【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种

第二章发酵工业菌种本章内容

第一节、常用的工业微生物第二节、发酵工业菌种的别离筛选第三节、发酵工业菌种的鉴定和保藏第四节、发酵工业菌种的育种第一节

最常用的工业微生物一、细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌生产各种酶制剂、有机酸、氨基酸、肌苷酸等二、放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌生产多种抗生素〔60%以上〕三、酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属用于酿酒、制造面包、生产脂肪酸、生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。四、霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌：点青霉、产黄青霉桔青霉根霉属德氏根霉米根霉、小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉生产酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等五、未培养微生物定义：指迄今所采用的微生物纯培养别离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99％。研究方法模拟自然培养法:模拟微生物生长的自然环境对未培养微生物进行可培养研究。原位培养、培养条件优化、单细胞微操作宏基因组分析法：直接依据基因或基因组、蛋白质序列及其调控表达机制构建高效表达的工程菌等途径进行开发利用。即通过未培养微生物的宏基因组分析来利用未培养微生物的基因资源。第二节

发酵工业菌种别离和筛选一、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购置；从大自然中别离筛选新的微生物菌种。从自然界筛选制定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。预处理：提高菌种别离的效率富集培养：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。别离：利用别离技术得到纯种。菌种的筛选：通过常规生产性能测定，进一步筛选产物合成能力较高的菌株。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。菌种保藏二、新种别离与筛选的步骤1.采样〔1〕采样原那么广泛性充分了解目标微生物的性质〔种类、生理特征等〕如根据微生物的营养类型：纤维素酶产生菌——森林土壤蛋白酶和脂肪酶产生菌——肉类加工厂和饭店潲水沟中的污水、污泥利用碳氢化合物为碳源的菌株——油田附近极端菌的筛选要根据其特殊的生理特征：高温酶产生菌——南方、温泉、火山爆发处及北方的肥堆耐压菌——油井或海洋深处〔有机质丰富、通气保水性能好〕(2)采样对象土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：有机质含量和通风状况耕地、菜园山坡上的森林沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地取样的土层深度：5-25cm——细菌、放线菌〔有机质丰富、阴暗潮湿〕——霉菌、酵母菌——微生物少1.采样1.采样土壤的酸碱度偏碱——细菌、放线菌偏酸——霉菌、酵母菌土壤的植被状况葡萄成熟时——根部酵母菌增多地理条件南方土壤比北方土壤微生物含量多季节条件秋季菜土样最理想2.样品的预处理〔1〕物理方法热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高从而增加目的菌的比例。膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。离心法：同上。〔2〕化学法通过培养基中添加某些化学成分来增加微生物的数量。如：用添加CaCO3稳定培养基的PH来别离嗜碱性的放线菌。〔3〕诱饵法将某些固体物质如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等加到别离的土壤或水中做成诱饵富集目的菌，待菌落长出后再进行别离。3.富集培养富集培养利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的不同要求，如温度、PH、渗透压、溶氧浓度、碳源和氮源类型及浓度等，使目的微生物在最适宜条件下迅速繁殖，数量增加，成为人工环境下的优势种。3.富集培养富集培养的策略〔1〕控制培养基的营养成分用促进某特定微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。可用抑制其他微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种别离就会顺利得多。3.富集培养富集培养的策略〔2〕控制培养条件溶氧浓度——好氧/厌氧高温——嗜热微生物/非嗜热微生物PH——嗜酸性/嗜碱性4.菌种别离平板划线别离法稀释别离法毛细管别离法小滴别离法稀释别离法

稀释倒平板法

平板涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释别离平板。划线别离法——平板划线法别离方法的选择根据目的菌有无选择性特征来选择别离方法菌种的营养特征独特生长特征独特无选择性特征根据产物的特征进行随机别离选择性别离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。选择性别离自然界中细菌的别离

(一)采样和采集方法为了从一特定生态系统中别离出具有代表性的细菌菌群，特别是别离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。采样的本卷须知1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。1．土样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这局部上却为根际土样。2．植物体采集方法在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、平安刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。

3．水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下翻开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。(二)生态学参数及培养基的组成原那么1、参加培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布别离样本的溶剂都会影响实验中所要别离的细菌的数量和种类。2、就别离培养基的组成而言，局部培养基中必须含有10-50%的天然提取物。参加培养基中的天然提取物，局部培养基中那么应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。3、所有别离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50μg／m1，以抑制真菌的生长。4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、2天。5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。土中细菌的富集培养与别离别离土样中的大局部细菌的别离程序中无需进行富集。但对某些少数细菌那么要求特殊的富集或选择技术才能很好地被别离培养。富集方法运用细菌的酶诱导性，在别离培养基中添加假设干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起假设干富集技术。富集可以促进抗性的产生并维持下来。土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。植物体上细菌的别离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。水中细菌的别离：水样通过0.22μm无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印别离法。水中细菌别离的简易富集技术在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜别离琼脂平板上；在不同水体的水样中参加一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。培养过程中可参加低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。次代培养及纯化步骤1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，那么按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟别离琼脂平板上进行筛选。细菌别离：以乳酸菌为例放线菌的别离(一)采样菜园土或林地土自然风干，备用土壤中放线菌最丰富，品种齐全。可以筛选新的放线菌。从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可别离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中别离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。气生孢子能耐枯燥，耐湿热能力高于营养体，室温保存20天，放线菌的数量和组成变化不大，细菌大局部死亡。

〔1〕取体积为300ml的高氏一号培养基，参加0.1%的重铬酸钾15mL，使之终浓度为50ppm，摇匀，倒平板，待用。〔2〕取土样5g，摊平于大号培养皿上，在恒温枯燥箱中120℃干热处理1h。〔3〕土样热处理后，参加装有45mL无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，参加0.5mL的笨酚，室温下振荡30分钟，静止5分钟，取上清液用无菌水稀释10倍。同时另取土样5g，不加热和笨酚处理，余步骤同上，作为对照。〔4〕用移液管分别吸取原液和10倍稀释液各0.1ml标志稀释倍数的平板上，涂抹均匀，倒置，28℃培养。〔5〕培养10~14d，观察比较不同处理方法的生长情况、菌落特征。挑取红色，无气生菌丝的小菌落以及其它菌落形态菌株接种斜面，进一步用于形态观察和鉴定。放线菌别离操作步骤培养基添加重铬酸钾的方法减少细菌和真菌的数量用干热和苯酚处理减少链霉菌数量真菌别离真菌别离1、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，别离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的别离。3、有时真菌子实体形成必须有光线，这在别离培养时应加以考虑。4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于别离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集别离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在别离培养基中参加一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。真菌的别离方法土中真菌的别离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。植物材料中真菌的别离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。水中真菌的别离：水样稀释后涂布别离。饵诱技术常用于水中真菌的富集。子实体直接别离培养担子菌：新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基外表放一小块无菌滤纸上培养。真菌的别离筛选：以啤酒酵母的别离为例

取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7稀释别离法取0.1ml参加固体培养基铺平皿〔×2〕

在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h形态筛选根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用

纯化，采用平板别离法进一步纯化，至少反复三次

①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定性能测定③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定随机别离原理与技术从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机别离的菌落中筛选出所需的目的菌。技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法确实定。随机别离技术举例药理活性化合物产生菌的筛选

药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而到达治疗的目的。筛选模型：目标酶生长因子产生菌的筛选筛选模型：营养缺陷型试验菌筛选方法：利用被别离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长氨

基

酸

产

生

菌

的

筛

选

样品

预处理

初筛〔除真菌〕

在别离平板上生长获得多个单菌落复印平板〔copy法〕 平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸u.v线杀死长好的菌落

产氨基酸菌落周围有生长圈

目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定筛选产物含量高的菌株对应到copy前相应位置，找到目的菌落复印平板法：首先在完全培养基琼脂平板上制备密度适当的菌落，然后把平板上的菌落转移到丝绒上，丝绒绷在一个圆柱的光滑顶面上〔圆柱的直径应比培养皿稍小〕，再把它当作印章，复印在不含营养物的合成培养基琼脂平板上。生长圈法通常用于别离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物质的平板上进行培养，假设某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。多糖产生菌的筛选取样特点：碳水化合物工业的废弃物筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。毒性试验自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分留神，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。第三节

发酵工业菌种的育种一、工业菌种的育种方针工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。在生物进化过程中，微生物细胞形成了愈来愈完善的代谢调节机制，在代谢繁殖过程中，能量的利用以及对细胞生长繁殖过程中所需的各种物质的形成是非常合理和经济的，细胞经常处于平衡生长状态，不会有代谢产物的积累。 一、菌种的代谢生理与分子生物学14现代发酵工业要研究的主要内容就是通过改变培养条件和遗传特性，使微生物的代谢途径改变或代谢调节失控而获得某一发酵产物的过量产生。其方法大体可分为两类：–改变产生菌的基因型而改变代谢途径；–改变控制代谢速率，即影响基因型的表达15代谢调节(regulationofmetablism〕是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。酶量的调节酶活性的调节1616微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制，以期按照人们的愿望，生产有用的微生物制品。542.4.1.1初级代谢和次级代谢的调节产能代谢的调节：能荷调节(EnergyChargeRegulation)核蛋白体合成的调节〔RegulationofRibosomeSynthesis〕氨基酸、核苷酸合成代谢的调节〔Regulationofaminoacidsandnucleotidemetabolism〕2.4.1.1初级代谢调节和次级代谢调节58初级代谢对次级代谢的调节•许屡次级代谢产物的根本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切关系的。因此次级代谢必然会受到初级代谢的调节。•例如青霉素的合成会受到赖氨酸的强烈抑制，而赖氨酸合成的前体α-氨基己二酸可以缓解赖氨酸的抑制作用，并能刺激青霉素的合成。这是因为α-氨基己二酸是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。如果赖氨酸过量，它就会抑制这个反响途径中的第一个酶，减少α-氨基己二酸的产量，从而进一步影响青霉素的合成。59碳源代谢产物的调节•碳分解代谢产物调节指能迅速被利用的碳源(葡萄 糖)或其分解代谢产物，对其他代谢中的酶(包括分 解酶和合成酶)的调节。分为分解产物阻遏和抑制 两种。•葡萄糖是菌体生长良好的碳源和能源，但对 青霉素、头孢菌素、卡那霉素、新霉素、丝 裂霉素等都有明显降低产量的作用。6060氮代谢物的调节作用•在次级代谢中，氮分解代谢产物调节，即被 迅速利用的氮源(氨)抑制作用于含底物的酶 (蛋白酶、硝酸盐复原酶、酰胺酶、脲酶、 组氨酸酶)的合成。在次级代谢中，其阻遏 作用也确实存在。在抗生素生产中使用黄豆 饼粉就是由于它缓慢分解成有阻遏作用的氨 基酸和氨，防止或减弱氮分解代谢产物阻遏 作用的结果。6161磷酸盐的调节•磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节抗生素生物合成的重要参数。其机制按效应剂说有直接作用，即磷酸盐自身影响抗生素合成，和间接作用，即磷酸盐调节胞内其他效应剂(如ATP、腺苷酸能量负荷和cAMP)，进而影响抗生素合成。•已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多烯大环内酯等32种抗生素的合成产生阻抑作用。3030(二)酶合成的调节•酶合成的诱导•酶合成的阻遏31311，酶合成的诱导酶合成的调节32322，酶合成诱导的机制酶合成的调节33333，酶合成的阻遏酶合成的调节34344，酶合成阻遏的机制酶合成的调节35352.4.1.3酶活性的调节概念酶活性调节是指一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反响的速率。影响因素底物和产物的性质和浓度环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等)其他的酶的存在调节方式激活已有酶的活性抑制已有酶的活性〔一〕激活激活：在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性的现象。代谢调节的激活作用：主要是指代谢物对酶的激活。前〔体〕馈激活，指代谢途径中后面的酶促反响，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。代谢中间产物的反响激活，指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用酶活性的调节A→B→•••••→G3737CDE

+ EA→B→C→D→F+反响激活和前〔体〕馈激活示意图 +例1：糖代谢途径中丙酮酸积累激活丙酮酸羧化酶例2：乙酰CoA的积累激活PEP羧化酶3838酶的反馈激活葡萄糖丙酮酸 乙酰CoA活化

磷酸烯醇式丙酮酸 羧化酶 草酰乙酸α-酮戊二酸 拧檬酸1，6-二磷酸果糖〔二〕抑制抑制：由于某些物质的存在，降低酶活性的现象。反响抑制〔feedbackinhibition〕：反响抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑制。 无分支代谢途径的调节 有分支代谢途径的调节1，无分支代谢途径的调节4040通常是在线形的代谢途径中末端产物对催化第一步反响的酶活性有抑制作用。酶活性的调节4141α-酮丁酸异亮氨酸

用。TD苏氨酸酶活性的调节 •例如，在大肠杆菌中，由苏氨酸(Thr)合成异 亮氨酸(IIeu)时，异亮氨酸对催化反响途径中 的第一步反响的苏氨酸脱氨酶(TD)有抑制作42422，有分支代谢途径的调节在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代谢途径中，调节方式较复杂，其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有局部的抑制作用，分支代谢的反馈调节方式有多种:顺序反响抑制〔sequentialfeedbackinhibition〕同工酶的反响抑制〔isoenzymefeedbackinhibition〕协同反响抑制〔concertedfeedbackinhibition〕累积反响抑制〔cumulativefeedbackinhibition〕超相加反响抑制〔cooperativefeedbackinhibition〕酶活性的调节〔1〕顺序反响抑制sequentialfeedbackinhibition

分支代谢途径中的两个末端产物，不 能直接抑制途径中的第一个酶，只有 当两个末端产物都过量时，才能对途 径中的第一个酶有抑制作用。

43

434444•

例如，枯草杆菌在芳香族氨基酸合成中，色氨酸(Try)抑制邻氨基苯甲酸合成酶(AS)，苯丙氨酸(Phe)抑制预苯酸脱水酶(PT)，酪氨酸(Tyr)抑制预I：7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶；II：邻氨基苯甲酸合成酶 苯酸脱氢酶(PD)，预苯酸和分支酸又局部地抑制7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖 酸合成酶(DS)。 PD AS PTPEP：磷酸烯醇丙酮酸；E4P：4-磷酸赤藓糖；DAHP：7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸；CA：分支酸；Per：预苯酸；AA：邻氨基苯甲酸；HPPA：对羟基苯丙酮酸；PPA：苯丙酮酸；Tyr：酪氨酸；Try：色氨酸；Phe：苯丙氨酸；19192.4.1.4细胞透性的调节细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代谢的变化。细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要方式，由它控制着营养物质的吸收和产物分泌。•如在青霉素发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的上下。如果输入硫化物能力增加，硫源供给允足，合成青霉素的量就增多。20•例如，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌吸收乳糖是由渗 透酶和环状AMP(cAMP)协同控制来完成的。cAMP 的浓度是由腺苷酸环化酶(AC)的活性控制的，也就 是说，乳糖的吸收受渗透酶和AMP环化酶的控制， 调节蛋白通过磷酸化的形式和腺苷酸环化酶〔AC 〕或渗透酶结合，分别使腺苷酸环化酶活化或使渗 透酶失活。当有葡萄糖时，乳糖的渗透酶以无活性 状态存在，而腺苷酸环化酶也以非活性状态存在。代谢调节方式21

21BrnEBrnFBrnQ代谢调节方式

L-异亮氨酸的膜渗透情况二、工业菌种育种的常规方法诱变基因转移基因重组育种过程包括以下3个步骤：(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。(3)改进菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。〔一〕诱变育种以微生物的自然变异作为根底的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为根底的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变物理、化学或生物诱变方法

1、诱变剂和诱变处理物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很平安。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否那么有一定危险性。化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的适宜的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射工作时，设备费用大，并要注意平安性。3、大局部诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要防止化学诱变剂与皮肤接触，，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要留神2、诱变剂的选择1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。3．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4．紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。3、诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养别离和筛选(1)出发菌株的选择1．自然界新别离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易到达好的效果。2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大局部是隐性的，特别是高产基因。6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；有的作用于休止期，就可选用孢子。

(2)处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行适宜培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。(3)诱变处理根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。

(4)中间培养由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，假设不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上别离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。(5)别离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的到达初步要求的别离菌落为目的，以量为主。复筛那么是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.例如：初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然别离，纯化菌株。4、常见诱变育种的举例〔1〕紫外线的诱变育种

紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。操作步骤1.将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散参加无菌生理盐水再离心洗涤。2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。

4．取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释别离，计数活菌细胞数。5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。6．取中间培养液稀释别离、培养。7．挑取菌落进行筛选。3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，防止白炽光。(2)亚硝基胍诱变曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。操作步骤1．单孢子悬液制备取斜面，参加6ml0.1mol／LpH6.0的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，假设孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个／ml，此为待处理孢子悬液。2．MNNG溶液的制备用分析天平称取2mg，参加2ml0.1mol／LpH6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。操作步骤〔续〕3．诱变处理吸取MNNG溶液lml，参加到1m1孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度别离培养，30℃3天后计数。4．死亡率计算将未处理的孢子液1ml参加1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释别离，30℃下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选．(3)营养缺陷型的选育营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其根本培养基中参加相应的营养成分才能正常生长的变异株。与营养缺陷型对应的是野生型。能满足野生型菌株正常生长的培养基称根本培养基(MM)；在根本培养基中参加相应的营养成分的称补充培养基(SM)；能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。营养缺陷型的用途

营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。筛选营养缺陷型的步骤诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱诱变方法物理诱变化学诱变淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应参加一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。

检出缺陷型原理：在固体根本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上那么不生长，野生型都能生长。

具体方法：影印法、点种法、夹层法1．将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。2．将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。3．将根本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。

影印法4．将CM和MM在恒温箱中培养。5．二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于GM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。

点种法也就是任意法。用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工作量大。

夹层法先在培养皿上倒一层根本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。营养缺陷型生长谱确实定验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。生长谱测定的方法将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5～6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。—个平皿测一个菌。以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在5～6个平皿上可测20株菌以上。(二)基因育种基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。一个完整的基因克隆过程包括以下步骤１、获得待克隆的DNA片段〔基因〕；２、目的基因与载体在体外连接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重