实验一植物原生质体的分离和培养一教学目标了解植物原生质

实验一植物原生质体的分离和培养一教学目标了解植物原生质DocumentnumberBGCG57-BTDO-0089-2022分离和培养解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解握分离和培养原生质体的技性的检测方法。掌握细胞计和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活五．教学内容:protoplast胞壁后,是开展基础研用的技术,其原理是、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除。由于原生质体内的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应的种类和纯度、酶液种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用于受到酯酶分解而产生能自由出入原的细胞能产生荧光,无活力数。分都可以通过酶解作用去除细胞壁实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对鲜嫩，又具有色素标记，是该实验中较好的1．把叶片(或花期短的花瓣)洗净，把表面水吸干。(2人一组)ml离心管的盖打下1圆片。圆片扣压于3．28~30℃保温酶解2~6h(放培养箱中)；镜检叶肉细胞原生质体。用Lml液.以600rpm离心10mL蔗糖溶液和上部氯化钙液。少许9．加MS培养液液,轻轻混匀,用血球计数板计数细胞密度,片，常用的改良牛氏(Improved-eubauer各有一计数室，两计数室结构完全相同。计数低0.1毫米。因此，放上盖玻片时，计数板与其间0.1毫米(图8-1)。在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成9个边长为1毫米的大方格。四角的大方格又各分为16个中方格，这是用来计数白细胞的。中央大方格被划分为25个中方格，每一中方格又划分成16个小方格(图8－2称25×16=400小方格，也有的计数板为16×25=400格的，小方格面积一致)。中央大方格的四角及中心5个中方格(16×25者。：将置水浴锅中预热到41~42℃，取Ⅰ液1mL于试管中，用吸血管加入新鲜鸡血(或肝素抗凝血)20霯，再加入Ⅱ液1mL混匀，置该水浴锅中保温50s左右，置平的显微镜载物台上，盖轻置于盖玻片边缘外，让管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜(图8－3)。静置2min后计数，先。计数时用虹彩、集光器、反光镜等调节认清至下，由左至右，顺序如弓”的顺序，对压边线细胞采取“数上不数下，数左不数右”的原则(图8~4)。依次计数并记录5个中方格中分别有多少个红细胞。悬液，充液要连续、适量，充液后应管等用过后必须立即按要求洗细胞膜的通透性观察实验目的原理渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压实验用品50ml烧杯,试管(1~10cm),10ml移液管,试管架。法ml和10份L氯化钠，形成一种不透ml再加入1ml稀释羊血，注意观察溶液颜色渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100%红细L0ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注血现象为什么L0ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注血现象为什么进行同样实验。步骤同2。验结果细胞骨架的观察原理TritonX00处理但细胞骨架系统的蛋R质染料，处理后以见到一种网状Rg0ml无水乙醇中，加冰醋酸35ml.再加蒸馏至500ml.2.吸去磷酸缓冲液，用1％TritonX—100处理20min。3.吸去TritonX—100，用M缓冲液洗3次,每次5min。30min。5.磷酸缓冲液(pH6．8)洗3次，每次5min。6.0.2%考马斯亮蓝R250染色10min。样品置于载玻片上,加盖玻片，于普通光学显微min品平展于载玻片上，加实验四、线粒体和液泡系的超活染色与观察或组织特异性着色但对活样品又体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞活体染色与体外活体染色两类。体外活体染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(JanusgreenB红(neutralred体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系实验目的原理，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很种染色方法。詹纳斯绿B专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是实验用品镊子、双面刀片、解剖盘．载玻(1)Ringer溶液：g动物用0.65g)l(2)10%、1/3000中性红溶液：g50mlRinger液，稍加热溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易中性红溶液1ml，加入r(3)1%、1/5000詹纳斯绿B溶液mgB5mlRinger30~40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%lRinger00工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持法温水浴锅的金属板上↓B染液↓刮取上皮细胞↓玻片的染液滴中↓lmin燥，必要时可再加滴染液)↓下观察色5~10min。↓↓轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观验结果尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液(1).绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布(2).绘蟾蜍胸骨剑突软骨细胞示液泡系的形态与分布五叶绿体的分离与荧光观察叶绿体中进行的,。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用实验目的2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,原理等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离大小、密度先后分批沉降min核)。分离过程最的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间,在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片实验用品ml个,250ml量筒1个,滴管20支,法g0mlL000r/min)匀桨3~5min。lr/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即不叶绿体(混有，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显滴滴在吖啶橙荧光染料,。切削出一斜面置于载玻片上，滴加1~2l验结果绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则