基因克隆的酶学基础

关于基因克隆的酶学基础第四章分子克隆的酶学基础

基因的重组与分离，涉及到一系列相互关联的酶促反应。特别是核酸限制性内切酶和DNA连接酶的发现和应用，使DNA分子的体外连接与切割成为可能。核酸限制性内切酶和DNA连接酶是重组DNA技术赖以创立的重要酶学基础。第2页,共107页，2024年2月25日，星期天重组DNA实验中常使用的酶II型核酸内切限制酶DNA连接酶大肠杆菌DNA聚合酶反转录酶多核苷酸激酶末端转移酶核酸外切酶IIIλ核酸外切酶碱性磷酸酶S1核酸酶Bal31核酸酶TaqDNA聚合酶第3页,共107页，2024年2月25日，星期天DNA的一级结构DNA的二维结构第4页,共107页，2024年2月25日，星期天核酸酶通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase)

；特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶（DNase）。从核酸分子末端开始,一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链,称为核酸外切酶（exonuclease）；从核酸内部切割磷酸二酯键使之断裂为小片段的为核酸内切酶（endonuclease）。

第5页,共107页，2024年2月25日，星期天第6页,共107页，2024年2月25日，星期天第一节、核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割寄主控制的限制与修饰现象(R/M)修饰的甲基转移酶核酸内切限制酶EcoBEcoK（Restrictionandmodification）

第7页,共107页，2024年2月25日，星期天E.coli菌株λ噬菌体感染率

K

B

CE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA第8页,共107页，2024年2月25日，星期天GAATTCCTTAAGEcoRIMEcoRI限制作用修饰作用G3’5’AATTCCTTAA5’3’GGAATTCCTTAAGMeMeMeEcoRI核酸内切限制酶EcoRI及其修饰的甲基化酶MEcoR的限制与修饰作用第9页,共107页，2024年2月25日，星期天第10页,共107页，2024年2月25日，星期天第11页,共107页，2024年2月25日，星期天寄主的限制与修饰的作用保护自身的DNA不受限制;破坏外源DNA,使之迅速降解第12页,共107页，2024年2月25日，星期天2.限制酶的发现60年代提出了限制性内切酶和限制酶的概念1968年，首次从E.coliK中分离到限制酶

有特定的识别位点但没有特定的切割位点，切割位点离识别位点达1000bp以上。1970年，美国约翰·霍布金斯大学的H.Smith找到HindⅡ限制性内切酶。2006年2月为止共发现3773种限制酶,810种甲基化酶第13页,共107页，2024年2月25日，星期天核酸内切限制酶

(restrictionendonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶第14页,共107页，2024年2月25日，星期天3.核酸内切限制酶的类型特性I型酶II型酶III型酶蛋白质结构3种亚基单一成分2种不同亚基辅助因子ATP,Mg2+,S-MetMg2+ATP,Mg2+,S-Met序列特异切割不是是是切割位点距识别序列1kb处随机切割识别序列内或附近距识别距离下游24-26bp处克隆中的作用无用十分有用用处不大第15页,共107页，2024年2月25日，星期天4.II型核酸内切限制酶的基本特性在特异识别序列切割DNA分子；两个单链切割部位在DNA分子上的分布,通常不直接相对；断片往往具有互补的单链延伸末端。(1)基本特性第16页,共107页，2024年2月25日，星期天识别序列4-8个核苷酸序列①大部分呈旋转对称、反向重复结构—回文结构C-C-G-C-G-GG-G-C-G-C-C对称轴切割位点切割位点第17页,共107页，2024年2月25日，星期天

ABCC΄B΄A΄ABB΄A΄

A΄B΄C΄CBAA΄B΄AB②

部分识别序列不对称:AccBSⅠ:CCG↓CTC

GGC↑GAGBssSⅠ:C↓TCGTG

GAGCA↑C③有一些限制酶可识别多种序列AccIGTMKAC(M:A或C)HindIIGTYRAC(Y:C或R:A或G)第18页,共107页，2024年2月25日，星期天识别位点在DNA分子中的频率假定核苷酸随机排列的情况下进行

实践中:如λDNA长49kb，对于六碱基的酶应该有12个切割位点，实际上要少一些，如BglII只有6个，BamHI只有5个，而SalI只有2个。44=25646=4096第19页,共107页，2024年2月25日，星期天基因组中碱基对的排列是非均匀的，尽管有的酶切序列中GC含量相同，但在基因组中出现的机率还是不一样。

在

E.coli中AsoⅠ（GGCGCGCC）20kbNotⅠ（GCGGCCGC）200kb（常利用它出现的机会少来构建图谱）

EcoRⅠ和HindⅢ5kbSpeⅠ（ACTAGT）60kb第20页,共107页，2024年2月25日，星期天细菌基因组（Bacteriagenome)大多数富含A+T的细菌中，CCC和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的几率就非常少。酵母基因组（Yeastgenome)G+C含量38%，在重复序列之外，富含G+C的识别序列就特别少。哺乳动物中含CG序列的酶切位点稀少，大多CG序列是甲基化的第21页,共107页，2024年2月25日，星期天(2)、限制性内切酶产生的末端粘性末端Cohesiveends(Machedends)

5‘粘性末端,3’突出末端平末端Bluntends非对称突出端第22页,共107页，2024年2月25日，星期天①粘性末端Cohesiveends(Machedends)

DNA分子在限制性内切酶的作用下形成具有互补碱基的单链延伸末端结构,能够通过互补碱基的配对而重新连接起来.EcoRI切割位点5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’a.在对称轴的5’一侧切割底物，

DNA双链交错断开，形成5‘突出末端第23页,共107页，2024年2月25日，星期天EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘

…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘

…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘

…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘

…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPPOH第24页,共107页，2024年2月25日，星期天b.3’一侧切割形成3’突出末端5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’PstI切割位点第25页,共107页，2024年2月25日，星期天PstI等产生的3‘粘性末端5‘

G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G3’3‘

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5’PstI37

℃5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’

5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G

…3’3‘…

C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C

…5’OHPOHP第26页,共107页，2024年2月25日，星期天5’突出端易于通过DNA激酶和32pATP进行同位素标记3’突出端是末端转移酶的理想作用底物,在酶的作用下,容易使DNA片段带上多核苷酸尾第27页,共107页，2024年2月25日，星期天在对称轴上同时切割DNA的两条链5’-GC↓GGCCGC-3’3’-CG↓CCGGCG-5’平末端Bluntends第28页,共107页，2024年2月25日，星期天PvuII等产生的平头末端5‘

…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘

…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’5‘

…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘

…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

PvuII37℃第29页,共107页，2024年2月25日，星期天第30页,共107页，2024年2月25日，星期天

同裂酶（Isoschizomer):识别位点的序列相同的限制性内切酶

完全同裂酶:识别位点和切点完全相同：如MobI和Sau3AI识别序列切割位点为GATC

不完全同裂酶:识别位点相同，但切点不同如AatII(GACGT↓

C)ZraI(GAC↓

GTC)同尾酶(Isocaudiners):识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如

BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等EcoRⅠ

G↓AATTCMfeⅠ

C↓AATTCApoⅠR↓AATTYR:AorG;Y:CorT第31页,共107页，2024年2月25日，星期天具粘性末端的DNA片段结合方式

限制性片段末端连接作用a.具有EcoRI粘性末端的2条DNA片断之间的连接b.具有粘性末端的同一条片断的自我连接第32页,共107页，2024年2月25日，星期天属名头一个字母+种名头两个字母菌株名不同修饰体系系统名

Haemophilusinfluenzaed

嗜血流感杆菌d株

HindIII6.核酸内切限制酶的命名法第33页,共107页，2024年2月25日，星期天DNA片段（线性载体）检测末端长度对切割的影响时，同样发现识别序列的末端长度对酶切效率有明显影响，不同的酶对末端长度的要求是不同。因此设计PCR引物时，引入酶切位点时，在位点之外加上能够满足要求的碱基数目。双酶切多克隆位点时选择合适的酶切秩序第34页,共107页，2024年2月25日，星期天7、位点偏爱(sitepreference)某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱(1)现象：EcoRⅠ酶切割

噬菌体中的5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍；EcoRⅠ对腺病毒2（adenvirus-2）DNA不同位置切点的切割速率也不同。EcoRⅠ和HindⅢ在

噬菌体DNA中的切割速率分别有10倍和14倍的差异

噬菌体DNA有4个SacⅡ位点，三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快50倍第35页,共107页，2024年2月25日，星期天8.II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切酶切温度要求不同时,先低温切,后高温切第36页,共107页，2024年2月25日，星期天注意事项取少量酶最后加酶减少反应体积反应时间的延长分装（对于多个反应）第37页,共107页，2024年2月25日，星期天第38页,共107页，2024年2月25日，星期天9、影响酶活性的因素

(1)DNA的纯度:蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA,SDS、NaCl等提高对低纯度DNA酶切效率的方法:增加核酸内切酶的用量,1ugDNA/10u;扩大反应体积,稀释抑制因素延长酶切保温时间

第39页,共107页，2024年2月25日，星期天(2)甲基化程度:大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基

(3)缓冲液

pH,Mg2+,DTT,BSA,10(X)(4)酶切消化反应的温度大多数为37℃,少数25-30℃smalI(25℃);ApaI(30℃)(5)DNA的分子构型与切割

DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶来切割pBR322的超螺旋DNA。第40页,共107页，2024年2月25日，星期天(6)、酶的星星活性（staractivity)在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点

ApoⅠ、AseⅠ、BamHⅠ、BssH11、EcoRⅠ、EcoRV、HindⅢ、HinfⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、ScaⅠ、TaqⅠ和XmnⅠ等酶皆可表现出星星活性。第41页,共107页，2024年2月25日，星期天高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH等会使一核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象甘油浓度高（>5%）酶过量（>100U/

l）离子强度低（<25mM）

pH值过高（>8.0）有机溶剂如PMSD（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、sulphalane等等.

用其它二价阳离子如Mn++

、Cu++、Co++

或Zn++

代替了Mg++

。第42页,共107页，2024年2月25日，星期天10、酶切位点的引入（1）产生的5‘

突出端补平后，再连接可产生新的酶切位点（2）同尾末端的连接

不同的同尾酶切割DNA产生的末端再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点消失

BamHⅠ（G↓GATCC）+BclⅠ（T↓GATCA）

AlwⅠ（GGATC4/5）第43页,共107页，2024年2月25日，星期天（3）平末端的限制酶切割的DNA在连接后也可产生新的酶切位点PvuⅡ（CAGCTG）+EcoRV（GATATC）→

MobⅠ（GATC）第44页,共107页，2024年2月25日，星期天限制性核酸内切酶反应的终止65℃或80℃温浴20分钟加入EDTA（10mM)终止第45页,共107页，2024年2月25日，星期天第二节、DNA连接酶

催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基与5’磷酸之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来的酶。两种DNA连接酶大肠杆菌连接酶:是一种相对分子量为74000的蛋白质,催化时需NAD+做能量,只能连接粘性末端T4噬菌体连接酶:相对分子质量60000,需ATP做为能量来源,可连接粘性末端和平末端连接的条件:DNA3’端有游离的-OH,5’端有P;需要能量;必须是两条双链DNA.只封闭双螺旋DNA骨架上的缺口第46页,共107页，2024年2月25日，星期天1．T4DNA连接酶（T4DNAligase）

T4噬菌体感染大肠杆菌产生底物：粘端、切口、平端的RNA（但效率低）或DNA影响因素：低浓度的聚乙二醇PEG（一般为10%）和单价阳离子（150-200mMNaCl）可以提高平端连接速率。第47页,共107页，2024年2月25日，星期天2．E.coliDNA连接酶（E.coliDNAligase）与T4DNAligase活性相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）参与。平端连接效率低，常用于置换合成法合成cDNA不能将RNA连接到DNA，不连接RNA。

第48页,共107页，2024年2月25日，星期天3．TaqDNA连接酶在两个寡核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一DNA链形成杂交体，相当于连接dsDNA中的缺口作用在45℃～65℃需NAD+。可用于检测等位基因的变化在PCR扩增中引入寡核苷酸。它不可替代T4DNAligase。

第49页,共107页，2024年2月25日，星期天二、连接反应的机理ATP（NAD+)提供激活的AMPATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。AMP与连接酶的赖氨酸

-氨基相连AMP随后从连接酶的赖氨酸

-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上,形成“DNA-腺苷酸”复合物

3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP第50页,共107页，2024年2月25日，星期天第51页,共107页，2024年2月25日，星期天DNA连接酶第52页,共107页，2024年2月25日，星期天第53页,共107页，2024年2月25日，星期天四、影响连接反应的因素1反应温度

16℃反应，4小时；4℃反应，反应过夜2连接酶的浓度Weiss单位在37℃下20分钟催化1nmol32p从焦磷酸根置换到[

，

32P]ATP所需的酶量，定义为1个Weiss单位。NEB单位在20μl反应体系中于16℃，使

HindⅢ切过的

DNA（300μg/ml，0.12μM5‘

末端）在30分钟内连接50%所需的酶量为1个NEB单位。

1NEB=0.015Weiss1Weiss=67NEB

平末端连接反应的酶量大约是1-2个单位,粘性末端仅为0.1个单位,3ATP浓度4DNA片断末端自身环化的单体，线性二聚体或多聚体，分子间连接，重组质粒第54页,共107页，2024年2月25日，星期天插入片段与载体的浓度比例3-10：1；碱性磷酸酶处理载体目的片段的量的计算提高连接效率的方法第55页,共107页，2024年2月25日，星期天第三节、

DNA聚合酶（DNApolymeraseⅠ）和反转录酶

作用：在有模板，引物存在下，把脱氧核糖单核苷酸（dNTP）连续加到双链DNA分子引物链的3’-OH端，催化核苷酸的聚合作用。一基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶，

KlenowfragmentT7DNA聚合酶

T4DNA聚合酶修饰过的T7DNA聚合酶反转录酶第56页,共107页，2024年2月25日，星期天二、

DNA聚合酶的作用DNA聚合酶I与核酸杂交探针的置备；大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段与DNA末端标记；T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段；依赖于RNA的DNA聚合酶与互补DNA的合成；第57页,共107页，2024年2月25日，星期天（一）、

E.coliDNA聚合酶Ⅰ

1.基本活性①5‘--3’DNA聚合酶活性。底物：为单链DNA，引物（带3‘-OH基）或5‘

突出的双链DNA

。②5‘--3’外切核酸酶活性底物：双链DNA或DNA:RNA杂交体活性：从5‘

端降解双链DNA，也降解RNA:DNA中的RNA（RNaseH活性）

第58页,共107页，2024年2月25日，星期天③3‘--5’外切酶活性底物：带3'-OH的双链DNA或单链DNA活性：3‘-OH端降解DNA，可被5’--3‘

聚合活性封闭，也可被带5’

磷酸的dNMP所抑制。

在没有dNTP的情况下，外切活性占主导地位，而当存在足够的dNTP时，外切活性和合成活性将处在动态平衡中，结果使得双链DNA成为平末端。

第59页,共107页，2024年2月25日，星期天DNA聚合酶I聚合活性第60页,共107页，2024年2月25日，星期天DNA聚合酶I的5’-3’核酸外切酶活性第61页,共107页，2024年2月25日，星期天2．E.coliDNA聚合酶Ⅰ的用途切口平移法（nicktranslation）标记DNA所有DNA聚合酶中只有此酶有此反应

5’3’Mg2+,DNaseIdNTP,DNApolyI切口平移第62页,共107页，2024年2月25日，星期天探针标记双链DNA分子由DNaseI产生的单链缺口,带有3’OH末端大肠杆菌DNA聚合酶I的5’3’外切酶活性从缺口5’-P一侧移去一到数个核苷酸大肠杆菌DNA聚合酶I将32P标记的核苷酸掺入取代原先被删除的核苷酸重复进行©和(d),使缺口沿着5’3’方向移动.第63页,共107页，2024年2月25日，星期天（二）、KlenowDNA聚合酶

E.coliDNApolymeraseⅠlargefragment（Klenowfragment）

大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5‘--3’

外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3‘--5’

外切活性不受影响，分子量为76kDa。

第64页,共107页，2024年2月25日，星期天活性：与

E.coliDNA聚合酶Ⅰ的活性是一致的。但没有5‘--3’

外切活性作用：①补平3'凹端DNA。要加足够的dNTP②抹平DNA3'凸端。必须加足量dNTP③在cDNA克隆中合成第二链。④随机引物标记。

⑤应用于Sanger双脱氧链末端终止法的DNA测序（已经被T7DNA聚合酶取代）

第65页,共107页，2024年2月25日，星期天DNA分子末端标记第66页,共107页，2024年2月25日，星期天（三）、T4噬菌体DNA聚合酶（T4phageDNApolymerase）

来源于T4噬菌体感染的E.coli，分子量为114kDa活性：

与Klenow酶相似，但3‘--5’外切活性强200倍

5’—3’聚合活性第67页,共107页，2024年2月25日，星期天用途①用于补平或标记3‘凹端②取代合成（需高浓度dNTP一种)-末端标记③标记DNA片段

利用外切活性产生3‘凹端再补平第68页,共107页，2024年2月25日，星期天（四）、T7噬菌体DNA聚合酶（T7phageDNApolymerase）

来源于T7噬菌体感染的

E.coli，为两种紧密结合的蛋白质复合体，一种是噬菌体基因5蛋白，另一个是宿主蛋白的硫氧还蛋白。

聚合能力最强的DNA聚合酶；聚合过程中不形成二级结构；可进行单纯的延伸或取代合成的途径；在从5‘到3’方向的聚合过程中也有一定程度的3’5’核酸外切酶活性；将双链DNA5’或3’突出末端转变成平末端的结构。第69页,共107页，2024年2月25日，星期天活性：与T4噬菌体DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶类似，但3‘--5’

外切活性为Klenow的1000倍。用途：

T7噬菌体DNA聚合酶可替代T4的功能并可用于长模板的引物延伸。

第70页,共107页，2024年2月25日，星期天修饰的T7DNA聚合酶切除了99%以上的3‘--5’

外切活性（V1）完全除去V2用于测序反应第71页,共107页，2024年2月25日，星期天（五）、耐热DNA聚合酶

在高温下有DNA聚合活性，来自噬高温的细菌，主要用于PCR反应，如TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、

PwoDNA聚合酶和

TthDNA聚合酶等第72页,共107页，2024年2月25日，星期天（六）、反转录酶（Reversetranscriptase）

依赖于RNA的DNA聚合酶，也叫做RNA指导的DNA聚合酶或反转录酶。活性：有5‘--3’

合成DNA活性来自AMV（禽成髓细胞瘤病毒）或

Mo-MLV（鼠白血病病毒，又称M-MuLV）第73页,共107页，2024年2月25日，星期天

AMV反转录酶包含两条多肽链；

具5‘--3’DNA聚合活性很强的RNA酶H活性（降解与DNA杂交的RNA）在cDNA合成开始时，引物和mRNA模板杂交体可成为RNaseH的底物，此时，模板的降解和cDNA的合成相竞争；反应终止时，RNaseH可在正在增长的DNA链近3'端切割模板，趋向于抑制cDNA的产量并限制其长度。在42℃（鸡的正常体温）能有效发挥作用，能有效地拷贝较复杂的mRNA，但提纯过程中易被内切酶污染。

第74页,共107页，2024年2月25日，星期天

M-MuLV反转录酶是单链多肽，84kDa，其RNaseH活性弱，有利于合成较长cDNA。其基因工程产品纯度高。第75页,共107页，2024年2月25日，星期天2用途cDNA（complememtaryDNA)克隆5’突出DNA的补平和标记测序反应第76页,共107页，2024年2月25日，星期天3活性5’3’DNA聚合活性

RNAorDNA为模板及带3‘-OH的RNA或DNA引物RNaseH活性第77页,共107页，2024年2月25日，星期天反转录酶的5’-3’方向的DNA聚合酶I活性第78页,共107页，2024年2月25日，星期天反转录酶的5’-3’方向和3’-5’方向的核糖核酸外切酶活性（RnaseH)双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链第79页,共107页，2024年2月25日，星期天第四节、

DNA及RNA的修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾T4多核苷酸激酶与DNA分子5’末端的标记碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用第80页,共107页，2024年2月25日，星期天一、末端转移酶（terminaltransferase）来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3‘

羟基端。

T或C首选CO2+

；

A或G首选Mg2+

第81页,共107页，2024年2月25日，星期天TdT的基本特性5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HO

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

OH3‘

p5‘

第82页,共107页，2024年2月25日，星期天末端转移酶terminaltransferase（TdT)第83页,共107页，2024年2月25日，星期天1底物DNA可短至3个核苷酸，对3‘

羟基突出末端的底物作用效率最高低离子强度时，5‘

突出端或平端的DNA也可作为底物2用途在cDNA或载体3‘

末端加同聚尾用于克隆末端标记第84页,共107页，2024年2月25日，星期天同聚物加尾法再生HindIII识别位点第85页,共107页，2024年2月25日，星期天二、T4多核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase）

是一种磷酸化酶，可将ATP的

-磷酸基转移至DNA或RNA的5‘

末端。分子克隆应用中呈现两种反应：正反应：将ATP的

-磷酸基团转移到无磷酸的DNA5‘

端。

用于对缺乏5‘-磷酸的DNA进行磷酸化,催化5‘突出末端磷酸化速度比平末端或5’末端磷酸化速度快得多。交换反应：在过量ADP和

-32PATP存在的情况下，该激酶可将磷酸化的5‘

端磷酸转移给ADP，然后DNA从ATP中

-磷酸而重新磷酸化。

使用的ATP均为放射性同位素标记[

-

-32p]ATP，那么反应的产物都变成末端获得放射性标记的DNA。

第86页,共107页，2024年2月25日，星期天第87页,共107页，2024年2月25日，星期天T4多核苷酸激酶的交换活性第88页,共107页，2024年2月25日，星期天三、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）

主要来源于:牛小肠碱性磷酸酶（Calfintestinalalkalinephosphatase），简称CIP或CIAP细菌的碱性磷酸酶（Bacterialalkalinephosphatase,BAP）第89页,共107页，2024年2月25日，星期天作用催化除去DNA或RNA5‘

磷酸的反应用于防止DNA片段自身连接，或标记（5‘端）前除DNA或RNA5'磷酸第90页,共107页，2024年2月25日，星期天第91页,共107页，2024年2月25日，星期天第92页,共107页，2024年2月25日，星期天第四节

其它酶一、依赖于DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase）

SP6噬菌体RNA聚合酶（来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株）

T4或T7噬菌体RNA聚合酶（来源于噬菌体感染的大肠杆菌）。第93页,共107页，2024年2月25日，星期天1．活性

这些RNA聚合酶实际上为转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。它与DNA聚合酶不同，无需引物，但需识别特异性位点。2．用途

①体外合成RNA分子。

②用于表达外源基因。

第94页,共107页，2024年2月25日，星期天二、核酸外切酶

（nuclease）

单链外切核酸酶大肠杆菌外切核酸酶I和VII：两头降解，产生2-25bp寡核苷酸片段双链外切核酸酶大肠杆菌外切核酸酶III:双链DNA从3‘OH末端开始降解，释放5’单核苷酸从dsDNA3‘-OH逐一去除单核苷酸的反应，底物为dsDNA或线状和带切口或缺口的环状DNA，反应结果是在dsDNA上产生长长的单链区。该酶还有对无嘌呤DNA特异性内切核酸酶活性、RNaseH活性和3‘-磷酸酶活性（去磷酸）。不降解核酸内的磷酸二酯键，也不降解单链DNA及带3‘

突出的dsDNA。持续作用能力不强，产物为切割程度不相上下的群体，有利于分离长短不等的DNA。

第95页,共107页，2024年2月25日，星期天第96页,共107页，2024年2月25日，星期天三单链核酸内切酶1．BAL31核酸酶（BAL31nuclease）

来源于交替单胞菌（Alteromonasespejiana）BAL31主要活性为单链特异的核酸内切酶活性,从3’羟基末端迅速降解DNA

依赖Ca++,而且EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸）可抑制其活性。

双链的核酸外切酶活性：可从线性DNA两条链的两端迅速去除单核苷酸第97页,共107页，