模式生物酵母菌省公开课金奖全国赛课一等奖微课获奖课件

模式生物--大肠杆菌、酵母菌张红霞1/36大肠杆菌介绍大肠杆菌（Escherichiacoli），是相对简单单细胞原核生物，全部DNA、RNA和蛋白质合成机器都包含在同一细胞器中，能够相对轻易培养和操作。2/36酵母菌介绍酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。假如说大肠杆菌是外源基因最成熟原核生物表示系统，则酵母菌是最成熟真核生物表示系统。3/36酿酒酵母（Sacharomycescerevisiae）是第一个最少在一万年前就能被人工培育真菌，是最简单真核生物，是由一个细胞组成独立生物个体，能在基本培养基上生长，易于培养和操作，被称为真核生物中“大肠杆菌”。早在1996年就完成了酿酒酵母基因组测序，这是人类第一次取得真核生物基因组完整核苷酸序列，被称为遗传学研究上一座里程碑。4/36大肠杆菌基因组大肠杆菌通常只有一条染色体，比高等生物基因组要小得多，而且含有较高基因密度（大约每1kb就有一个基因），没有内含子和极少有重复DNA，易于寻找和分析基因.5/36经过对酵母全基因组序列测定，其基因组大小约为12Mb，初步确定了5885个编码蛋白质基因，140个rRNA基因、275个tRNA基因，第一次揭示了一个真核生物全部基因数目和大致上功效分类.酵母基因组中有快要31％编码蛋白质或者含有开放阅读框，与哺乳动物编码蛋白质基因有高度同源性。酵母菌基因组6/36酵母与其它真核生物相比，它们基因组较小（约12Mb），基因数目也比较少（约5885）.与大肠杆菌类似，它们能够在试验室里快速繁殖，在理想条件下，每次细胞分裂大约90min，能够从单个细胞繁殖成克隆群体.酵母作为模式试验系统最主要优点是，酵母细胞不但简单，而且含有全部真核生物细胞主要特征，如含有一个独立细胞核、多条线性染色体包装成染色质、细胞质包含了全部细胞器（如线粒体）和含有细胞骨架结构（如肌动纤维蛋白）等.7/36大肠杆菌遗传学研究应用大肠杆菌生活周期很短，而且单个细胞能够很轻易取得一个遗传上同源细胞群体（克隆）.细菌是单倍体，这意味着即使是隐性突变，也能够表现出突变表型，同时细菌之间能够方便地进行遗传物质交换，细菌这些特征便于对其进行遗传学研究.8/36大肠杆菌作为生命科学研究模式系统，其主要优势是含有遗传交换系统.遗传交换使定位突变、构建含各种突变菌株、构建用来区分显性突变和隐性突变及进行顺反式分析部分双倍体菌株成为可能.这种遗传交换系统主要经过两种方式构建.9/36第一个方式是大肠杆菌经过性结合交换DNA，大肠杆菌育性质粒（F因子，F-factor）具备把本身从一个细胞转移到另一个细胞能力.F因子介导结合是一个复制过程，F+细胞转移一个拷贝F因子给F-细胞.有时，F因子整合到染色体中，就会引发寄主染色体经过接合向F-细胞转移.含有整合F因子菌株叫做Hfr菌株（高频重组菌株，Hfr

strain），这种材料对于进行遗传交换研究非常有用。10/36第二种方式是经过噬菌体介导转导，噬菌体成熟时有一部分噬菌体DNA被寄主DNA所取代，当噬菌体感染下一个细胞时，从以前寄主那里取得染色体DNA片段能够和被感染寄主染色体发生重组，造成遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞。11/36在酵母系统中，单倍体和双倍体细胞存在促进了酵母遗传分析.酵母在单倍体和二倍体状态下均能生长，并能在试验条件下较为方便地控制单倍体和二倍体之间相互转换，这种转换是经过交配（单倍体到双倍体）和孢子生成（双倍体到单倍体）来实现，这对其基因功效研究十分有利.比如，要想知道一个特定基因是否是细胞生长所必需，能够在单倍体里敲除这个基因，单倍体细胞只能承受非必需基因敲除。酵母菌遗传学研究应用12/36酵母中轻易对其基因组做准确人为突变，当把末端与基因组任何一个特定区域同源线性DNA引入到酵母细胞中，酵母基因组就会发生非常高同源重组，造成目标染色体序列被所用目标染色体片段所取代.如准确地删除整个基因编码区、改变单个特定密码子，甚至改变开启子中一个特定碱基对，这使得研究基因或其调控序列功效等详细问题变得比较轻易.13/36在20世纪60年代末，Hartwell、Hunt和Nurse便认识到用遗传学方法研究细胞周期可能性.Hartwell采取酿酒酵母细胞建立系统模型，经过一系列试验，分离出细胞周期基因发生突变酵母细胞，相继发觉了一系列与细胞周期调控相关CDC基因（celldivisioncyclegenes）。14/36一个被称为“START”基因对控制各个细胞周期最初阶段含有决定性作用.Nurse在Hartwell基础上，发觉了调整细胞周期一个关键物质CDK（细胞周期蛋白依赖激酶），并证实CDK是经过对其它蛋白质化学作用（磷酸化作用）来驱动细胞周期.鉴于利用酵母分子遗传学对细胞周期调控理论巨大贡献，Hunt、Hartwell和Nurse荣获了21世纪首届诺贝尔生理医学奖.15/36细胞生命活动中许多过程诸如酶催化代谢反应、信号转导、蛋白质修饰与加工、蛋白质转运等都表现为一个蛋白质与另一个蛋白质间相互作用.传统免疫印迹、Westernblot等方法极难满足对蛋白质分子之间相互作用这一动态过程研究需要.利用酵母转录因子特点，Fields和Song于1989年创建了一个非常简便而有效研究蛋白质相互作用方法———酵母双杂交系统。16/36酵母双杂交系统最突出特点是能够在酵母这种生长快速且易操作体系中研究真核细胞蛋白质-蛋白质相互作用，而且还可经过cDNA文库筛选直接找到与未知蛋白质相互作用蛋白质基因。17/36近年来为了适应更广泛用途，在原有酵母双杂交系统基础上发展了大量衍生系统，如蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系统、小配体三杂交系统、RNA三杂交系统等类型.另外，还出现了为研究膜蛋白相互作用而改进SOS富集系统（SOSrecruitmentsystem，SRS），在该系统中，蛋白质之间相互作用被人为限制在酵母细胞膜上。18/36应用19/36利用重组大肠杆菌生产人胰岛素1982年，美国ElyLiLi企业首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市基因工程药品。由基因工程菌合成重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区分，而且还含有没有免疫原性、注射吸收快速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中巨大潜力。20/36大肠杆菌作为表示外源基因受体菌特征大肠杆菌表示外源基因优势21/36大肠杆菌作为表示外源基因受体菌特征大肠杆菌表示外源基因劣势22/36蓝白斑筛选23/36筛选原理

野生型大肠杆菌产生β-半乳糖苷酶能够将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色物质5-溴-4-靛蓝。有色物质能够使整个培养菌落产生颜色改变，而颜色改变是判定和筛选最直观有效方法。24/36工程菌及载体基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺点型菌株。这种宿主菌染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶基因突变，造成其编码β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸短肽（即α肽链），从而不含有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选载体含有一段称为lacz'基因，lacz'中包含：一段β-半乳糖苷酶开启子；编码α肽链区段；一个多克隆位点(MCS)。25/36α-互补缺点株基因无法单独编码有活性β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'质粒后，质粒lacz'基因编码α肽链和菌株基因组表示Ｎ端缺点β-半乳糖苷酶突变体互补，含有与完整β-半乳糖苷酶相同作用X-gal生成蓝色物质能力，这种现象即α-互补。26/36

操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中β-半乳糖苷酶开启子，在含有X-gal固体平板培养基中菌落展现蓝色。以上是携带空载体菌株产生表型。当外源DNA（即目标片段）与含lacz'载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表示α肽链，将它导入宿主缺点菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中X-gal产生蓝色，培养表型即展现白色菌落。27/36

试验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用。含X-gal平板培养基中同时含有一个或各种载体所携带抗性相对应抗生素，这么，一次筛选能够判断出：未转化菌不含有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒菌，即目标重组菌，长成白色菌落。28/36酵母基因工程利用重组酵母生产乙肝疫苗由乙型肝炎病毒（HBV）感染引发急慢性乙型肝炎是一个严重传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。当前对乙型肝炎病毒还没有一个有效治疗药品，所以高纯度乙型疫苗生产对预防病毒感染含有重大社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠确保。29/36产乙肝表面抗原重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母构建PARS2BglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1BglIIpBSAG15111kbBglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1his+转化子重组分子转化his-受体细胞染色体DNA30/36

重组菌首先在含有甘油培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲醇诱导乙肝病毒表面抗原多肽（HBsAg）表示，最终S蛋白产量可达细胞可溶性蛋白总量3%在大规模生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L发酵罐中培养，最终可取得90克22nmHBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。31/36

酵母菌作为表示外源基因受体菌特征