高考生物一轮复习动物细胞融合技术与单克隆抗体DNA的粗提取与鉴定DNA片段的扩增及电泳鉴定(实验)

第十单元生物技术与工程第36讲

基因工程重组DNA技术的基本工具01基因工程的基本操作程序02DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定(实验)03基因工程的应用和蛋白质工程04目录考点三

DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定(实验)03DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，可溶于2mol/L的NaCl溶液在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色初步分离DNA和蛋白质溶解DNA鉴定DNA

利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。（1）实验原理1、DNA的粗提取与鉴定①取材、研磨称取约30g切碎的菜花加10mL研磨液充分研磨研磨目的：破碎细胞，使核物质易溶在研磨液中（2）实验步骤1、DNA的粗提取与鉴定②过滤获取含DNA的上清液在漏斗中垫上纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中在4℃冰箱中放置几分钟后再取上清液。低温放置的作用可抑制酶的活性以阻止DNA降解及运动，使之易形成沉淀析出。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。DNA会吸附在滤纸上，用纱布减少DNA的损失（2）实验步骤1、DNA的粗提取与鉴定③冷却酒精析出DNA上清液加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA的降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。（2）实验步骤1、DNA的粗提取与鉴定上清液加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。防止将丝状DNA搅碎，不利于DNA絮状物的挑出③冷却酒精析出DNA（2）实验步骤1、DNA的粗提取与鉴定取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。1号试管2号试管加入2mol/LNaCl溶液5mL5mL丝状物(DNA)不加用玻璃棒搅拌无变化加入二苯胺试剂4mL4mL沸水浴5min5min观察现象不变蓝变蓝加入丝状物溶解④DNA的鉴定溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关（2）实验步骤1、DNA的粗提取与鉴定利用PCR在体外进行DNA片段扩增①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合；PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制原理（1）实验基础2、DNA片段的扩增及电泳鉴定①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可带正电荷或负电荷。②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳（1）实验基础2、DNA片段的扩增及电泳鉴定（2）PCR实验操作步骤①用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。②待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在管的底部。2、DNA片段的扩增及电泳鉴定③参照下表参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min预变性使DNA充分变性以利引物和模板更好结合（2）PCR实验操作步骤2、DNA片段的扩增及电泳鉴定①用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，常配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀。②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。（3）DNA的电泳鉴定2、DNA片段的扩增及电泳鉴定③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。④将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。⑤接通电源，根据电泳槽阴阳极间的距离来设定电压(1～5V/cm)。待指示剂前沿移近凝胶边时停止。⑥取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。（3）DNA的电泳鉴定2、DNA片段的扩增及电泳鉴定考法1围绕DNA的粗提取与鉴定，考查实验探究能力1．(2022·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(

)A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质BA．图①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精B．图①和图③都需要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，便于DNA的析出并保持结构完整C．猪血不宜选作“DNA的粗提取和鉴定”的实验材料D．若图④操作后DNA充分溶解，则NaCl溶液的浓度约为2mol/L考法1围绕DNA的粗提取与鉴定，考查实验探究能力2．(不定项)下图是“DNA的粗提取和鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述正确的是(

)ACDA．PCR产物的分子大小在250至500bp之间B．3号样品植株导入的目的基因一定能成功表达C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰考法2围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究3．(2022·东营期末)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样(Marker)，2～10号为PCR产物；其中2号的模板为野生型植株DNA,3～9号模板为转基因植株的DNA,10号使用蒸馏水代替模板DNA。PCR时加入的模板DNA如图注所示。下列据此得出的分析中，不合理的是(

)B考法2围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究4．下列关于核酸片段的扩增及电泳鉴定的相关叙述，正确的是(

)A．PCR反应缓冲液中一般要添加ATP，以激活耐高温的DNA聚合酶B．mRNA也是核酸，因此可直接用PCR扩增仪扩增C．PCR产物常通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定D．琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中含指示剂，其可以在紫外灯下被检测出来C作业1、在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是()①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子②有了启动子才能驱动目的基因转录出mRNA③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止④所有基因表达载体的构建是完全相同的A．②③B．①④C．①②D．③④2、下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述，错误的是()A．目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入质粒DNA中B．检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录可使用PCR等技术C．目的基因表达的鉴定通常是在个体水平上进行的D．如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质，可确定目的基因上游含有启动子BA3、基因工程中目前最常用的运