时间样品捕捞海域采样方式现场调查采样：地笼；非现场调查采样采样地点经度：纬度：码头/市场样品组织整体；肌肉；血液；鳍条；其他：样品外观鲜活；新鲜；变质保存方式活体；冷冻；冰鲜；常温；其他：备注采样人：复核人：附录B（资料性）设备与试剂仪器设备与耗材应符合以下要求：0.001g；12000r/min；1000μL200μL、100μL10μL、2.5μL；PCR1.5mL、0.2mL；：1000μL、200μL、10μLK（20mg/mL）；20g1000mLTE（Tris-HCl1mol/L，EDTA0.5mol/L，pH=8.0），c) 乙醇：75%、95Taq（dNTPs）；PCRDNA6×Tris（pH=8.0）；TBETris108g，EDTA-Na27.44g55g，1000mL附录C（资料性）酚-氯仿法提取DNA1.5mL100mgCTAB600μL、蛋白酶K（20553h375001000rpm5500μLB.250030000rpm5400μL2202012000rpm5min75500μL，12000rpm3minB.712000rpm200μL15min～30min100μL附录D（）1×TBE1%～1.51:10000（5μLDNA，1μL6DNA0.5×TBE，100V～120V30min254nm附录E（）PCRPCR扩增反应体系配方见表E.1.表E.1PCR体系配方表DNA模板50ng～100ng10倍扩增缓冲液2.5μLMgCl2(25mmol/L)2.0μLdNTP(10mmol/L)0.5μL引物f(50pmol/μL)0.5μLr(50pmol/μL)0.5μLTaq酶(5U/μL)0.2μL加无菌超纯水配制成25μL的反应体系附录F（海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性检测记录见表F.1。表F.1检测记录表样品名称样品编号样品数量引物序列目的序列长度（bp）单倍型1DNA序列群体间遗传距离d’群体间平均遗传距离d’群体内个体间遗传距离d～群体内平均遗传距离d单倍型数H单倍型多样性Hdk核苷酸