仪器分析：第八章 分子发光分析法 分子荧光法

2024/4/15第八章

分子发光分析法8.1.1荧光与磷光的产生过程8.1.2

荧光光谱8.1.3荧光光谱的基本特征8.1.4荧光的产率与分子结构的关系8.1.5影响荧光强度的因素8.1.6仪器与结构流程8.1.7荧光分析方法与应用第一节

分子荧光法Molecularluminescenceanalysis

molecularfluorescence2024/4/158.1.1

分子荧光与磷光产生过程

由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁

分子能级比原子能级复杂。在每个电子能级上，都存在振动、转动能级。基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位。激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1，S2，…

。第一、第二、…电子激发三重态T1，T2，…

。2024/4/152.电子激发态的多重度

电子激发态的多重度：M=2S+1

S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；

S0→T1

禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的概率小。2024/4/153.激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁激发态停留时间短，返回速度快的途径，发生的概率大，发光强度相对大。荧光：10-7～10-9

s，第一激发单重态最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s，第一激发三重态最低振动能级→基态。2024/4/15非辐射能量传递过程：

振动弛豫：同一电子能级内以热交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12

s。

内转换：同多重态电子能级中，等能级间无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。

外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁。外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态有重叠转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋-轨道偶合进行。2024/4/15S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫2024/4/15辐射能量传递过程：

荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态(多为S1→S0跃迁)，发射波长为

2的荧光；10-7～10-9

s。发射荧光的能量比分子吸收的小，波长长；

2>

2>

1；

磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1→S0跃迁)

S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。

光照停止后，可持续一段时间。2024/4/158.1.2

荧光光谱

两个特征光谱：激发光谱和发射光谱。同步荧光光谱和三维荧光光谱。

1.荧光光谱类型（1）发射光谱（荧光光谱）

固定激发光波长(选最大激发波长),

化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线。2024/4/15（2）激发光谱

固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线(图中曲线Ⅰ)。激发光谱曲线的最高处，激发态分子最多，荧光强度最大。2024/4/152024/4/15（3）同步荧光光谱采用同步扫描技术（两个单色器同步转动），同时记录所获得的谱图，称为同步荧光光谱。

2024/4/15同步扫描可采取三种方式进行：

（1）固定波长差同步扫描法。保持激发波长和发射波长的波长差固定（

=

em–

ex=常数）。（2）固定能量差同步扫描法。激发波长和发射波长之间保持一个恒定的波数差（波数差=常数）。（3）可变波长（可变角）同步扫描法。使两单色器分别以不同速率进行扫描，即扫描过程中激发波长和发射波长的波长差是不固定的。2024/4/15同步荧光光谱的特点：（1）同步扫描至激发光谱与发射光谱重叠波长处，才同时产生信号。（2）

的选择直接影响所得到的同步光谱的形状、带宽和信号强度。（3）谱图简单，谱带窄，减小了谱图重叠现象和散射光的影响，提高了分析测定的选择性。（4）损失了其他光谱带，提供的信息量减少。

2024/4/15(4)三维荧光光谱

以荧光强度、激发光谱和发射光谱为坐标；可表现出激发波长和发射波长变化时荧光强度的变化信息，提供了更加完整的荧光光谱信息。

2024/4/158.1.3荧光光谱的基本特征1.

Stokes位移

激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。2.发射光谱的形状与激发波长无关

电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图

2,

1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如

2)。3.镜像规则

通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。

2024/4/15镜像规则的解释:

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；

基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁概率最大，相反跃迁亦然。2024/4/15200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱λ/nm蒽的激发光谱和荧光光谱相对强度2024/4/158.1.4

荧光的产率与分子结构的关系1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（Φ）：

荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。2024/4/152.化合物的结构与荧光

荧光素和酚酞结构相似，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。为什么？（1）跃迁类型：*→荧光效率高，系间跨越过程速率常数小，有利荧光的产生。（2）共轭效应：共轭度高，荧光效率高并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，有很强的荧光。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。2024/4/152024/4/158.1.5

影响荧光强度的因素

影响荧光强度的外部因素如下。1.溶剂的影响

除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。2.温度的影响

荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的概率增加。3.溶液pH

对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。2024/4/154.内滤光作用和自吸现象

自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。

内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色氨酸中的重铬酸钾。2024/4/155.溶液荧光的猝灭

荧光猝灭：荧光分子与溶剂分子或其他分子间相互作用,使荧光强度减弱的现象。

猝灭剂：能引起荧光强度降低的物质。

原因：碰撞猝灭（动态猝灭，主要原因）、静态猝灭（荧光分子与猝灭剂生成不产生荧光的配合物）、转入三重态猝灭、自吸收猝灭等

氧（O2

）：最常见的猝灭剂，测定时除氧。

高浓度时：荧光分子发生自吸收现象。

2024/4/158.1.6仪器与结构流程测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、试样池、双单色器系统、检测器。

特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。

基本流程图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器。光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)。检测器：光电倍增管。2024/4/15仪

器

光

路

图2024/4/15仪器框图该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析。2024/4/15同步扫描技术根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差(

)和固定能量差及可变波长三种。

同步扫描技术可简化光谱。谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率。

合适的

可减少光谱重叠。酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但

<15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱；

>60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。2024/4/15可获得三维光谱图的仪器可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图。2024/4/158.1.7

荧光分析方法与应用1.特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？检出限：0.1～0.01g/mL

相对灵敏度：0.05mol/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少

缺点：应用范围小。2024/4/152.定量依据与方法(1)定量依据

荧光强度

If正比于吸收的光量Ia和荧光量子产率Φ：

If

=Φ

Ia

由朗伯-比尔定律：Ia

=I0(1-10-κ

lc)

If

=Φ

I0(1-10-

κ

lc)=Φ

I0(1-e-2.3κ

lc)

浓度很低时，将括号项近似处理后：

If

=2.3Φ

I0

lc=kc2024/4/15（2）定量方法标准曲线法：配制一系列标准浓度试样，测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。2024/4/153.荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析

与