实验一质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳

关于实验一质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳载体构建过程一、质粒DNA的提取及电泳检测二、目的基因的PCR扩增及产物检测三、DNA的定性定量分析及酶切产物检测质粒双酶切PCR产物双酶切四、酶切产物及PCR产物的纯化及检测五、DNA的连接及检测六、大肠杆菌的培养和超级感受态细胞的制备七、质粒DNA的原核转化和蓝白斑筛选酶切产物+酶切产物T载体+PCR产物第2页,共23页，2024年2月25日，星期天实验学时：6学时实验类型：综合性 每组人数：4人／组实验一 质粒DNA的提取及

琼脂糖凝胶电泳检测

第3页,共23页，2024年2月25日，星期天一、实验目的

通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法。

一、碱裂解法小量制备质粒DNA第4页,共23页，2024年2月25日，星期天质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒20～200个拷贝/细胞严紧型质粒1～2个拷贝/细胞实验背景

质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环DNA；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。第5页,共23页，2024年2月25日，星期天由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的MCS处的Xba

I和Sal

I识别位点之间插入了EcoR

V识别位点，用EcoR

V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有PCR

产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。复制起点筛选标记基因多克隆位点第6页,共23页，2024年2月25日，星期天

二、实验原理

高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；②双链DNA并不完全分离。高酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质第7页,共23页，2024年2月25日，星期天

SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。第8页,共23页，2024年2月25日，星期天三、仪器、材料与试剂

(一)仪器1．恒温培养箱2．恒温摇床3．台式离心机4．高压灭菌锅

(二)材料1．含连接外源基因质粒的E.coli

2．1.5mLEppendorf管3．吸头、微量移液器第9页,共23页，2024年2月25日，星期天SolutionI

50mmol／L葡萄糖25mmol／LTris·HCl(pH8.0)10mmol／LEDTA(三)主要试剂溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成(保护、缓冲)葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒(保护作用)EDTA

的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）Tris-HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）第10页,共23页，2024年2月25日，星期天SolutionII

0.4mol/LNaOH，2％SDS,用前等体积混合

溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成(裂解、变性)SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）第11页,共23页，2024年2月25日，星期天溶液III：HAc和KAc组成的高盐溶液(复性，分离)HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。KAc会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。SolutionIII

5mol／L乙酸钾60mL冰乙酸11．5mL水28．5mL

第12页,共23页，2024年2月25日，星期天TE缓冲液

10mmo1／LTris·HCl1mmo1／LEDTA(pH8.0)胰RNA酶溶液将RNA酶溶于10mmo1/LTris·HCl(pH7．5)和15mmo1/LNaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

第13页,共23页，2024年2月25日，星期天四、实

验步骤加1.5ml培养物于EP管，12000g×30S

除去上清，加入冰的200µl溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min

加入300µl溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min

加入400µl冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g×5min转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿(1:1)，温和振荡，冰浴3min，12000g×5min

上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，-20℃冰箱中放置15min，12000g10min

弃上清，沉淀中加1ml70%乙醇，12000g×5min

去上清，管平放室温静置10min，20µlTE溶解DNA

第14页,共23页，2024年2月25日，星期天一、实验目的

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。2.琼脂糖凝胶电泳检测DNA第15页,共23页，2024年2月25日，星期天DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应,DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。二、实验原理

第16页,共23页，2024年2月25日，星期天凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的质粒DNA，有3种构型,这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

第17页,共23页，2024年2月25日，星期天

三、仪器、材料与试剂

(一)仪器

1．微波炉

2．琼脂糖凝胶电泳系统

3．移液器

4．凝胶成像系统

第18页,共23页，2024年2月25日，星期天(二)试剂

1．（1）5×TBE(50倍体积的TBE贮存液）配1000mL5×TBETris54g

硼酸27.5g

0.5mol／LEDTA20mLpH8.0或（2）50×TAE(50倍体积的TAE贮存液）

Tris242g

乙酸57mL

0.5mol／LEDTA100mLpH8.02．凝胶加样缓冲液(6x)3．琼脂糖4．溴化乙锭溶液(EB)0.5ug／mL第19页,共23页，2024年2月25日，星期天

四、实验步骤(一)、称取0.5g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50mL0.5xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，温度降至60℃左右时加入少许EB溶液，摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。(二)胶板的制备1．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

2．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，加入EB后，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(不要形成气泡)。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。

3．待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。4．加入电泳缓冲液至电泳槽中。第20页,共23页，2024年2月25日，星期天

(三)加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。(四)电泳1．接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。2．