抗原抗体反应的应用免疫学导论

关于抗原抗体反应的应用免疫学导论免疫沉淀和免疫凝集

免疫沉淀和免疫凝集利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量或质的测定分析是最经典的血清学方法。第2页,共59页，2024年2月25日，星期天溶液中的沉淀反应在体外，当抗体与相应抗原二者浓度比例适当时，会发生免疫沉淀反应，可用于抗原或抗体的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于判断，即环状沉淀试验。第3页,共59页，2024年2月25日，星期天第4页,共59页，2024年2月25日，星期天环状沉淀试验原理将抗原溶液叠加在细小玻璃管中抗体溶液上面，抗原与抗体在两液交界面处特异性结合，形成白色沉淀环

。【评价】：简便快速只能定性敏感性低第5页,共59页，2024年2月25日，星期天凝胶中沉淀反应抗原分子和抗体分子在凝胶介质中自由扩散形成梯度浓度，抗原与抗体在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀线。可用于测定抗原与抗体的相对浓度，也可用于比较不同抗原的特异性、纯度及相互关系。主要有两种方法：单向免疫扩散、双向免疫扩散第6页,共59页，2024年2月25日，星期天单向免疫扩散基本原理

待测抗原从局部含有相应定量抗体的凝胶内自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合，在二者比例合适的部位，形成白色沉淀环，沉淀环大小与抗原的浓度成正相关。

第7页,共59页，2024年2月25日，星期天方法：将适当浓度的抗体混于琼脂（0.8%~1%）中，琼脂凝固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔开始向周围扩散，并在小孔周围合适的位置形成沉淀。沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。单向免疫扩散第8页,共59页，2024年2月25日，星期天❤影响因素1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关

2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊

3.抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环小

4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长

5.扩散温度：4～37℃内温度与扩散速度正相关

6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关第9页,共59页，2024年2月25日，星期天双向免疫扩散【原理】：将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成沉淀线。第10页,共59页，2024年2月25日，星期天染色标本图1.抗原抗体双向自由扩散2.24小时出结果3.呈现沉淀线或弧模拟图第11页,共59页，2024年2月25日，星期天结果分析：抗原或抗体是否存在；抗原或抗体的纯度：若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线。抗原或抗体相对浓度：抗原浓度越高，形成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越高，形成的沉淀线距抗体孔越远；抗原或抗体相对分子量：抗原或抗体在琼脂内的扩散受分子量影响，分子量大者扩散速度慢，扩散圈小，局部浓度高，因此形成的沉淀圈弯向分子量大的一方，若二者分子量相等，则沉淀线呈直线；第12页,共59页，2024年2月25日，星期天抗原性质：观察两个邻近孔的抗原与抗体所形成的两条线是交叉抑或相连，可用来判断该两抗原是否有共同成分。同样的纯抗原a放在两个邻近的孔中，对应抗体放在中央孔中，两条沉淀线在其相邻的末端会互相连接和融合；若两个不同的抗原a和b，则两线互相交叉；若两个抗原有部分相同成分a和ab，则两线除有相连部分以外还有一伸出部分。滴定抗体效价：固定抗原浓度，稀释抗体，出现沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。第13页,共59页，2024年2月25日，星期天抗原、抗体相对分子量Ag分子量大于AbAb分子量大于AgAg分子量等于Ab第14页,共59页，2024年2月25日，星期天抗原决定簇部分相同抗原决定簇完全相同抗原性质分析两个抗原的抗原决定簇完全不同第15页,共59页，2024年2月25日，星期天双向琼脂扩散试验的应用1.检测未知抗原或抗体2.抗原性质分析3.抗体效价滴定4.抗原或抗体纯度鉴定第16页,共59页，2024年2月25日，星期天电泳条件下的沉淀反应免疫电泳是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离的特性与免疫扩散结合进行分析的方法。原理：混合的蛋白质抗原在ＰＨ８．６时带负电荷，在电场的作用下，由负极向正极迁移，使混合的抗原组分得以分离。抗体可以通过自由扩散，也可以通过电泳与分离的抗原形成相应的特异性沉淀线，从而提高免疫沉淀的灵敏度。常用的免疫方法有：血清免疫电泳、火箭电泳和对流免疫电泳第17页,共59页，2024年2月25日，星期天血清免疫电泳将患者血清和正常人血清分别放在凝胶上近负极端的小孔中进行电泳分离后，在两中抗原之间沿电泳方向挖一条平行的小槽，加入抗血清进行双扩散。第18页,共59页，2024年2月25日，星期天-+免疫电泳示意图第19页,共59页，2024年2月25日，星期天根据沉淀线的位置及粗细，可分析样品中的抗原含量；根据蛋白质的电泳迁移率，免疫特性及其它特性，可以确定该复合物中含有某种蛋白质。第20页,共59页，2024年2月25日，星期天火箭电泳

将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。

原理：电泳时，含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与样本中的抗原浓度呈正相关。第21页,共59页，2024年2月25日，星期天第22页,共59页，2024年2月25日，星期天注意要点：选择无电渗或电渗很小的琼脂糖，否则火箭形状不规则；若火箭顶部形状呈不清晰的云雾状，提示电泳时间不够，未到达终点；作IgG定量时，由于琼脂中的抗IgG抗体也是IgG，免疫反应中的抗原抗体性质相同，由于电渗作用影响了待测IgG的泳动，火箭峰呈纺锤状。为了抵消电渗作用，可用甲醛使样本IgG上的氨基甲酰化，使本来带两性电荷的IgG只带负电荷，加快泳动速度，出现伸向阳极的火箭峰。火箭电泳的检测灵敏度在μg/ml水平。可采用竞争法放射自显影技术来进行火箭免疫电泳，灵敏度可达ng/ml。第23页,共59页，2024年2月25日，星期天对流免疫电泳在pH8.6的琼脂凝胶中，大部分蛋白质抗原在碱性溶液中带负电荷，且分子较小，电泳时，泳向正极。

抗体带弱负电荷，但分子量大，电泳力小于电渗力，泳向负极。

抗原和抗体相遇，比例合适时形成肉眼可见的沉淀线。第24页,共59页，2024年2月25日，星期天AgAb-+1.Ag阳性2.Ag弱阳性3.Ag强阳性4.Ag强阳性对流免疫电泳示意图第25页,共59页，2024年2月25日，星期天免疫共沉淀在溶液中两种或两种以上蛋白质相互作用，可以通过免疫共沉淀惊醒鉴定和分离。蛋白质相互作用通过非共价结合，用针对其中一种蛋白质的特异性抗体进行的免疫沉淀，与该蛋白相互作用的其他蛋白也同时被沉淀下来。如果第一抗体结合后再加入第二抗体或A蛋白可使抗原抗体形成更大的复合物易于沉淀，也可通过加入聚乙二醇破坏水化膜加速沉淀形成。第26页,共59页，2024年2月25日，星期天免疫共沉淀原理图解第27页,共59页，2024年2月25日，星期天关键因素1.抗原的丰富度2.抗体的结合能力3.蛋白质和抗体的可接触性第28页,共59页，2024年2月25日，星期天免疫凝集

大颗粒性抗原如细胞或细菌等与相应的抗体结合后能使康媛颗粒发生凝集，形成肉眼易见的凝集小块，即为免疫凝集。凝集反应的发生分为两个阶段：1、抗原抗体的特异性结合阶段；2、出现肉眼可见的凝集现象。第29页,共59页，2024年2月25日，星期天最常见的免疫凝集反应是红细胞凝集，即血凝反应。血凝反应的抗体识别的抗原可以是红细胞表面的天然抗原，如血凝鉴定试验；也可以通过交联将红细胞连接上其他抗原，如早期的HBsAg血凝试验。第30页,共59页，2024年2月25日，星期天细菌的血凝试验常用来对细菌进行鉴定与分型，如沙门菌鞭毛抗原的分析等。免疫凝集试验虽然简便，但是受反应灵敏度的限制，在实际应用越来越少。第31页,共59页，2024年2月25日，星期天女科学家R.Yalow（美,1921~）1950’末发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖1.基本原理（1）竞争结合分析：Ag+AbAgAb*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2.常用标记核素：（1）125I：γ射线，半衰期60天（2）3H：β射线，半衰期12.3年3.测量仪器（1）γ计数仪（2）β液闪仪免疫标记一、放射免疫分析（RIA）第32页,共59页，2024年2月25日，星期天一、放射免疫分析（RIA）基本原理采用定量的标记抗原（Ag＋）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。采用定量的标记抗原（Ag＋）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应第33页,共59页，2024年2月25日，星期天4.基本试剂（1）标准品与质控品a.

意义：放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据b.

要求：化学结构上——与待测物有相同的化学结构化学纯度上——对竞争反应有干扰的杂质的含量低含量准确注意不变质与降解：在运输、保存时尤应注意；注意有效期c.

种类：国际标准、国家标准、企业标准第34页,共59页，2024年2月25日，星期天（2）标记物a.对标记物的要求比活度高：即单位物质的放射性强度高生物活性及免疫活性与标记前改变小

放射化学纯度高：应>95%稳定性好：标记的同位素不易脱落第35页,共59页，2024年2月25日，星期天b.

标记方法：氯胺-T法：最常用的125I标记法，I与酪氨酸共价结合，方法简便，但易造成蛋白质的损伤乳过氧化酶法：

Iodogen（氯甘脲）法：固相法，标记率较高，损伤小，反应时间长置换法：3H最常用c.标记产物的纯化：常用Sephadex层析，也可用硅胶G薄板层析或HPLC分离d.标记产物的鉴定：常用RIA法最大结合百分率标准曲线比较法e.半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（BSA），再对载体作标记第36页,共59页，2024年2月25日，星期天（3）特异性结合抗体a.

对特异性结合抗体的要求：亲和力（affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力，用K值表示，反映灵敏度特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的结合能力（交叉反应）低滴度（效价）高：指结合50%标记抗原时抗体的稀释度高稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定b.

抗体的制备选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊

应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油+卡介苗）选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数第37页,共59页，2024年2月25日，星期天

c.抗体的纯化去除杂抗体：用抗原吸附法提取特异性IgG：先用盐析法粗提，再用离子交换层析或亲和层析纯化d.抗体的鉴定鉴定内容：效价、亲和力、特异性鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、RIAe.单克隆抗体的使用：用于IRMA或RIA，特异性高不一定优于传统的多克隆抗体第38页,共59页，2024年2月25日，星期天非放射性免疫标记方法由于比放射性标记更为简便，同时又保持了灵敏快速的特点而得到了发展，其中酶标记免疫试验是广泛使用的方法。用于标记酶的种类也越来越多，常用的有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和脲酶。酶联免疫吸附试验第39页,共59页，2024年2月25日，星期天酶免疫试验法有两类：1.均相法：抗原与抗体反应后，不必将游离的与结合的抗原抗体分离，就可测定被测分子的含量。固相法：将抗原抗体吸附在固相表面，抗原抗体反应后，将固相与液相分离出去游离的抗原抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物，即酶联免疫吸附试验(ELISA).第40页,共59页，2024年2月25日，星期天ELISA有直接发、间接法及夹心法等不同反应方式直接法第41页,共59页，2024年2月25日，星期天间接法第42页,共59页，2024年2月25日，星期天夹心法第43页,共59页，2024年2月25日，星期天特点：非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇

第44页,共59页，2024年2月25日，星期天荧光与发光免疫分析用于标记抗体的荧光化合物有异硫氰荧光素（FITC）和罗丹明荧光素等。目前较好的是时间分辨荧光免疫分析法（TrFIA），提高了免疫分析技术的灵敏度和特异性。第45页,共59页，2024年2月25日，星期天直接法优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。第46页,共59页，2024年2月25日，星期天间接法优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。第47页,共59页，2024年2月25日，星期天亲和标记免疫分析金黄色葡萄球菌的A蛋白与IgGFc段有高度的亲和力。用酶、同位素、荧光素等标记A蛋白，替代第二抗体直接与抗体结合，可用于抗原抗体反应的分析。第48页,共59页，2024年2月25日，星期天免疫定位分析免疫荧光定位分析：常用的荧光素异硫氰荧光素和异硫氰四甲基罗丹明等具有特殊的激发波长和发射波长。用荧光抗体鉴别淋巴细胞亚群，尤其是CD4+T细胞核CD8+T细胞亚群，在临床上有重要意义。第49页,共59页，2024年2月25日，星期天抗原抗体反应的其他应用免疫亲和色谱

原理：利用抗原与抗体的高亲和力、高专一性和可结合的特点以及色谱技术的差速迁移理论而建立的一种新型色谱技术。就是将被测物的特异性抗体固定在适当的固相载体上，制备成免疫亲和色谱的固定相（免疫亲和色谱柱），根据被测物的反应原性、抗原抗体结合的特异性记忆，抗原抗体复合物在一定条件下能够可逆解离的特性进行色谱分离。第50页,共59页，2024年2月25日，星期天一种高效、简便的样品前处理技术，大大简化了提取、净化、衍生化等复杂的前处理过程，在食品分析中属于痕量检测，检测线非常低（达10-12数量级）。生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲和作用。第51页,共59页，2024年2月25日，星期天影响亲和作用的因素1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失第52页,共59页，2024年2月25日，星期天免疫亲和色谱的特点选择性，专属性强因为IAC是利用抗原抗体的特异性反应，所以只