生物指示剂的选择省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

序言确保产品无菌是注射剂产品质量确保关键问题。在业界，惯用“无菌确保水平”（SterilityAssuranceLevel,SAL）概念来评价灭菌（无菌）工艺效果，SAL定义为产品经灭菌/除菌后微生物残余概率。为了确保注射剂无菌安全性，国际上一致要求，采取湿热灭菌法SAL不得大于10-6，即灭菌后微生物存活概率不得大于百万分之一。微生物挑战试验（灭菌效力验证）是无菌药品生产工艺验证主要步骤，目标是证实灭菌后微生物残余概率小于10-6。第1页法规要求CHP附录ⅩⅦ灭菌法中包括生物指示剂相关要求制备生物指示剂用微生物基本要求：(1)菌种耐受性应大于需灭菌产品中全部可能污染菌耐受性。(2)菌种应无致病性。(3)菌株应稳定。存活期长，易于保留。(4)易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90％以上。第2页法规要求依据新版GMP征求意见稿内对生物指示剂说明“应按供给商要求保留和使用生物指示剂，并经过阳性对照和D值测试来确认其质量”。第3页法规要求《化学药品注射剂和多组分生化药注射剂基本技术要求》中提到“微生物挑战试验所用生物指示剂耐热性及数量应对灭菌工艺组成必要挑战，生物指示剂耐热性应大于产品中常见污染菌耐热性。采取过分杀灭法（F0≥12）灭菌工艺，可不进行微生物挑战试验。”第4页法规要求CHP附录ⅩⅦ灭菌法中包括生物指示剂相关要求生物指示剂应用：在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭菌条件下D值，并测定孢子纯度和数量。验证时，生物指示剂微生物用量应比日常检出微生物污染量大，耐受性强，以确保灭菌程序有更大安全性。第5页推荐使用生物指示剂03版验证指南中列出湿热灭菌工艺中惯用生物指示剂菌种名称常规D121℃值/min嗜热脂肪芽孢杆菌1.5～3.0枯草芽孢杆菌0.3～0.7凝结芽孢杆菌0.4～0.8梭状芽孢杆菌0.4～0.8CHP版中列出湿热灭菌工艺中惯用生物指示剂嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)。D值为1.5～3.0min，每片(或每瓶)活孢子数5×105～5×106

个，在121℃、19min下应被完全杀灭。另外，还可使用生孢梭菌孢子（如NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955)，D值为0.4～0.8min。第6页生物指示剂菌种选择08年年度回顾，车间洁净区最耐热菌株D100℃值为14.2，09年年度回顾，车间洁净区最耐热菌株D100℃值为16.7。连续两年，车间洁净区最耐热菌株D100℃值最高为16.7，换算成D121℃约为0.12。所以，我们应该选择D121℃值比0.12大菌株。因为菌株D值受介质影响，所以，我们需要测定在各介质中实际D值，确保生物指示剂适合我们企业使用。第7页生物指示剂菌液浓度计算（阴性分数法）假设F0=8，用D121℃=0.7枯草芽孢杆菌计算：SLRbi=F0/Dbi=11.43（SLR为孢子对数下降值）SLRbi=lgN0-lgN（N0和N分别为灭菌前后孢子数）依据阴性分数法，N=2.303×lg(n/q)，其中n为挑战性试验样品总数，q为试验结果呈阴性瓶数。如试验结果20瓶挑战瓶均呈阴性，在计算时可假设只有19只瓶呈阴性（因为q=n，lg(n/q)=0，代入公式SLRbi=lgN0-lgN时，数学式无意义），则可得出：N=2.303×lg(n/q)=0.0513lgN=-1.29lgN0=SLRbi+lgN=11.43-1.29=10.14N0=1010.14=1.4×1010(cfu/瓶)第8页生物指示剂菌液浓度计算（残余曲线法）假设F0=8，用D121℃=0.7枯草芽孢杆菌计算：F0/Dbi=lgN0+1=11.43lgN0=10.43N0=1010.43=2.7×1010(cfu/瓶)第9页生物指示剂菌液浓度计算经过以上2种方法计算得出，用孢子浓度为1010(cfu/瓶)D121℃=0.7枯草芽孢杆菌样品来验证，灭菌后样品为无菌，说明灭菌条件到达F0值大于等于8。第10页无菌确保水平计算SLRS=SLRbi×Dbi/DS=66.68（SLRbi为生物指示剂孢子对数下降值，SLRS为灭菌前产品中污染微生物对数下降值）SLRS=lgN0-lgN车间中控微生物标准为＜10cfu/瓶，所以假设N0为10。lgN=lgN0-SLRS=1-66.68=-65.68N=10-65.68，无菌确保度为10-65.68，远大于要求10-6第11页生物指示剂菌液浓度计算若选取D值更高嗜热脂肪芽孢杆菌计算：(D121℃=1.6)阴性分数法：lgN0=SLRbi+lgN=F0/Dbi-1.29=8/1.6-1.29=3.17N0=103.17=1.5×103(cfu/瓶)残余曲线法：F0/Dbi=lgN0+1=5lgN0=4N0=104(cfu/瓶)无菌确保水平计算：SLRS=SLRbi×Dbi/DS=66.66lgN=lgN0-SLRS=1-66.66=-65.66N=10-65.68，无菌确保度为10