多位点序列分型

关于多位点序列分型Contents两种分型方法的比较

MLST的步骤MLST的方案设计MLST的由来实例分析第2页,共31页，2024年2月25日，星期天多位点酶电泳（Multilocusenzymeelectrophoresis,MLEE）根据酶的电泳迁移率的不同来描述变异

选定管家酶

淀粉胶检测

不同电泳迁移速率电泳谱等位基因的变异性揭示微生物基因多样性第3页,共31页，2024年2月25日，星期天MLEE的缺点不能推断特殊位点的碱基序列不同实验室间的分型结果不能进行比较第4页,共31页，2024年2月25日，星期天MLST的首次使用MLST是由多位点酶电泳(MLEE)衍生出来的一种分型方法在1998年,Maiden等首次将MLST应用于脑膜炎奈瑟菌分型第5页,共31页，2024年2月25日，星期天多位点序列分型（MLST）一种基于核酸序列测定的细菌分型方法通过PCR扩增多个管家基因内部片段测定其序列，分析菌株的变异第6页,共31页，2024年2月25日，星期天MLST的原理MLST方法一般测定6~10个管家基因内部400~600bp的核苷酸序列，每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱，也即是这株菌的序列型（sequencetype,ST）。这样得到的每个ST均代表一组单独的核苷酸序列信息。第7页,共31页，2024年2月25日，星期天序列型（ST）序列型（Sequence-typying,STs）等同于MLEE得出的电泳型(Electrophoretictype,ET）通过比较ST可以发现菌株的相关性,即密切相关菌株具有相同的ST或仅有极个别基因位点不同的ST,而不相关菌株的ST至少有3个或3个以上基因位点不同第8页,共31页，2024年2月25日，星期天MLST分析方法MLST技术针对看家基因设计引物对其进行PCR扩增和测序,得出每个菌株各个位点的等位基因数值,然后进行等位基因图谱(allelicprofile)或序列类型(sequencetypes,STs)鉴定，再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵(matrixpair-wisedifferences)等方法构建系统树图进行聚类分析。第9页,共31页，2024年2月25日，星期天MLST方案的设计三要素：选择经过初步筛选的菌株选择具有独特特征的基因位点设计用于基因扩增和序列测定的引物第10页,共31页，2024年2月25日，星期天1.菌株的选择根据已有的分型方法和流行病学资料，选择100株左右具有代表性的菌株作为分析对象。理论上，这些选定的菌株要代表所研究细菌的群体，而不是仅仅包含那些对人致病的克隆。收集的菌株最好具有代表性，不仅仅由一个亚型组成。第11页,共31页，2024年2月25日，星期天2.管家基因的确定全基因组序列的测定大大方便MLST位点的选择一般选择10到20株菌评价10至15个备选位点。最终采用7个位点进行后续实验和分析。如果需要提高分辨力，可以加入个别非保守的基因，例如表面抗原基因或者毒力基因，这样比增加管家基因的个数将更有效第12页,共31页，2024年2月25日，星期天3.引物的设计目的片段长度：400~600bp所有引物调整为同一退火温度，以适用于大范围流行病学监测和群体研究为了发现引物结合位点可能存在的变异，每个位点都应该设计一对以上引物第13页,共31页，2024年2月25日，星期天/实际运用中，对于已有的成熟MLST方案的细菌，可直接从MLST数据库中获取方案。/第14页,共31页，2024年2月25日，星期天第15页,共31页，2024年2月25日，星期天第16页,共31页，2024年2月25日，星期天第17页,共31页，2024年2月25日，星期天MLST的步骤（二）

——核酸序列信息的获取收集病原微生物标本基因组DNA的获取PCR扩增目的基因片段目的片段的核酸序列测定整合核酸序列信息第18页,共31页，2024年2月25日，星期天MLST的步骤（三）——结果分析第19页,共31页，2024年2月25日，星期天结果分析根据分析的细菌群体组成1.以等位基因编号和ST编号为基本分析单位

提交到MLST分析网络服务器（www.mlst.net）

START和eBURST2.直接分析核苷酸序列

上传到GenBank比对服务器进行BLAST比对验证第20页,共31页，2024年2月25日，星期天数据分析得到等位基因图谱新的STs则找出对应的clonalcomplex在数据库中找出相应的STs群体进化研究分子流行病学研究菌群结构调查菌群遗传学分析疾病的全球性监控鉴定暴发性疾病的病原体MLST结果分析流程图第21页,共31页，2024年2月25日，星期天ST和克隆型遗传学上具有相关性但并不相同的细菌的集合,被称为是同源复合体(Theclonalcomplex),也叫克隆型。以其核心的基因型来命名。第22页,共31页，2024年2月25日，星期天

MLST和PFGE的比较

——两种不同的分子分型技术第23页,共31页，2024年2月25日，星期天不同分子分型方法比较分型方法分型力可分辨率可重复性结果易解释性易操作性费用RAPD较好较高一般一般简便低PCR-RFLP好一般一般一般简便低AFLP较好高一般好简便中MLST较好较高好好简便较高PFGE好高好好复杂较高MLVA很好高好好简便高第24页,共31页，2024年2月25日，星期天MLST和PFGE的比较

——两种不同的分子分型技术脉冲场凝胶电泳（PFGE）比较所确定的高度变异片段高分辨力不适于进行全面的流行病学调查及生物进化分析不同实验间重复性较差标准化技术数据库多位点序列分型（MLST）比较进化较慢的位点标准化技术数据库不同实验室间重复性好不适用于同血清型菌株间比较第25页,共31页，2024年2月25日，星期天MLST实例分析第26页,共31页，2024年2月25日，星期天

1.MLST方案（同MLSTDatabase）

第27页,共31页，2024年2月25日，星期天2.核酸序列信息的获取2.1样本来源54株结肠弯曲菌(C.coli)分离于2002年零售禽肉中，均为不重复菌株2.2PCR扩增2.3测序第28页,共31页，2024年2月25日，星期天3.结果分析3.1.MLST数据提交将测序序列在线递交至弯曲菌MLS