流式细胞仪结果分析

流式细胞仪结果分析流式细胞仪结果分析第1页第一节概述一、工作原理二、散射光测定三、荧光测量四、细胞分选原理第二节数据显示与分析一、参数二、数据显示方式三、设门分析技术第三节流式细胞仪免疫分析技术要求一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常见荧光染料与标识染色三、免疫胶乳颗粒应用四、流式细胞免疫学技术质量控制流式细胞仪结果分析第2页第四节流式细胞术在免疫学检验中应用一、淋巴细胞及其亚群分析二、淋巴细胞功效分析三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型四、肿瘤耐药相关蛋白分析五、AIDS病检测中应用六、本身免疫性疾病相关HLA抗原分析七、移植免疫中应用思索题小结流式细胞仪结果分析第3页流式细胞术(flowcytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测伎俩一项能快速、准确对单个细胞理化特征进行多参数定量分析和分选新技术。流式细胞仪结果分析第4页流式细胞术最大特点是能在保持细胞及细胞器或微粒结构及功效不被破坏状态下，经过荧光探针帮助，从分子水平上获取各种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术特点流式细胞仪结果分析第5页

流式细胞仪是测量染色细胞标识物荧光强度细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来对细胞物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类搜集高技术。第一节概述流式细胞仪结果分析第6页流式细胞仪结果分析第7页细胞组成细胞功效大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测细胞特征流式细胞仪结果分析第8页采取激光作为激发光源，确保其含有更加好单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合标识技术，确保检测灵敏度和特异性；用计算机系统对流动单细胞悬液中单个细胞多个参数信号进行数据处理分析，确保了检测速度与统计分析准确性。一、工作原理流式细胞仪结果分析第9页（1）液流系统（2）光学系统（3）数据处理系统1.流式细胞仪基础结构：流式细胞仪结果分析第10页由样本和鞘液组成待测细胞 单个细胞悬液 荧光染料标识单抗对其染色受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测基质液。主要作用是包裹样本流周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，预防其靠近孔壁而阻塞喷孔。

（1）液流系统流式细胞仪结果分析第11页喷嘴FluorescencesignalsFocused

laserbeam鞘液液流系统示意图流式细胞仪结果分析第12页FCM液流系统（怎样形成单个细胞流）样本管鞘液管流式细胞仪结果分析第13页激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，经过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）（2）光学系统流式细胞仪结果分析第14页FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光学系统示意图流式细胞仪结果分析第15页主要由计算机及其软件组成（3）数据处理系统流式细胞仪结果分析第16页基础工作原理流式细胞仪结果分析第17页单细胞液柱已标识单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统搜集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基础过程流式细胞仪结果分析第18页区分流式细胞仪显微镜光源激光自然光、灯光对象细胞、生物粒子细胞、组织等承载工具鞘液及流动室载玻片检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT、放大电路目镜×物镜、光学放大统计计算机，>5000人工，200结果多参数，综合分析简单，单参数流式细胞仪与显微镜区分流式细胞仪结果分析第19页细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射光线信号，它强弱与细胞大小、形状、胞内颗粒折射等相关，主要分为前向散射光和侧向散射光。二、散射光测定流式细胞仪结果分析第20页流式细胞仪结果分析第21页

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射讯号用于检测细胞等粒子表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。流式细胞仪结果分析第22页FALSSensorLaser前向散射光示意图流式细胞仪结果分析第23页

侧向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射讯号，用于检测细胞内部结构属性。流式细胞仪结果分析第24页FALSSensor90LSSensorLaser侧向散射光示意图流式细胞仪结果分析第25页 测得FS与SS信号经过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类基础原理，但不能分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中判别出一些亚群

流式细胞仪结果分析第26页荧光信号由被检细胞上标识特异性荧光染料受激发后产生，发射荧光波长与激发光波长不一样。每种荧光染料会产生特定波长荧光和颜色，经过波长选择通透性滤片，可将不一样波长散射光和荧光信号区分开，送入不一样光电倍增管。选择不一样单抗及染料就可同时测定一个细胞上多个不一样特征。线性放大器和对数放大器三、荧光测量流式细胞仪结果分析第27页荧光染料特征激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)流式细胞仪结果分析第28页流式细胞仪结果分析第29页荧光赔偿流式细胞仪结果分析第30页经过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对含有某种特征细胞需深入培养和研究时进行。四、细胞分选原理流式细胞仪结果分析第31页细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞液滴弃去偏转落入搜集器压电晶体产生机械振动不充电充电（一）分选基础原理流式细胞仪结果分析第32页分选速度：单位时间内分选细胞数量。与悬液中细胞含量成正比。分选纯度：分选出目标细胞占全部收获细胞百分率。分选收获率：实际收获分选细胞与设定经过测量点分选细胞之间比率。与纯度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目标细胞总量，再经分选后得到目标细胞实际得率。与分选速度成反比。（二）分选技术要求流式细胞仪结果分析第33页参数：FS,SS,FL数据显示方式（单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图）设门分析技术第二节数据显示与分析流式细胞仪结果分析第34页FS：反应颗粒大小SS：反应颗粒内部结构复杂程度FL：反应颗粒被染上荧光数量多少一、参数流式细胞仪结果分析第35页单参数直方图双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图三参数直方图多参数分析直分析方图设门分析:REGION和GATE设置二、数据显示方式流式细胞仪结果分析第36页由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)组成，反应一样散射光或荧光强度颗粒数量多少。（一）单参数直方图流式细胞仪结果分析第37页单参数直方图细胞相对数量信道(channel)流式细胞仪结果分析第38页双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞两个测量参数，依据这两个参数就能够确定细胞在图上表示位置。双参数信号通常采取对数信号，最常见是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反应一样散射光或荧光强度颗粒数量多少。（二）双参数直方图流式细胞仪结果分析第39页1.双参数直方图点图绿色荧光强度红色荧光强度流式细胞仪结果分析第40页双参数直方图点图流式细胞仪结果分析第41页2.二维等高图由类似地图上等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上含有相同细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面线)所代表细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数改变率越大。流式细胞仪结果分析第42页二维等高图流式细胞仪结果分析第43页3.假三维等高图流式细胞仪结果分析第44页（三）三参数直方图流式细胞仪结果分析第45页多参数分析：当细胞标识了多色荧光，被激发光激发后，得到荧光信号和散射光信号可依据需要进行组合分析。（四）流式细胞仪多参数分析流式细胞仪结果分析第46页Gate设置：指在某一张选定参数直方图上，依据该图细胞群分布选定其中想要分析特定细胞群，并要求该样本全部其它参数组合直方图只表达这群细胞分布情况。依据门形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。三、设门分析技术流式细胞仪结果分析第47页A淋巴细胞B单核细胞C中性粒细胞A、B、C均为任意门流式细胞仪结果分析第48页线性门流式细胞仪结果分析第49页Region设置:

区阈（region,R）与门(gate,G)是两个相关概念，区阈可与门对应，不过也能够包含于门。流式细胞仪结果分析第50页D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字门分析时，起就能够由四个区域组成，即G=D1+D2+D3+D4。

流式细胞仪结果分析第51页样本制备标识染色液相芯片技术质量控制第四节流式细胞仪免疫分析技术要求

流式细胞仪结果分析第52页外周血淋巴细胞样品制备 分离单个核细胞培养细胞样品制备蛋白酶消化机械吹打使贴壁细胞脱落 洗涤尼龙网过滤单细胞悬液一、免疫检测样品制备流式细胞仪结果分析第53页新鲜实体组织单细胞悬液制备机械法酶处理法化学试剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液保留深低温保留法（一年）乙醇或甲醇保留法（2周）甲醛或多聚甲醛保留法（2月）流式细胞仪结果分析第54页适用条件:有较高量子产额和消光系数对488nm激发光波长有较强吸收发射光波长与激发光波长间有较大波长差易与标识单抗结合而不影响抗体特异性二、常见荧光染料与标识染色流式细胞仪结果分析第55页FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光细胞悬液异硫氰酸荧光素得州红能量传递复合染料藻胆蛋白类（一）几个常见荧光染料流式细胞仪结果分析第56页名称染料激发波长荧光颜色溶解性对PH敏感性特点异硫氰酸荧光素FITC488绿525易敏感易溶于水，与抗体结合不影响特异性得州红Texasred568红615不易不敏感稳定，偶联后量子产额低藻红蛋白PE488橙575易不敏感具较多发光基团，消光系数和量子产额高藻青蛋白PC488别藻青蛋白APC633红670能量传递复合染料PEcy5488红670易不敏感降低交叉，成本高常见几类荧光染料流式细胞仪结果分析第57页 用化学法将两种不一样激发波长染料结合在一起，在488nm激发光照射下，经过一个荧光染料被激发后产生发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。能量传递复合染料流式细胞仪结果分析第58页PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷5藻红蛋白能量传递复合染料机制流式细胞仪结果分析第59页荧光染料与细胞成份四种结合方式

结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标识抗体特异性结合免疫荧光标识方法

直标:干扰少,但需购置各种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标识各种抗体 组合标识（二）免疫荧光标识流式细胞仪结果分析第60页免疫胶乳颗粒应用即液相芯片技术是把微小乳胶微球分别染成上百种不一样荧光色，把针对不一样检测物乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不一样待测特产生不一样颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。三、免疫胶乳颗粒技术应用流式细胞仪结果分析第61页微小乳胶微球分别染成上百种不一样荧光色（固相芯片是用探针在芯片上坐标位置给基因特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）流式细胞仪结果分析第62页流式细胞仪结果分析第63页经过对标识不一样荧光素分子检测，实现FCM对可溶性物质定量分析流式细胞仪结果分析第64页适当制备方式处理红细胞实体组织起源标本用机械法温度25~37℃，pH7.0~7.2四、流式细胞免疫学技术质量控制（一）单细胞悬液制备质控流式细胞仪结果分析第65页温度pH染料浓度固定剂（二）免疫荧光染色质控流式细胞仪结果分析第66页光路与流路校正:确保激光光路与样品流处于正交状态，降低变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准:确保样品检测时仪器处于最正确灵敏度工作状态。绝对计数校准:确保计数准确性。Flow-checkFlow-setFlow-count（三）仪器操作质控流式细胞仪结果分析第67页同型对照：即免疫荧光标识中阴性对照，选取相同源性未标识单抗作为对照调整和设置电压，以确保特异性。全程质量控制：与待测标本一起标识和检测，结果达靶值，提醒此次试验结果可靠。（四）免疫检测质控流式细胞仪结果分析第68页流式细胞术当前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面抗原成份进行标识分析，可区分各种细胞特征，为细胞免疫研究增加了有效伎俩和帮助。第四节在免疫学检验中应用流式细胞仪结果分析第69页T淋巴细胞及其亚群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析

B1(CD19+CD5+):产生IgM型本身抗体,参加免疫调整、与本身免疫病发生相关

B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激,产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析

NK(CD3-CD16+CD56