细胞分化细胞生物学件

关于细胞分化细胞生物学件一个受精卵如何变成一个孩子？第2页,共134页，2024年2月25日，星期天第3页,共134页，2024年2月25日，星期天第4页,共134页，2024年2月25日，星期天个体发育是通过细胞分化来实现的第5页,共134页，2024年2月25日，星期天受精后8天。胚芽完成“着陆”，微微嵌入子宫内膜。此时它分裂发育为几百个细胞第6页,共134页，2024年2月25日，星期天第7页,共134页，2024年2月25日，星期天受精后6星期，人形已隐约可见。这时，胚胎的心跳每分钟140—150下．是母亲心跳的两倍。

第8页,共134页，2024年2月25日，星期天何谓细胞分化？第9页,共134页，2024年2月25日，星期天

细胞分化（Différentiationcellulaire)

由同源细胞逐渐变为在形态结构、生理功能和生化特征等方面具有稳定差异的另一类型细胞的过程。第10页,共134页，2024年2月25日，星期天并非所有细胞均能分化第11页,共134页，2024年2月25日，星期天干细胞(StemCell)是存在于人和动物发育各阶段（包括早期胚胎和成熟组织）的一类原始状态的未分化细胞，它能够自我更新并始终保持很强的分化潜能，可以产生一种、多种、甚至全部的机体细胞类型。具体详见第五篇第十六章第12页,共134页，2024年2月25日，星期天未分化细胞自我更新

(self-renew)无限增殖体外长期培养多向分化潜能

(multipotential)第13页,共134页，2024年2月25日，星期天干细胞的类型：

胚胎干细胞embryonicstemcells

胚胎干细胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞，有自我更新和多向分化潜能，可以分化为内、中、外三个胚层的各类细胞。成体干细胞

adultstemcells

成体干细胞是处于干细胞状态的成体细胞，包括成年和未成年动物组织中的各种干细胞，因此又称为组织干细胞。如神经干细胞、造血干细胞、骨髓间质干细胞、上皮干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞等。第14页,共134页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞的来源第15页,共134页，2024年2月25日，星期天成体干细胞的概念成体干细胞又称组织干细胞，传统的观念认为它们是存在于成体组织的未分化细胞，现在认为也包括未成年动物的组织干细胞，它们具有不断增殖和自我更新能力、又具有多向分化潜能。

如造血干细胞、骨髓间质干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、上皮干细胞、胰腺干细胞、肝干细胞等第16页,共134页，2024年2月25日，星期天成体干细胞的功能自然条件下成体干细胞倾向于分化成所在组织的细胞，参与组织更新和损伤修复；外界条件诱导下成体干细胞可横向分化成其他组织的细胞，参与这些组织的损伤修复。第17页,共134页，2024年2月25日，星期天成体的组织更新也是细胞分化的结果

保持亲代干细胞的特性增殖、分化成体干细胞终末分化细胞死亡

已存在的细胞通过增殖形成相同类型的子细胞，如肝细胞成体干细胞产生新的分化，如表皮细胞

成体产生新的分化细胞第18页,共134页，2024年2月25日，星期天表皮干细胞的分化第19页,共134页，2024年2月25日，星期天各种血液细胞的形成过程第20页,共134页，2024年2月25日，星期天Science.1992Mar27;255(5052):1707-10

Neurogenesisinthemammaliancentralnervoussystemisbelievedtoendintheperiodjustafterbirth;inthemousestriatum（纹状体）nonewneuronsareproducedafterthefirstfewdaysafterbirth.Inthisstudy,cellsisolatedfromthestriatumoftheadultmousebrainwereinducedtoproliferateinvitrobyepidermalgrowthfactor.Theproliferatingcellsinitiallyexpressednestin,anintermediatefilamentfoundinneuroepithelialstemcells,andsubsequentlydevelopedthemorphologyandantigenicpropertiesofneuronsandastrocytes.Newlygeneratedcellswithneuronalmorphologywereimmunoreactiveforgamma-aminobutyricacidandsubstanceP,twoneurotransmittersoftheadultstriatuminvivo.Thus,cellsoftheadultmousestriatumhavethecapacitytodivideanddifferentiateintoneuronsandastrocytes.ReynoldsandWeiss,1992

第21页,共134页，2024年2月25日，星期天Cell.1999Jan8;96(1):25-34

Newneuronsarecontinuouslyaddedinspecificregionsoftheadultmammaliancentralnervoussystem.Theseneuronsarederivedfrommultipotentstemcellswhoseidentityhasbeenenigmatic.Inthiswork,wepresentevidencethatependymalcells(室管膜细胞)areneuralstemcells.Ependymalcellsgiverisetoarapidlyproliferatingcelltypethatgeneratesneuronsthatmigratetotheolfactorybulb.Inresponsetospinalcordinjury,ependymalcellproliferationincreasesdramaticallytogeneratemigratorycellsthatdifferentiatetoastrocytesandparticipateinscarformation.Thesedatademonstratethatependymalcellsareneuralstemcellsandidentifyanovelprocessintheresponsetocentralnervoussysteminjury.

Johanssonetal.,1999

第22页,共134页，2024年2月25日，星期天Science.279:1528–1530.

MuscleRegenerationbyBoneMarrow-DerivedMyogenicProgenitors

Growthandrepairofskeletalmusclearenormallymediatedbythesatellitecellsthatsurroundmusclefibers.Inregeneratingmuscle,however,thenumberofmyogenicprecursorsexceedsthatofresidentsatellitecells,implyingmigrationorrecruitmentofundifferentiatedprogenitorsfromothersources.Transplantationofgeneticallymarkedbonemarrowintoimmunodeficientmicerevealedthatmarrow-derivedcellsmigrateintoareasofinducedmuscledegeneration,undergomyogenicdifferentiation,andparticipateintheregenerationofthedamagedfibers.Geneticallymodified,marrow-derivedmyogenicprogenitorscouldpotentiallybeusedtotargettherapeuticgenestomuscletissue,providinganalternativestrategyfortreatmentofmusculardystrophies.

Ferrarietal.,1998

第23页,共134页，2024年2月25日，星期天不同的细胞存在分化能力的差异细胞分化经历一个分化能力逐渐受限制的过程全能细胞多能细胞单能细胞终末分化细胞第24页,共134页，2024年2月25日，星期天细胞如何hui变得不同？第25页,共134页，2024年2月25日，星期天细胞有多种途径产生差异1.不对称的分裂

细胞分裂时母细胞中的某些分子不均等地分配到两个子细胞中，造成子细胞向不同方向分化。第26页,共134页，2024年2月25日，星期天不对称分裂：生成不同的子细胞对称分裂：子细胞形成后因受到不同的影响而成为不同的细胞第27页,共134页，2024年2月25日，星期天2.细胞间的相互诱导来自外部的信号使一群细胞中的一个或更多的成员进入不同的发育途径，此过程称为诱导式的相互作用。第28页,共134页，2024年2月25日，星期天诱导信号细胞被导入新的发育途径细胞间诱导式的相互作用第29页,共134页，2024年2月25日，星期天3.相邻细胞的侧向抑制已分化的细胞可以产生抑制临近细胞朝相同方向分化的物质，阻止它们成为和自己一样。第30页,共134页，2024年2月25日，星期天细胞间的相互接触和侧向抑制抑制信号第31页,共134页，2024年2月25日，星期天4.信号分子的梯度效应当信号分子从一个源头向外扩散时，往往形成一个信号的浓度梯度，使得距源头远近不同的细胞根据自己周围信号分子的浓度，表现出各种不同的行为。第32页,共134页，2024年2月25日，星期天成形素蛋白在小鸡四肢发育中的作用第33页,共134页，2024年2月25日，星期天

细胞分化的多向性与细胞决定未分化细胞终末分化细胞A终末分化细胞B终末分化细胞E终末分化细胞C终末分化细胞D第34页,共134页，2024年2月25日，星期天移植实验显示细胞的决定状态第35页,共134页，2024年2月25日，星期天DeterminedIndevelopmentalbiology,anembryoniccellissaidtobedeterminedifithasbecomecommittedtoaparticularspecializedpathofdevelopment.Thisdeterminationreflectsachangeintheinternalcharacterofthecell,anditprecedesthemuchmorereadilydetectedprocessofcelldifferentiation.第36页,共134页，2024年2月25日，星期天细胞决定鸡胚：移植前，肢芽（长出大腿）和翼芽（长出翅膀）两处细胞形态相同，均未分化。肢芽组织块移植至翼芽部位，结果：翼尖为脚趾。肢芽翼芽长出翅膀第37页,共134页，2024年2月25日，星期天不同类型的细胞合成不同的蛋白管家基因（huosekeepinggene）：编码维持细胞最低限度的功能所不可缺少的蛋白质的基因，如组蛋白、细胞周期蛋白的基因，这些基因不参与细胞分化的定向，对细胞分化只有协助作用。奢侈基因(luxurygene)：有些蛋白和分化细胞的特殊性状密切相关，但不是细胞基本生命活动必不可少的，编码此类蛋白的基因称为奢侈基因，与各种分化细胞的特殊性状有直接关系。细胞分化是奢侈基因按一定时空顺序表达的结果第38页,共134页，2024年2月25日，星期天第39页,共134页，2024年2月25日，星期天细胞分化是基因按一定时空顺序表达的结果，这种在个体发育过程中不同的基因按照一定的时空顺序被激活的现象称为“基因的差异表达”。成纤维细胞被加入肌源蛋白后分化为肌细胞第40页,共134页，2024年2月25日，星期天生皮肌节：arecollectoionsofembryonicmesodermalcells

成肌细胞Threestagesindevelopmentofskeletalmuscleinmammals。第41页,共134页，2024年2月25日，星期天Myoblastsarecommittedtobecomemusclebuthavenotyetdifferentiated;hencetheyarereferedtoasdetermined.第42页,共134页，2024年2月25日，星期天Myogenicgenes(myoD,myogenin,myf5,mrf4)werefirstidentifiedinstudieswithculturedfibroblasts第43页,共134页，2024年2月25日，星期天Myogenicproteinsaretranscriptionfactors第44页,共134页，2024年2月25日，星期天第45页,共134页，2024年2月25日，星期天第46页,共134页，2024年2月25日，星期天绝大多数细胞的细胞核可始终保持分化的全能性第47页,共134页，2024年2月25日，星期天多能细胞：具有演变为多种细胞类型的能力。单能细胞：仅具有分化形成某一种类型细胞的能力。细胞的全能性：生物体中的一个体细胞或一个性细胞在一定条件下，有能力重新形成完整的个体，或者分化形成该个体任何种类的细胞。此特性称为“细胞全能性”。受精卵、8细胞期前的胚胎细胞是全能细胞。第48页,共134页，2024年2月25日，星期天体细胞克隆技术的诞生克隆（clone）就是指一个细胞或生物体通过无性繁殖方法扩增所得到的一批同样的细胞或生物体，简单来说就是无性繁殖。“西游记”中的美猴王擅长克隆：拔根汗毛变出小美猴王第49页,共134页，2024年2月25日，星期天1997年2月24日：克隆羊培育成功。随后几年中，克隆牛、克隆猫、克隆猴相继面世。12生肖已经克隆了一半。多名研究人员宣布克隆人计划

克隆人：我到底是谁？第50页,共134页，2024年2月25日，星期天体细胞克隆羊多利1997年克隆羊多利的诞生震惊了世界，被誉为20世纪最重大、也是最有争议的科技突破之一。

第51页,共134页，2024年2月25日，星期天胚胎细胞克隆猴“泰特拉”2000年1月这些克隆猴将用于人类糖尿病和帕金森氏症的研究。第52页,共134页，2024年2月25日，星期天茜茜来到这个世上很不容易，科学家共实验了188次才获得成功。

克隆猫CC(clonecat)2002年初

第53页,共134页，2024年2月25日，星期天由我国自主完成的成年体细胞克隆牛诞生，至今已产犊14头，存活5头。这表明我国已成为继日本、新西兰、美国等国家之后掌握体细胞克隆牛关键技术的少数国家之一。中国克隆的牛犊第54页,共134页，2024年2月25日，星期天第55页,共134页，2024年2月25日，星期天1.将人类卵细胞中的DNA取出，由此获得卵细胞的空壳。4.胚胎在子宫内逐渐发育成熟，直至降生。3.将早期胚胎植入代理受孕母亲的子宫。2.将体细胞的遗传物质植入空壳，通过电击刺激卵细胞发育，并发育到早期胚胎状。第56页,共134页，2024年2月25日，星期天治疗性克隆通常指通过对干细胞的研究来复制人类的某些组织或器官。生殖性克隆是指对整个人的复制，即从被克隆的人身上取得细胞之后，将其植入被去除了遗传基因物质的卵细胞空壳中，通过刺激使新卵细胞分化并形成胚胎，之后将胚胎植入母体的子宫里孕育。克隆婴儿具有与遗传物质源相同的生理特性。目前，国际上一般把对人类自身的克隆分为治疗性克隆和生殖性克隆第57页,共134页，2024年2月25日，星期天治疗性克隆return第58页,共134页，2024年2月25日，星期天克隆人普通人第59页,共134页，2024年2月25日，星期天细胞质的重新编程作用GenesthatareunexpressedinsomaticcellshavebeenactivatedbyinjectingculturedcellnucleiofthefrogXenopuslaevis（非洲爪蛙）intooocytesofthenewtPleurodeleswaltlii（东方蝾螈）.Thegenesthatwereactivatedarenormallyexpressedinoocytesbutnotinculturedcells.Conversely,genesthatarenormallyexpressedinculturedcellsbutnotinoocytesbecameinactivewhenculturedcellnucleiwereinjectedintooocytes.Thesechangesingeneactivityweredetectedbytwo-dimensionalgelelectrophoresisofproteinssynthesizedbyoocytesinjectedwithnuclei.Controls,whichincludedtheuseofalpha-amanitin,showedthatthesechangesinproteinsynthesisaredependentongenetranscription.Weconcludethatgenesthatbecomeinactiveduringcelldifferentiationcanbereactivated,intheabsenceofcelldivision,bynormalcomponentsofoocytecytoplasm.ProcNatlAcadSciUSA.1977:2470–2474.

DeRobertisEM,GurdonJB.

第60页,共134页，2024年2月25日，星期天DNA甲基化修饰可能是一种重新编程的方式DNA自身的共价，限于CG序列的胞嘧啶上。由甲基转移酶催化修饰。甲基化和去甲基化可调节基因的转录。（CTCF蛋白对Pax6表达的调节）第61页,共134页，2024年2月25日，星期天DNA甲基化可以忠实地得到遗传第62页,共134页，2024年2月25日，星期天基因芯片实验设计和过程去甲基化处理48h后ES细胞在没有滋养层细胞条件下培养1µM甲基化转移酶抑制剂5-Azad-2’-deoxycytidine处理RNA准备:

新鲜抽提组织

用RNA600NanoLabChip质检cRNA的准备:扩增率,>20电泳芯片杂交测试基因芯片:均一的背景

良好的整体信号

杂交阳性对照GAPDH,

-actin3’/5’信号

组内可重复性数据收集:高严谨性标准化(TGT,GAPDH)去甲基化第63页,共134页，2024年2月25日，星期天Demethylation-inducedchangesofgeneexpressioninmouseEScells2,0322,003Up-regulatedgenesbyDNAdemethylation-Down-regulatedgenesbyDNAdemethylation-1612840-4mRNARatioChangedDnmt2Pax6H19IGF2RDnmt3b第64页,共134页，2024年2月25日，星期天1.基因组合调控产生多种调节模式组合调控（combinationalcontrol）一些基因调节蛋白通过一定的组合形成一系列的调节模块，依次结合到调节序列上，在正确的时间和空间，表达正确的基因模式。该机制可以使为数不多的基因调节蛋白产生众多的细胞类型。第65页,共134页，2024年2月25日，星期天基因组合调控对发育的重要作用第66页,共134页，2024年2月25日，星期天二、基因调节模式的遗传和细胞记忆与特化细胞的特征形成有关的基因调节模式及染色体结构变化是可以遗传的。第67页,共134页，2024年2月25日，星期天正反馈环的遗传机制第68页,共134页，2024年2月25日，星期天三、基因表达的调节是多水平的第69页,共134页，2024年2月25日，星期天真核细胞基因表达调节的多重性第70页,共134页，2024年2月25日，星期天四、细胞质的作用胞质记忆由细胞质中的成分直接或间接作用于基因组，使得特定的基因被选择性表达的现象。第71页,共134页，2024年2月25日，星期天第四节细胞分化与肿瘤

肿瘤发生是细胞去分化或分化阻断的结果，其分子基础是基因突变或表达异常。第72页,共134页，2024年2月25日，星期天一、分化异常与肿瘤肿瘤起源于一些未分化或微分化的干细胞，主要表现出增殖过度、分化不全的特征。肿瘤细胞所处的分化状态决定了肿瘤的恶性程度。例如白血病是多能造血干细胞在某一阶段分化发育受阻的结果。第73页,共134页，2024年2月25日，星期天二、诱导分化与肿瘤治疗肿瘤细胞在一定条件和诱导分化剂的作用下可以向正常细胞转化：维甲酸治疗白血病。第74页,共134页，2024年2月25日，星期天由同源细胞逐渐变为在形态结构、生理功能和生化特征等方面具有稳定差异的另一类型细胞的过程称为分化。细胞分化是胚胎发育和维持成体生存的重要因素。本章小节第75页,共134页，2024年2月25日，星期天已分化的细胞能够去分化、转分化。细胞向哪个方向分化是由各方面因素共同决定的。第76页,共134页，2024年2月25日，星期天从基因角度看细胞分化是基因按一定时空顺序表达的结果，这种在个体发育过程中不同的基因按照一定的时空顺序被激活的现象称为“基因的差异表达”。第77页,共134页，2024年2月25日，星期天思考题：解释下列名词：细胞分化去分化转分化细胞全能性干细胞管家基因奢侈基因基因的差异表达第78页,共134页，2024年2月25日，星期天

回答下列问题：1.为什么肠上皮细胞频繁地更新，而大部分神经细胞的寿命可与机体的寿命一样长？第79页,共134页，2024年2月25日，星期天分化、增殖状态不同的三类细胞：持续增殖细胞：造血干细胞、表皮基底细胞、骨原细胞暂时不增殖细胞：肝细胞、初级卵母细胞不增殖细胞（终末细胞）：神经元、红细胞、表皮角质细胞、骨细胞更新速度不同的三类细胞：不更新、接近机体寿命：神经元、骨细胞、脂肪细胞缓慢更新：肝细胞、胃壁细胞、肾皮质细胞快速更新：表皮细胞、红细胞、白细胞

第80页,共134页，2024年2月25日，星期天干细胞

stemcell未分化细胞自我更新

(self-renew)无限增殖体外长期培养多向分化潜能

(multipotential)第81页,共134页，2024年2月25日，星期天干细胞的类型：

胚胎干细胞embryonicstemcells

胚胎干细胞主要是指来自囊胚内细胞团的细胞，有自我更新和多向分化潜能，可以分化为内、中、外三个胚层的各类细胞。成体干细胞

adultstemcells

成体干细胞是处于干细胞状态的成体细胞，包括成年和未成年动物组织中的各种干细胞，因此又称为组织干细胞。如神经干细胞、造血干细胞、骨髓间质干细胞、上皮干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞等。第82页,共134页，2024年2月25日，星期天胚胎早期发生：囊胚形成

（囊胚内细胞团）第83页,共134页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞的分离和建系

将囊胚内细胞团的细胞通过体外培养产生未分化的细胞克隆，建立胚胎干细胞系1981年Evans和Martin首次成功分离和建立小鼠胚胎干细胞系1998年Thomson等首次成功分离和建立人胚胎干细胞系胚胎干细胞可在体外诱导分化形成各种成体细胞第84页,共134页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞体外诱导分化外源诱导因子诱导ES细胞分化

诱导因子：维甲酸(RA)、骨形成蛋白BMPs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)等转基因诱导ES细胞分化

用转基因技术使某种促分化基因在ES细胞中表达、调节其分化与其他细胞共培养诱导ES细胞分化

创造细胞分化的微环境第85页,共134页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞embryonicstemcells（ES细胞）第86页,共134页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞体外诱导分化第87页,共134页，2024年2月25日，星期天成体干细胞adultstemcells又称组织干细胞tissuestemcells第88页,共134页，2024年2月25日，星期天成体干细胞的概念成体干细胞又称组织干细胞，传统的观念认为它们是存在于成体组织的未分化细胞，现在认为也包括未成年动物的组织干细胞，它们具有不断增殖和自我更新能力、又具有多向分化潜能。

如造血干细胞、骨髓间质干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、上皮干细胞、胰腺干细胞、肝干细胞等第89页,共134页，2024年2月25日，星期天成体干细胞的功能自然条件下成体干细胞倾向于分化成所在组织的细胞，参与组织更新和损伤修复；外界条件诱导下成体干细胞可横向分化成其他组织的细胞，参与这些组织的损伤修复。第90页,共134页，2024年2月25日，星期天造血干细胞的分化第91页,共134页，2024年2月25日，星期天表皮干细胞的分化第92页,共134页，2024年2月25日，星期天

干细胞应用前景细胞治疗组织工程药物筛选发育研究基因功能研究第93页,共134页，2024年2月25日，星期天干细胞和细胞治疗

stemcellandcelltherapy第94页,共134页，2024年2月25日，星期天

细胞治疗

celltherapy

细胞治疗是指将正常或遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内，以达到替代受损细胞、治疗疾病的目的。利用干细胞及其分化细胞进行细胞治疗是干细胞临床应用的重要研究方向。

胚胎干细胞和成体干细胞都能用于细胞治疗，但目前只有少数成体干细胞在细胞治疗上己开始取得临床疗效，大多数的干细胞治疗还在实验阶段。第95页,共134页，2024年2月25日，星期天血液病的细胞治疗如白血病的细胞治疗

造血干细胞移植：自体移植（脐带血造血干细胞）无排斥反应同系移植（同卵孪生之间骨髓造血干细胞）一般无排斥反应同种移植（人与人之间骨髓造血干细胞）有排斥反应（供、受者组织相容性抗原不同）

需组织配型、选择供者（骨髓库）；抑制受者的免疫应答、诱导免疫耐受。

第96页,共134页，2024年2月25日，星期天神经系统疾病的细胞治疗如帕金森氏病细胞治疗胚胎干细胞细胞移植神经干细胞细胞移植

1、干细胞直接移植

2、诱导分化成相应神经细胞（多巴胺能神经元）后进行细胞移植

第97页,共134页，2024年2月25日，星期天心肌疾病的细胞治疗如心肌梗塞的细胞治疗

胚胎干细胞诱导分化成心肌细胞细胞移植成体干细胞（骨髓基质干细胞、脂肪干细胞、心肌干细胞等）诱导分化成心肌细胞细胞移植第98页,共134页，2024年2月25日，星期天干细胞治疗中的难点异体移植的免疫排斥反应解决途径：自身体细胞核移植（治疗性克隆）干细胞基因改造采用自身干细胞成瘤性的危险胚胎干细胞植入动物体内会形成畸胎瘤，如何防止干细胞移植后可能因分化不彻底形成肿瘤，是必须解决的问题。解决途径：完善定向诱导分化方法改进筛选纯化技术第99页,共134页，2024年2月25日，星期天治疗性克隆

（体细胞核移植）

第100页,共134页，2024年2月25日，星期天我们实验室的一项工作胰腺干细胞的β细胞分化与I型糖尿病的干细胞治疗第101页,共134页，2024年2月25日，星期天

I型糖尿病的治疗外源胰岛素治疗胰腺或胰岛移植干细胞治疗：

胚胎干细胞诱导分化成β细胞细胞移植基因导入使其表达胰岛素细胞移植胰腺干细胞诱导分化成β细胞细胞移植第102页,共134页，2024年2月25日，星期天胰腺干细胞的标志

1990年，Lendahl等人发现神经干细胞中存在一种新的中间丝蛋白—巢蛋白（nestin），现在nestin已是公认的神经干细胞标志之一。

2000年，Hunziker和Stein发现胰腺导管和胰岛中也存在nestin阳性细胞。

2001年，Zulewski等人从胰腺中分离到nestin阳性细胞，将其命名为NIPs（nestin-positiveislet-derivedprogenitorcells），并发现具有多向分化潜能(multipotential)，在体外可自发形成类胰岛细胞团（islet-likecellclusters,ICCs）.

因此，人们相信nestin可能也是胰腺干细胞的标志。但是，NIPs是否确实是胰腺干细胞，能否用于细胞治疗必须进一步证实。2001年起，我们为此做了一点实验。

第103页,共134页，2024年2月25日，星期天我们的实验:人胎胰腺

nestin阳性细胞的分离、体外培养和生物学特性检测（目的是确认NIPs是胰腺干细胞）；体外诱导分化NIPs形成能产生胰岛素的β细胞；类胰岛细胞团(ICCs)异种体内移植—糖尿病的干细胞治疗实验研究。第104页,共134页，2024年2月25日，星期天

第一个实验：人胎胰腺nestin阳性细胞(NIPs)的分离、体外培养和生物学特性检测第105页,共134页，2024年2月25日，星期天人胎胰腺的nestin阳性细胞的分布

免疫组化技术显示nestin阳性细胞

nestin阳性细胞位于胰腺小导管壁及其相连的原始细胞团第106页,共134页，2024年2月25日，星期天分离胎胰导管和细胞团

在EHAA培养液（含2%FBS）中进行原代培养

在EHAA培养液中的胎胰导管和细胞团

培养48小时后细胞贴壁并开始铺开第107页,共134页，2024年2月25日，星期天CK19

insulinnestin贴壁细胞鉴别：是否存在NIPs

免疫荧光染色检测CK19、胰岛素、nestin阳性细胞

呈CK19阳性的胰腺上皮细胞（细胞较大)

呈胰岛素阳性的

β细胞（细胞较小）

nestin阳性细胞(NIPs)（梭形）第108页,共134页，2024年2月25日，星期天

NIPs的筛选培养和体外扩增

贴壁细胞在无糖低血清条件培养液中筛选培养NIPs

4周后大部分细胞死亡、仅存少量梭形细胞(NIPs)

DMEM/F12培养液中加生长因子bFGF促进梭形细胞(NIPs)体外扩增。亚克隆纯化、传代培养图为由单个梭形细胞(NIPs)形成的细胞集落梭形细胞(NIPs)可在体外长期传代培养第109页,共134页，2024年2月25日，星期天

NIPs的干细胞表型确定

免疫组化在蛋白质水平检测nestin表达

半定量RT-PCR在mRNA水平检测nestin和干细胞标志基因ABCG2表达

nestin

semiquantitativeRT-PCR筛选培养的梭形细胞(NIPs)集落免疫组化显示筛选培养的细胞均呈nestin阳性反应半定量RT-PCR显示筛选培养的细胞表达nestin和ABCG2第110页,共134页，2024年2月25日，星期天nestin

NIPs达到80%铺满时可自发形成小的ICCsNIPs能自发形成类胰岛细胞团(ICCs).NIPs在DMEM培养液(含11.1mM葡萄糖、10%FBS和20ng/mlbFGF)中培养免疫组化显示这种ICCs主要由nestin阳性细胞组成RT-PCR显示这种ICCs高水平表达ABCG2和nestin

RT-PCRanalysis第111页,共134页，2024年2月25日，星期天

培养2周后形成的ICCs大而致密glucagon

NIPs具有多向分化潜能培养液中撤去bFGF使NIPs分化RT-PCRanalysis免疫组化显示此时ICCs表达glucagonRT-PCR显示此时ICCs有多种谱系基因的表达，具有向胰腺多种类型细胞分化的能力第112页,共134页，2024年2月25日，星期天这一实验结果表明：NIPs表达干细胞标志ABCG2，能长期培养，有多向分化潜能，在细胞形态、生长行为和分化潜能上具有干细胞特征，因此可以认为是胰腺干细胞.

ABCG2是ABC运输蛋白（ATPbindingcassettetransporter）家族成员，其功能是将细胞内的促分化因子泵出细胞以维持干细胞的未分化状态，现在认为它是干细胞状态决定因子。已有报道ES细胞、造血干细胞、骨髓间质干细胞、神经干细胞、肌干细胞等均表达ABCG2。第113页,共134页，2024年2月25日，星期天第二个实验：

体外诱导分化NIPs形成产生胰岛素的β细胞；第114页,共134页，2024年2月25日，星期天

培养10天后形成很多大而致密的ICCsinsulin诱导NIPs形成β细胞

NIPs在含高浓度葡萄糖(16.5mM)和多种诱导因子(IGF,HGF,betacellulinandnicotinamide)的DMEM

培养液中培养

RT-PCRanalysis免疫组化显示ICCs中有胰岛素阳性的β

细胞此时ICCs表达β

细胞的标志，但仍少量表达NIPs和其他细胞的标志第115页,共134页，2024年2月25日，星期天ICCs的细胞内胰岛素含量

磁性分离酶联免疫方法测定ICCs的细胞内胰岛素含量β细胞诱导分化后的ICCs(ICC3)细胞内胰岛素含量明显高于多向分化的ICCs(ICC2)，但仍低于胎胰胰岛(islet)的胰岛素含量第116页,共134页，2024年2月25日，星期天

insulinsecretioninresponsetoglucose

葡萄糖或促分泌素对ICCs分泌胰岛素的作用

磁性分离酶联免疫方法测定ICCs分泌胰岛素量

T:tolbutamideC:carbacholG:GLP-1

insulinsecretioninresponsetosecretagogues在不同浓度葡萄糖刺激下ICCs中β细胞胰岛素分泌量与萄葡糖浓度呈正相关各种分泌刺激因子刺激ICCs释放胰岛素。T--甲苯磺丁脲C--碳酰胆碱G--胰高血糖素样肽第117页,共134页，2024年2月25日，星期天

这一实验结果表明：NIPs具有多向分化潜能，在一定条件下能定向分化为功能性β细胞.

尚待解决的问题：

1、诱导分化不彻底，在产生β细胞同时，还存在其他类型细胞；

2、体外分泌胰岛素水平远低于正常胰岛。第118页,共134页，2024年2月25日，星期天

第三个实验：

类胰岛细胞团(ICCs)异种体内移植—

糖尿病的干细胞治疗实验研究。

（将定向诱导人NIPs形成含β细胞的ICCs

移植到严重联合免疫缺失小鼠体内）第119页,共134页，2024年2月25日，星期天糖尿病小鼠模型制作(腹腔注射链脲佐菌素STZ)

肾膜下移植ICCs治疗糖尿病NOD-Scid小鼠腹腔内注射streptozotocin肾膜下移植含类β细胞的ICCs高血糖

注射STZ前注射STZ后

移植ICCS后

302010

血糖水平(mmol/l)

注射后3天小鼠出现稳定的高血