生物芯片技术省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics生物芯片技术温州医学院检验医学院生命科学学院分子生物学检验技术∙第九章1/81免疫共沉淀（Co-IP）2/81Pulldownassay3/814/815/81章节提要生物芯片始于上世纪90年代，伴随人类基因组计划而诞生一项新技术。它是由Southern印迹技术衍生而来，是一门多学个交叉综合技术，这项技术包括到了生命科学、计算机、微机械、微电子、物理、化学、数学等领域。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics6/81定义：经过微加工和微电子技术，在固相基质表面集成了成千上万密集排列分子微阵列，以实现对组织，细胞，核酸，蛋白质及其它生物分子进行有效、准确、高通量检测。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics章节提要7/81种类：基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、液相芯片、缩微芯片试验室。各类芯片定义。最终目标：把生物和化学等领域所包括样品制备，生化反应和检测分析整个过程集成化，并缩微到一张芯片上自动完成，形成缩微芯片试验室。章节提要8/81章节提要芯片技术优点：多样品并行处理、分析速度快、所需样品量少、污染少。应有领域：基础研究、临床诊疗、药品筛选，指导用药与治疗、农作物优育优选、环境检测、卫生监督、司法判定。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics9/81以结构与工作机制可分为微阵列芯片与微流体芯片微阵列芯片：由生物材料微阵列组成芯片，以分子间亲和结合作为关键，以在固相载体表面固定一系列可寻址识别分子阵列为结构特征，如碱基配对，抗原抗体结合，包含基因芯片，蛋白质芯片，组织芯片等。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics章节提要10/81微流体芯片：以微管道网络为结构特征，实现对各种生化组分微流控操作和分析，包含毛细管电泳芯片，PCR反应芯片等缩微芯片试验室优势：将样品制备、生化反应、检测等过程集成在一个系统中。它是未来芯片发展主流方向之一，也是生物芯片发展最终目标。章节提要11/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics本章节主要学习内容基因芯片（genechip）蛋白质芯片（proteinchip）缩微芯片试验室（laboratoryonachip）

12/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第一节基因芯片基因芯片(genechip)又称DNA芯片（DNAchip）或DNA微阵列（DNAmicroarray）。将大量基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片。13/81DNAMicroarray原理经过标识待测样品DNA经过与芯片上特定位置探针按碱基配对原理杂交后，经激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，经过检测杂交信号强度来获取样品分子数量与序列信息，用计算机软件进行数据比较与分析，从而对基因序列及功效进行大规模，高通量研究。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics14/81一、基因芯片原理基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上一个高效、快速

核酸序列分析伎俩。同时也是最先发展，最为成熟，最先商品化生物芯片15/81芯片分类载体不一样：玻璃芯片、膜芯片、硅芯片、陶瓷芯片方法不一样：原位合成、直接点样探针不一样：寡核苷酸、cDNA、基因组芯片用途不一样：表示谱、测序芯片、诊疗芯片、SNP分型16/81分析步骤为：

生物芯片制作、样品处理及标识、杂交或反应、杂交检测及数据处理等。

芯片设计芯片制作PCR扩增靶基因标识原位合成点样方法实际应用样品处理芯片杂交数据分析杂交检测放射显影光化学电化学酶促反应17/81芯片技术发展关键无孔固相载体，如玻璃高密度寡核苷酸片段原位合成技术ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics18/81载体定义与种类定义：用于连接、吸附或包埋各类生物分子使其以水不溶性状态行使功效固相材料。

玻片固体片状硅片瓷片硝酸纤维素膜膜性材料尼龙膜聚丙烯膜19/81含有能够进行化学反应活性基团，便于与生物分子进行偶联。要有惰性与稳定性：惰性（非特异吸附和其它性能不干扰生物分子动能）稳定性（能承受一定压力与酸碱条件改变）良好兼容性(便于制作其它类型芯片)载体材料要求20/81载体表面处理原因：核苷酸片段无法直接连接到载体表面，故需要活化，便于固定生物分子。试剂：碳二亚氨，N-羟基琥珀酰亚胺酯。活性基团：氨基、羟基、巯基、醛基处理依据：载体表面性质、生物分子化学特征21/81常见载体薄膜状载体

优点：与核酸亲和力强、技术成熟。膜结合玻璃片

优点：亲和性、刚性ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics22/81处理载体基本要求修饰后表面要均匀且硬质有效固定各种类型生物材料在激发光下，荧光背景低高密度，大量，均匀点阵，变异系数小23/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探针固定到固相支持物上，方法有两种：

光去保护并行合成法原位合成分子印章原位合成法喷印合成法（压电打印法）合成点样经过特定高速点样机器人直接将探针点在芯片上技术。24/81合成cDNA探针标准设计于目标cDNA3’端。防止长片段重复序列长度为0.1-2.5kbZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics25/81寡核苷酸探针长度16-26bp，G+C在40-60%探针内不用大于4bp碱基互补配对序列，同一个碱基连续出现小于4个与非靶序列同源性低于70%，小于8个碱基相同。设置多个序列相近参考寡核苷酸探针。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics26/81点突变检测核苷酸探针设计方法：等长移位设计法按靶序列从头到尾依次去一定长度互补核苷酸序列组成一套探针组合。这套探针是野生型探针，然后对每一野生型探针中间某一碱基用其它三种碱基替换。主要目标：进行点突变扫描ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics27/81探针在载体表面固定（一）合成点样法：经过PCR扩增或人工合成序列，经过计算机控制三坐标工作平台，用针头和微喷头分别把探针溶液分配在固相载体表位点上，经过物理或化学法固定探针。优点：技术成熟，灵活性大，适合用于单位自行合成。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics28/81在硬质表面上直接合成寡核苷酸探针序列原位光刻合成法、压电打印合成法，分子原位合成法。技术瓶颈：高空间分辨率模板点位技术、高合成效率DNA化学合成技术优点：标准化，规模化ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探针在载体表面固定（二）29/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics原位合成原理基因芯片原位合成法是基于组合化学合成原理。它经过一组定位模板来决定基片表面上不一样化学单体偶联位点和次序，如要合成AGCT四种碱基全部序列组合四聚体(44种)。30/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics原位光刻合成法主要步骤为：1.首先用光敏保护支持物活化基团2.选择适当蔽光膜保护不需要聚合地方，暴露需要聚合位点3.在激光点光源照射下，去除光敏感保护基团，使该位点显露出活性羟基或者氨基4.加入单核苷酸，与活化端发生化学反应5.然后更换蔽光膜，重复上步骤，完成核苷酸固定连接（见图）。优点：在较小区域制造大量不一样探针。31/81图9-2基因芯片原位合成原理示意图

32/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics喷印合成法（压电打印法）原理：

墨盒内所用ATCG四种碱基而非碳粉。步骤：将特定DNA碱基合成试剂喷洒到特定位置上，以固相合成原理与支持物发生偶联，然后固定，冲洗，去保护，偶联，直至合成完所需长度探针。33/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics分子印章原位合成法分子印章制备和压印过程如见图34/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（三）合成点样

由含有多个微细加样孔阵列复制器(arrayingandreplicatingdevice，ARD)或阵列器及由电脑控制机器人来完成。机器人准确、快速地将不一样探针样品定量(0.25～1.0μl)点样于预处理好基板对应位置上，在基板上产生直径为100～150μm斑点，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。35/81合成点样法分类接触式点样喷墨式打印定位准确，重复性好

斑点大，大小分布不均，密度低。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics36/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics二、样品制备及标识（一）样品制备样品扩增在标识和分析前对样品进行适当程度扩增，以提升阅读灵敏度。待测样品标识

多采取荧光标识（cy3、cy5和FAM）方法，对于阵列密度较小基因芯片能够用同位素检测法。37/81荧光标识优点激发光谱与发射光谱之间STOCK’s位移大，故分辨率强，灵敏度高能够进行定量检测防止放射性同位素好污染。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics38/81三样品与基因芯片杂交本质：DNA探针与靶基因碱基杂交形成DNA双链或DNA/RNA杂合链。影响原因：靶分子浓度探针浓度序列组成盐浓度杂交温度反应时间基因表示检测——低温，高盐，长时间突变检测——高温，低盐，短时间39/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics四、杂交结果检测

检测方法很多，如荧光显影法、质谱法、化学发光和光导纤维等。荧光检测器激光共聚焦快速传输高质量图像，灵敏度高，分辨率好价格昂贵偶联装置摄影机扫描速度快，价格廉价灵敏度低40/81荧光显影法完全匹配产生荧光强度比存在一两个错配高5-35倍荧光强度与待测分子含量呈线性关系问题只要结合就会有阳性信号，无法确认是否完全匹配处理方法使用多色荧光技术——不一样靶基因使用不一样激发波长荧光标识物。41/81芯片激光光源电子束分裂器聚焦小孔检测器滤光镜聚光镜物镜使用最广泛是荧光显影法42/81光纤DNA生物传感器微阵列原理：将合成氰尿酰氯活化探针固定在光纤末端，集成含有不一样探针光纤，形成传感装置，探针伸入样品中，信号由另一端CCD检测。优势方便，可在没有confocal试验室中开展试验。43/81五、杂交结果分析标准化：消除不一样芯片，不一样标识物差异数据精简：去掉无显要意义数据统计学分析：对数据进行分析归类，并进行统计学检验，确保器准确性生物学意义分析：基于统计结果，研究其代表生物学意义，得出对应结论数据库：Genesist，AMADA，TIGR。44/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics三、基因芯片技术在医学领域应用

基因芯片技术基本应用能够分为两个主要方面：定量分析（主要指测序和突变检测）定性分析（主要指对基因表示研究）。45/81基因功效研究基因表示及调控研究基因突变和多态性检测DNA序列测定基因组及基因研究46/81基因表示及调控研究基因芯片应用最广泛领域从整体上分析细胞基因表示情况，为了解与一些生命现象相关基因表示提供有力证据，对于基因调控以及基因相互作用机理探讨有主要意义47/81基因突变和多态性检测利用基因芯片技术对一些突变点定位、确认及分类是诊疗基因疾病基础。寡核苷酸芯片能够检出变异位点，被代替核苷酸以及变异特征。比如：HIV病毒RT与PRO突变检测。48/81DNA序列测定原理：任何线性DNA或RNA单链都能够被分解为一系列碱基数固定，错落重合寡核苷酸片段，或称为亚序列，只要测出莫伊核苷酸全部亚序列，就能够还原原序列。优点快速、成本低、易于自动化缺点杂交条件不统一、易出现假性结果、重复序列无法测定。优势测定已知序列、研究突变与SNP检测。49/81基因组及基因研究研究酵母基因组复制活动：发觉其复制起点、复制叉在基因组移动与S期复制和转录活动关系优势：用量少、自动化、便于大量筛选新基因50/81基因芯片应用于疾病诊疗优势

灵敏、准确、快速、简单、高通量（同时检测各种疾病）应用：感染性疾病诊疗出生缺点检测遗传性疾病诊疗HLA配型检测肿瘤诊疗及分型神经系统疾病检测耐药性检测疾病诊疗51/81感染性疾病诊疗流程

将待测病原体特征基因片段或寡核苷酸探针固定于玻片上制成芯片，从患者血清中提取病原DNA或RNA经扩增标识荧光后与芯片进行杂交，扫描杂交信号，计算机分析，得出定性或定量结果。52/81因为病原微生物不一样亚型，不一样突变株会造成患者发病程度，患者对药品敏感程度等差异，故对病原微生物分型，能够帮助医生了解患者病情，确定最正确治疗方案。如HPV亚型123种，其中20种高危，提前诊疗HPV感染，有利于预防宫颈癌变，降低死亡率。基因芯片上同时对21种不一样类型HPV诊疗，3.5小时完成。感染性疾病诊疗53/81遗传性疾病诊疗现行诊疗遗传学疾病方法（PCR，测序、RFLP）共同缺点通量低。遗传性疾病中可能是由众多位点中一个或多个位点突变引发，所以对多位点检测尤为主要。如beta-地中海贫血，突变100种以上。应用于血友病，杜氏肌营养不良症、苯丙酮尿症，血红蛋白异常病。54/81肿瘤诊疗及分型获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤生长相关基因表示模式筛选出哪些分子起关键性调控作用基因肿瘤分型（乳腺癌）应用如p53基因突变检测55/81耐药性检测病原微生物表示谱检测突变分析多态性分析目标——指导抑制靶分子新药合成、临床用药56/81基因芯片在药品研究中应用可直接在基因水平上寻找药品靶标，解释作用机理，检测药品毒副作用，为药品开发与设计提供理论依据。作用表达：代替人体靶组织分析代谢路径与信号通路确定药品作用靶组织引导药品开发缩短周期，便捷57/81基因芯片存在问题探针合成中会插入杂质，降低特异性制备标识过程比较复杂。数据缺乏可比性，不利于芯片数据共享58/81产生原因：蛋白质表示与其上游mRNA表示未显示出直接关系。蛋白质结构或构象微小改变均能造成其活性与功效改变定义：是指固定于支持介质上多肽或蛋白质组成微阵列第二节蛋白质芯片59/81第二节蛋白质芯片60/81第二节蛋白质芯片61/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第二节蛋白质芯片蛋白质芯片技术是一个快捷、高效、并行、高通量、微型化和自动化蛋白质分析技术。蛋白质芯片适合用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、蛋白质-小分子物质间相互作用分析。是功效基因组、蛋白质组研究领域中一个新型主要工具。62/81蛋白质芯片原理：采取机械点样或共价结合等方法将多肽、蛋白质、酶、抗原或抗体固定于固相载体上形成分子点阵，并将待测蛋白质与该芯片进行孵育反应，再将荧光标识蛋白质与芯片——蛋白质复合物反应。经过扫描系统检测个点荧光强度，分析蛋白质与蛋白质之间相互作用，由此到达测定蛋白功效目标。63/81蛋白质芯片分类蛋白质功效芯片

天然蛋白质点在基片上，用于蛋白活性及分子亲和性高通量平行分析。蛋白质检测芯片将高度亲和特异性探针分子（mAb）点在基片上，用以检测复杂样品中目标蛋白。64/81蛋白质芯片分类1.支持物表面高度密集排列探针蛋白点阵

微阵列微孔板测定时，特异性地捕捉样品中靶蛋白，然后经过检测系统对靶蛋白进行定性及定量分析。抗体为惯用探针蛋白。2.三维凝胶块芯片实质是在基片上点布以10000个微小PAGE胶块，主要用于筛选抗体抗原，酶动力学反应研究。优点：灵敏、蛋白结构天然65/81蛋白质芯片制备与分析载体探针蛋白制备探针固定检测66/81载体要求：稳定性，兼容性种类：化学膜尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚苯乙烯膜无需复杂表面处理背景高，灵敏度低PAGE胶储水环境——保持探针活性，除反应液困难微孔板性能良好，探针分隔良好——交叉污染程度低，液相——保持探针活性玻片为最正确载体需表面修饰（醛基、BSA、poly-lysine）高通量自动化效率高67/81探针制备种类：抗体、抗原、蛋白质、配体、受体、酶、核酸、多肽要求：亲和性强、特异性高。应用最广泛探针：抗体，抗原，尤其是mAb68/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探针蛋白制备蛋白质芯片上探针蛋白可选取抗体、抗原、受体、酶等含有生物活性蛋白质。单克隆抗体是比很好一个探针蛋白。69/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探针固定体外合成劣势多肽长度不易控制、探针活性位置点加法：手工点样接触式点样喷墨点样法固定后，需用BSA溶液封闭——提升特异性70/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedical