3.2.2基因工程的基本操作程序高二下学期生物人教版选择性必修二

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基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞第一步第二步第三步第四步目的基因的检测与鉴定阅读课本P81-82，找出目的基因导入受体细胞的方法，各个方法的原理以及各自适用于什么生物？有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。目的基因进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。P80旁栏思考：将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便么？如果这样做，效果会怎样？这种方法针对性差，完全靠运气也无法确定哪些基因导入了受体植物。三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞（1）花粉管通道法（我国科学家独创）①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。花粉管通道法导入外源DNA三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞（2）农杆菌转化法①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。②特点：a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞（2）农杆菌转化法③过程：两次拼接和两次导入拼接1拼接2导入1导入2④具体转化方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养问题探讨三、将目的基因导入受体细胞2.将目的基因导入动物细胞（1）导入方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵原因：①体积大，易操作；

②易表现出全能性。（3）过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物知识拓展--病毒介导法（主要用于导入动物细胞）科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。三、将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入微生物细胞（1）常用方法：Ca2+处理原核细胞（常选择大肠杆菌）可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（3）过程：（目的？）（2）受体细胞：（优点？）繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收重组DNA增加细胞壁的通透性一般利用温度变化导入将目的基因导入受体细胞的方法总结细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射Ca2＋处理法(CaCl2)受体细胞受精卵或体细胞受精卵常用原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中四、目的基因的检测与鉴定

目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。1.检测与鉴定的方法分子水平的检测个体水平的鉴定四、目的基因的检测与鉴定（1）分子水平的检测①电泳检测法方法2：可以以质粒为模板进行PCR扩增，之后再进行电泳检测。设计PCR的一对引物时，最好一个引物与质粒DNA互补结合，另一个引物与目的基因DNA互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物（也可以都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物），之后再进行电泳检测；方法1：体细胞中的质粒直接进行电泳检测或者选择合适的限制酶对质粒进行酶切后再进行电泳检测，同时可借助指示分子大小的标准参照物来进一步确认目的基因。方法3：提取受体细胞的mRNA，进行逆转录，获得cDNA，用上述方法2进行PCR扩增，之后再进行电泳检测；重组质粒四、目的基因的检测与鉴定（1）分子水平的检测②核酸杂交检测法a.将转化的菌落影印在滤膜上；b.通过溶菌和核酸变性处理，使核酸暴露并与滤膜原位结合;c.用相应的带有标记的探针进行杂交,经放射自显影，就可以鉴别出目的基因;d.最后从原来的培养基上选出相应的菌落。a.提取受体细胞的DNA进行酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳；b.对分离后定位在凝胶上的DNA进行处理，并将凝胶中变性的DNA转移至硝酸纤维素膜上固定；c.用相应的带有标记的探针进行杂交，经放射自显影，就可以鉴别出目的基因。菌落原位杂交法DNA印染法四、目的基因的检测与鉴定（1）分子水平的检测②核酸杂交检测法（原理）

在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交（遵循碱基互补配对原则），若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出mRNA。四、目的基因的检测与鉴定（1）分子水平的检测③抗原-抗体杂交技术在抗原-抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是抗体？

从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。抗原苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交脱分化四、目的基因的检测与鉴定（2）个体水平的检测转基因生物检测方法观察目标抗虫植物害虫吞食害虫是否死亡抗病植物病毒(菌)感染是否出现病斑抗盐植物盐水浇灌是否正常生长抗除草剂植物喷洒除草剂是否正常生长获取目的基因产物的转基因生物提取细胞产物，与天然产品进行功能活性比较细胞产物的功能活性是否正常（1）原核生物基因非编码区非编码区启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点开始转录编码区终止子：终止转录基因的结构编码区：编码蛋白质的合成非编码区组成：编码区上游与编码区下游功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达（2）真核生物基因1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？2.以上情况如何解决？3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？4.以上情况如何解决？真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞思考当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（

）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（

）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（

）√××练习与应用(P83)2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述

错误的是（

）A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸D一、概念检测研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。二、拓展应用外源基因插入基因