《西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病苗期复合鉴定技术规程》征求意见稿

3T/JWMA007—2024西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病苗期复合鉴定技术规程本标准规定了西瓜甜瓜品种（系）苗期对枯萎病、蔓枯病抗性鉴定及抗性评价的病原菌准备、西瓜甜瓜苗期管理、病原菌接种、病情分级、调查、抗性分级等联合抗性快速评价技术要求内容。本标准适用于西瓜甜瓜等瓜类品种（系）对枯萎病、蔓枯病抗性鉴定及抗性评价工作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB32/T1189-2008西瓜穴盘育苗技术规程DB32∕T1994-2012甜瓜春提早穴盘育苗技术规程GB/T8321（所有部分）农药合理使用准则GB16715.1瓜菜作物种子第1部分：瓜类3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1病情分级diseasegrade根据植株或离体叶片接种病原菌后植株发病程度或者叶片病斑大小而进行定量化描述。3.2发病率rateofinfected（RI）西瓜甜瓜发病植株数占总调查植株数的百分比.发病率以Ri表示，数值以%计，按公式(1)计算。3.3病情指数diseaseindex(DI)是全面考虑发病率与严重度两者的综合指标。以离体叶片为单位，当严重度用分级代表值表示时，病情指数按公式(2)计算。4注意事项（1）注意用于蔓枯病病菌产生分生孢子的黄瓜材料需要选择新鲜采摘的黄瓜果实。（2）用马铃薯液体培养液制备培养枯萎病菌孢子过程中，建议在培养液中加入链霉素等抗生素，防止细菌污染。（3）枯萎病接种鉴定过程主要需注意控制温度、湿度条件，粗放的环境条件下，建议避开夏季高温和冬季低温，环境温度宜控制在26±2℃,气温过高或过低都不利于枯萎病发病。（4）注意接种后每天都要定期观察发病情况。5苗期联合抗性鉴定方法5.1对照品种（系）4T/JWMA007—2024联合抗性鉴定中需选用一个感病对照和一个抗病对照。西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病抗病感病对照可按表1选择。表1对照品种列表5.2待鉴定品种（系）育苗及管理西瓜育苗管理按照DB32/T1189-2008执行，甜瓜育苗管理按照DB32∕T1994-2012执行。待出苗后长至3-5片真叶，备用。活体接种枯萎病菌后的西瓜甜瓜植株，定植于装有灭菌育苗基质的直径为10cm的营养钵中，置于26±2℃的温室培养管理，待后续观察病情。5.3接种病原菌选择尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.niveum(E.F.Smith)Snyder&Hansen），西瓜枯萎病菌以生理小种1为优势小种，为此宜选用1号生理小种Race1。甜瓜枯萎病菌株用尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.melonis(Leachetcurrence)SnyderetHansen）。蔓枯病菌株（Stagonosporopsiscitrulli.DBJSSY2）采用从病田收集、分离、纯化，并经致病性鉴定后所得的致病性强且稳定的株系。5.4病原菌孢子繁殖准备枯萎病菌孢子悬浮液准备：取西瓜枯萎病菌接种于马铃薯固体培养基（葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂15g,水1000mL），26±2℃培养5天，再将培养好的枯萎病菌丝块接种于马铃薯培养液（葡萄糖20g，马铃薯200g，水1000mL），26±2℃,150r/min暗培养5-7天，4层纱布过滤后，加无菌蒸馏水稀释，用血小球计数板计数，配制成浓度为5×105个孢子·mL-1的孢子悬浮液备用。蔓枯病菌孢子悬浮液准备：取蔓枯病病菌接种于马铃薯固体培养基（葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂15g,水1000mL），26±2℃,16h光照/8h黑暗条件下培养5-7天。选取新鲜无伤口的黄瓜经流动水冲洗干净后，75%酒精擦拭表面，晾干后，在黄瓜表面轻微削去小块表皮，培养好的菌株用直径0.7cm的灭菌打孔器打取菌丝块，菌丝块倒置于黄瓜伤口上，培养箱中26±2℃暗培养，5-7天后根据分生孢子产生情况，用刀片刮取，研磨，4层纱布过滤后，加无菌蒸馏水稀释，用血小球计数板计数，配制成5×105个孢子·mL-1的孢子悬浮液备用。5.5离体叶片准备取直径9cm的培养皿，底部铺设用苯并咪唑植物保鲜水溶液（11.8mg/L）浸湿的滤纸，然后从之前准备的未接种枯萎病的健康植株上每株取下第二节位真叶，放置于滤纸上，以备蔓枯病菌接种用。5.6枯萎病苗期活体和蔓枯病离体叶片复合接种方法5T/JWMA007—2024枯萎病苗期活体接种：将前期在穴盘中长至3-5片真叶的待用植株小心取出，将根部用清水洗净，吸水纸吸去水分，再浸在枯萎病菌孢子悬浮液中，5min后将幼苗移栽于装有灭菌基质，直径为10cm的营养钵中，置于26±2℃温室培养，接种3天后开始观察并统计病情。蔓枯病离体叶片接种：使用喷壶（雾化率98%）将蔓枯菌孢子悬浮液（添加1%Tween80）均匀喷到准备好的同批次离体叶片上，每个叶片喷雾至有明显水滴，然后把培养皿放在光照培养箱中保存，培养条件为：温度26±2℃,光照周期24h黑暗，相对湿度约90%，3天后观察病情并统计数据。6病害分级与鉴定6.1枯萎病分级枯萎病调查分级：病情分级按6级标准调查记载,即：0级：无病症；1级：子叶萎蔫或部分子叶与真叶轻微萎蔫：2级：1个真叶萎蔫或子叶较重萎蔫；3级：子叶及60%以上真叶萎蔫；4级：整株轻度萎蔫，60%以上枯死，但心叶仍成活；5级：整株严重萎蔫并枯死；其中，2级以下为抗病植株，3级以上为感病植株；统计接种后3d叶片，根据发病率进行抗性评价，按公式（1）计算发病率，计算结果分成四个抗性等级，在感病对照发病率达80%以上,判定为鉴定有效，应全面调查，对植株发病数进行计数，计算发病率。6.2蔓枯病分级蔓枯病调查分级：根据离体叶片上病斑的大小进行分级，各病情分级标准如下：0级：叶片没有病斑；1级：叶片病斑面积≤25%；2级：25%﹤叶片病斑面积≤50%；3级：50%﹤叶片病斑面积≤75%；4级：75%﹤叶片病斑面积≤100%。蔓枯病接种3d后开始发病，离体叶片出现病斑，在感病对照病情指数达60.0以上时，判定为鉴定有效，应全面调查。调查结果按公式（1）计算发病率和公式（2）计算病情指数。根据计算结果分为6个等级。6.3鉴定结果对照分级标准6.3.1枯萎病抗性评定标准根据鉴定品种（系）的发病率的大小评定各品种对枯萎病抗性级别，各级别评定标准见表2：表2西瓜甜瓜品种（系）枯萎病抗性评定标准6T/JWMA007—2024S根据鉴定品种（系）的病情指数大小评定各品种对蔓枯病抗性级别，各级别评定标准见表3：表3西瓜甜瓜品种（系）蔓枯病抗性评定标准RS6.4鉴定记载表格西瓜甜瓜苗期抗枯萎病、蔓枯病性鉴定原始记录及结果记载表见表4，抗性鉴定记录保存2年以上。公式（1）…………（1）式中:Ri——发病率；ni——发病植株数；nt——总调查植株数。公式（2）…………………（2）式中:DI——鉴定品种病情指数；dc——相应病级；nc——各病级病叶数；nt——总叶片数。amax——最高病情分级值。1T/JWMA007—2024表4西瓜甜瓜枯萎病、蔓