肿瘤分子生物标志物的流式定量分析

关于肿瘤分子生物标志物的流式定量分析近年来已经发现多种肿瘤生物分子标志物，已将标志物应用于肿瘤诊断、判定疗效、预测预后和转移等方面，且有较大的肿瘤临床和研究的实用价值，并在研究癌变的发生和发展机制中引起人们的极大关注，特别在癌前期病变肿瘤标志物研究中，成为肿瘤防治研究的热点之一，已经显示出在癌变研究中具有重要意义。流式细胞应用于肿瘤分子生物标志的检测已有较多的文献报道，如DNA异倍体、激素受体、癌基因和抗癌基因蛋白产物等，发现这些标志物与恶性肿瘤的发生、发展和细胞的分化、分级、转移和预后有一定相关性，现分述如下：第2页,共49页，2024年2月25日，星期天一、DNA异倍体

研究证明，大部分恶性肿瘤有DNA含量的异常改变(DNA含量的增多或减少)，Badogie等报道，实体瘤的异倍体检出率在60-100%。由于肿瘤细胞在增殖分裂过程中出现DNA合成的丢失或不分离，而产生了DNA异常的细胞群，即出现DNA异常的干系(克隆)，这种DNA异常干系，即称为DNA异倍体。流式细胞术定量分析DNA异倍体，应用于肿瘤的早期诊断和预后评价方面。

第3页,共49页，2024年2月25日，星期天㈠癌前病变出现DNA异倍体及在癌变早期诊断的意义。

癌前期病变是肿瘤防治研究中的一个重要课题，从癌前病变中发现早期癌变的患者，并找出作为早期癌变的特征性标志物，是人们一直努力探寻的方法，使肿瘤得到早期发现、早期治疗具有重要意义。研究发现，在众多的癌前病例中，并非所有的癌前病变都将发生、发展成为癌症。哪些癌前病变将发生癌变，哪此将不发生癌变，是人们正在努力寻找作为癌变的恃征性标志物。第4页,共49页，2024年2月25日，星期天目前，从病理形态学方法对于可能癌变的病例作出一个确切的诊断标准还十分困难。

研究证明，DNA异倍体的出现可能是癌前病变发生癌变的一个重要标志物，已有作者对食管、宫颈、胃、鼻咽、口腔粘膜癌前病变进行了流式DNA倍体分析研究。Tedori等应用FCM分析了20例胃粘膜萎缩性胃炎伴不典型增生细胞的DNA倍体，发现DNA异倍体9例，其中5例在随诊半年后被病理学确诊为癌变，发现异倍体与癌前病变细胞不典型增生程度有关。第5页,共49页，2024年2月25日，星期天作者对208例石蜡包埋组织、和1000多例食管脱落细胞的癌前病变细胞流式DNA倍体分析(见表15)，并指出如下诊断标准，供参考。

1.出现DNA异倍体峰位诊断阳性。2.S期细胞大于15%，G2M期大于10%(突出的四倍体峰位)诊断为阳性。3.S期细胞大于10-15%，并有突出四倍体峰位，诊断为可疑癌。4.GO/1期细胞峰的CV值大于9%，作为参考指标。

第6页,共49页，2024年2月25日，星期天第7页,共49页，2024年2月25日，星期天我们的研究结果(见表16)，表明DNA异倍体可能是重要的癌变标志物。

第8页,共49页，2024年2月25日，星期天从癌前病变中发现早期癌变和潜在癌变病例，并对其作出一个早期预警性诊断，已成为人们十分关注的研究焦点，通过对癌前病变细胞DNA异倍体的FCM检测，可能有助于对癌前病变作出病理学诊断的超早期癌诊断。研究发现癌前病变细胞DNA含量与病变不典型增生程度密切相关(见表17)。DNA指数随不典型增生增高逐渐渐升高，从DNA含量进一步说明癌变并非由正常细胞突发为癌细胞，而是经过一个量变到质变的过程，癌前病变即处于量变过程。

第9页,共49页，2024年2月25日，星期天第10页,共49页，2024年2月25日，星期天第11页,共49页，2024年2月25日，星期天出现DNA异倍体细胞群则证明从量变到质变的过程，Tedori等认为，当癌前病变出现DNA异倍体时，说明已发生癌变或已具有潜在癌变的可能性，尽管还不具备病理形态学的癌变诊断标准，大多数研究者还发现，癌前病变不典型增生程度越重，DNA非整倍体出现率越高，不典型增生程度越重，癌变的发生率越高。由此可见，癌前病变出现DNA非整倍体对预测和诊断癌变是一个重要而有价值的标志物，对于形态学上诊断为癌前病变的病例，有必要进行DNA倍体的检测，对出现DNA异倍体病人，应进行密切的随访，及时发现早期癌变征象，做到早诊断、早治疗。第12页,共49页，2024年2月25日，星期天二、抑癌基因P53蛋白

从生物分子水平研究证明，肿瘤是基因性疾病，是由某些致癌基因激活或抑癌基因的失活(突变或丢失)及其功能的调控失常而促发肿瘤，当各种致癌因子参与下诱导癌基因和抑癌基因的异常改变，其效应分子的基因蛋白产物的过量表达，它们相互之间在肿瘤的发生发展上起着重要作用。第13页,共49页，2024年2月25日，星期天因此，对癌基因与抗癌基因与癌变的关系研究成为肿瘤研究的热点之一，已随着分子生物技术的迅速发展和单克隆抗体技术的应用，大量具有高度特异性识别肿瘤细胞内外抗原的单克降抗体出现，为肿瘤研究寻找到了很多新的标志物。癌基因和抑癌基因在人体组织的调整作用，是通过其效应分子蛋白质产物。近年来，由于生产出多种高度特异的癌基因蛋白产物的单克隆抗体，为探索癌基因与肿瘤发生、发展以及与肿瘤的生物学特性关系的研究辟出了新径。

第14页,共49页，2024年2月25日，星期天P53基因是近年来发现的具有重要作用的抑癌基因，定位于人的17号染色体(17、13、1)其早在1979年就发现了P53基因。当时是在被恶性转化的细胞内发现，被认为是一个原癌基因(oncogene)，因此没有引起研究者的重视，直到1989年，一些科学家的研究有了新发现，认为P53基因存在两种类型：即野生型(wildtype)和突变型(Mutanttype)，这两种类型的P53基因在人体内具有两种不同的作用。第15页,共49页，2024年2月25日，星期天野生型P53可以阻止细胞发生恶性转化，并可阻止受损伤细胞DNA无法修复的细胞DNA复制过程，引起细胞凋亡(Apoptosis)或程序性细胞死亡(programcelldeath.pcd)。这一发现使人们认识到野生型P53的一个重要功能是作用细胞增殖周期的一个调控点(check-point)。野生型P53基因的丢失和突变，使P53基因正常功能丧失，而成为突变型P53基因，科学家研究认为，突变型P53可导致细胞增殖功能的增强。突变后的P53不但失去了正常调控细胞增殖分化的功能，而且可变为一个直接的肿瘤基因，对细胞恶性转化起促进作用。

第16页,共49页，2024年2月25日，星期天近年来的研究发现，在人类大多数恶性肿瘤中均存在P53突变基因，而且不同的致癌物可引起不同的特异性突变谱。因此P53基因的突变已引起肿瘤研究者极大关注。研究认为，癌基因致癌作用是通过其效应分子的癌基因蛋白来发挥其对细胞的转化作用的。因此，检测癌基因蛋白的表达量是一种极有效的研究方法。研究证明，野生型P53基因蛋白具有极不稳定的构型，半衰期很短(约30分钟)，因此，在正常状态下细胞内含量甚微，一般方法很难测量到。然而，突变后的P53基因，其蛋白发生了构型上的改变，半衰期明显延长，稳定性增强，在细胞内形成堆积，含量增高。第17页,共49页，2024年2月25日，星期天近年来许多学者应用流式细胞免疫荧光技术并结合鼠抗人P53基因蛋白单克隆抗体，对多种人类肿瘤进行了P53基因蛋白的定量检测，均检出异常P53蛋白的过量表达。Morkve等应用FCM首先对石蜡包埋支气管肺癌细胞的P53蛋白进行了定量检测，并提出用荧光指数(FluoresenceInd-exFI)来表示P53蛋白表达量。他们的研究发现，P53的表达量与肺癌细胞的分化程度相关，未分化型的小细胞肺癌P53的表达量和阳性表达均明显高于分化型的肺癌的P53表达量，还发现P53表达阳性的肿瘤细胞S期细胞百分比明显高于P53表达阴性者。第18页,共49页，2024年2月25日，星期天由此认为，突变后的P53蛋白可能调节恶性肿瘤细胞增殖速度加快，DNA合成加速起重要作用。齐凤英等应用FCM分析了乳癌和乳腺良性病变细胞P53蛋白表达量，发现良性病变伴有导管上皮异型增生细胞P53蛋白的表达量增高。说明P53蛋白的过量表达在乳腺正常细胞转化一一癌变过程中起直接参与作用，揭示P53突变蛋白的表达将有可能作为癌变早期诊断的一个标志物。研究发现P53蛋白的表达量与乳癌细胞的分化程度密切相关，P53蛋白的高表达多在浸润性乳癌，高度浸润性生长分化差的乳癌P53表达强阳性。第19页,共49页，2024年2月25日，星期天他们还研究了乳癌P53表达量与DNA倍体和预后的关系，发现DNA异倍体乳癌P53表达量明显高于二倍体乳癌，P53表达量高的乳癌细胞增殖活性高于P53表达量低的乳癌。研究结果表明，P53蛋白的表达量与乳癌的预后密切相关，P53阳性表达的乳癌生存期短，P53阴性表达的乳癌生存期长，认为检测P53蛋白的表达量可作为乳癌一个实用的新的预后标志物。第20页,共49页，2024年2月25日，星期天还有作者研究FCM检测乳癌P53蛋白表达的单因素与预后的关系，发现P53阳性表达的乳癌生存期短，且常伴有淋巴结转移的乳癌P53表达阳性，既使淋巴结无转移，但P53表达阳性乳癌生存期亦短，证实P53突变，表达量增高可能是一个有别于其他预后因素而成为一个独立的预后监测指标。还有一些作者研究了膀胱癌、结直肠癌等细胞的P53表达，也证实了P53与肿瘤病理分级相关，随病理分级的增高而P53表达增强。P53的表达与肿瘤的复发、生存率亦有关，过量表达的肿瘤患者生存期短，易复发，预后差。第21页,共49页，2024年2月25日，星期天应用FCM检测肿瘤P53基因蛋白的异常表达提供了客观的量化参量，为判断肿瘤的恶性度、预后以及指导临床治疗，提供新的肿瘤标志物。P53基因失活性突变参与了一系列人类实体癌的早期发展，业已证明P53基因突变直接影响（3阶段)直肠腺瘤(包括结肠腺瘤)向直肠腺癌(包括结肠腺癌)的转化。从临床肿瘤学的观点P53基因突变是处在癌变前的阶段。但从癌症发生的全过程来看，P53基因突变是处于癌症发生与发展的中后阶段(如图26)。

第22页,共49页，2024年2月25日，星期天图－26结直肠癌的多阶段发生过程第23页,共49页，2024年2月25日，星期天至今癌症的确诊主要依靠细胞病理学，大多不能分辨癌症的病因，发现P53特征性突变将有可能使癌症的研究从细胞水平进入分子水平，从能确诊癌的细胞病理学进入能分析基因特征结构的分子生物学，流式细胞技术是能保持细胞和亚细胞成分的完整生活状态下，进行定量分子分析方法。并可为其他分析技术，提供富集制样基础，无疑地，它将为上述转变提供重要的技术基础。

第24页,共49页，2024年2月25日，星期天三、癌基因蛋白产物

㈠

rasP21蛋白

自八十年代发现ras原癌基因以来，肿瘤研究人员对其在肿瘤发生、发展中的作用进行了深入的研究，发现多种人类肿瘤中存在ras癌基因的激活，认为ras基因在肿瘤发生的生物机制中起着十分重要的作用，并发现与人类肿瘤的早期发生和预后有关，所以ras癌基因的激活和其蛋白P21的表达研究已成为目前研究的热点之一。第25页,共49页，2024年2月25日，星期天在众多的癌基因中，人们最关注、研究最深入的是ras原癌基因。在人类恶性肿瘤中，最常见的癌基因之一，ras基因的激活能启动和加速细胞的生长、增殖以致引发细胞的恶性转化，ras原癌基因族(K-ras、N-ras、Ha-ras)P21蛋白产物是一种共同表达的蛋白。

研究证明，ras癌基因的激活与细胞恶性转化有关，当癌变发生时，ras癌基因首先激活，P21蛋白常出现过量表达，rasP21蛋白已被证明在各种人类肿瘤(乳腺癌、肺癌、胃癌)有过量表达。第26页,共49页，2024年2月25日，星期天有作者应用FCM定量分析了膀胱早期癌P21蛋白的表达含量，发现早期癌病变中的P21蛋白表达增高，认为P21蛋白是肿瘤早期阶段的标志物，推测ras癌基因在肿瘤早期就已激活，并随着肿瘤的发展，进一步参与肿瘤的发生、发展过程。还有作者应用流式细胞术定量研究胃癌前病变，口腔癌前病变的rasP21蛋臼的表达，发现rasP21蛋白的表达量与癌前病变不典型增生程度密切相关，说明ras癌基因的激活，在癌变过程中起重要作用，而随不典型增生程度的加重，其表达量逐渐增高。认为rasP21蛋白的表达量有希望成为癌变早期诊断的一个标志物。第27页,共49页，2024年2月25日，星期天同时还发现P21蛋白的表达量与胃癌恶性程度无关，与口腔癌恶性分级有关，但大多数研究证明，rasP21表达是与肿瘤的DNA倍体相关，DNA异倍体的肿瘤P21表达量明显高于DNA二倍体的肿瘤，说明rasP21的表达量多少，明显地调控及影响着恶性细胞DNA合成及其DNA含量的异常改变。P21的表达与肿瘤的增殖分裂具有极好的相关性，表达阳性的肿瘤其S期百分率明显高于表达阴性的肿瘤。说明rasP21蛋白在肿瘤生长增殖过程中起着重要调控作用。第28页,共49页，2024年2月25日，星期天大多定量研究rasP21表达量的报道证实P21蛋白的表达与肿瘤病人的预后密切相关，有作者在对膀胱癌的研究结果发现，P21蛋白表达量高(或表达阳性)复发率及死亡率明显高于阴性表达者，且存活期短，说明P21的过量表达，预示肿瘤具有更恶性生物学行为，揭示肿瘤易复发，预后不良。有些作者认为，P21表达量检测，可以作为肿瘤复发的一个早期信号，如果结合病理分级、临床分期和P21的定量分析，综合性的判断恶性肿瘤病人的预后，对评价预后无疑具有十分重要的意义。

第29页,共49页，2024年2月25日，星期天㈡癌基因C-erbB-2蛋白产物癌基因C-erbB-2位于17号染色体Q21区带上，编码分子为185－190k。有作者研究认为，C-erbB-2癌基因活化，其蛋白产物过量表达在癌症的发生机制中起重要作用。近来有人发现C-erbB-2基因蛋白过量表达和乳腺癌的转化机制有特殊关系，他们用NIH/3T3细胞做转染实验，发现C-erbB-2基因具有促发肿瘤的作用，C-erbB-2蛋白的过量表达，使细胞增殖失去调控，促进细胞恶性转化。第30页,共49页，2024年2月25日，星期天目前研究最多是c-erbB-2癌基因蛋白与乳腺癌的关系，很多文献报道了C-erbB-2在乳癌细胞中的过量表达与乳癌的组织分级，淋巴结转移及激素受体、细胞增殖周期和DNA倍体以及和临床预后关系。有人应用流式细胞术的免疫荧光技术定量研究了乳腺癌、乳腺囊性增生和囊性增生癌变细胞的C-erbB-2蛋白表达，发现囊性增生和囊增癌变细胞的C-erbB-2蛋白表达量逐渐增高，提示在囊性增生并癌变的过程中，C-erbB-2蛋白的过量表达是早期癌变的一个标志物，可作为乳癌早期诊断的一个参考指标。

第31页,共49页，2024年2月25日，星期天他们的研究还发现，C-erbB-2蛋白过量表达的乳癌，DNA含量常为异倍体，且增殖指数也增高。说明C-erbB-2蛋白过量表达对加速细胞DNA合成和细胞增殖有重要作用，大部分研究报道认为，乳腺癌细胞中C-erbB-2蛋白的表达与如下参量有关：

第32页,共49页，2024年2月25日，星期天①与组织学分级有关，随分级的增高，C-erbB-2呈现高表达。②与淋巴结转移和无转移有关。③与DNA倍体有关，二倍体肿瘤表达量低，异倍体肿瘤表达高。④与雌激素受体有关，C-erbB-2蛋白过量表达的乳癌，受体常为阴性。而表达量低的乳癌，受体常为阳性。⑤与临床预后有关，C-erbB-2表达过量的乳癌，无病生存期和总存活期明显缩短，常出现肿瘤复发，而C-erbB-2蛋白表达量低，预后较好，认为是一个重要的预后参数。

第33页,共49页，2024年2月25日，星期天四、肿瘤转移基因CD44CD44基因位于人类11号染色体的短臂上，可分为两种类型，按其外显子表达方式，可称为组成型CD44S和变异型CD44V。研究表明，正常情况下，CD44S基因蛋白是广泛存在细胞膜的跨膜糖蛋白，在大多数上皮细胞、间质细胞和淋巴细胞等均可以检测到该糖蛋白的表达，研究发现，CD44基因蛋白的作用，主要参与细胞与细胞、细胞与基质之间的特异性连接，有如下功用:

第34页,共49页，2024年2月25日，星期天①介导淋巴细胞与毛细血管的小静脉内皮细胞的结合。②参与淋巴细胞的活化。③能与细胞外基质中的透明质酸胶原蛋白、纤维粘连蛋白、层连蛋白分子结合。④参与细胞骨架蛋白结合，使细胞伪足形成，参与细胞迁移运动。变异型CD44V基因与肿瘤转移的关系，是近期人们最新的实验中发现的，目前已成为研究肿瘤转移的一个新的热点课题。

第35页,共49页，2024年2月25日，星期天研究发现，正常组织中和没有转移能力的恶性细胞主要有

CD44S基因蛋白表达，而具有转移能力的恶性细胞主要是变异型CD44V基因蛋白的高表达，但在正常上皮细胞中变异型CD44V仅有很弱的表达，确切证实变异型CD44V基因与肿瘤转移有关，是在1991年德国学者Gunth-er等首先报道了他们突破性研究结果。他们从大鼠胰腺癌细胞中分离到了具有转移能力的细胞株和没有转移能力的细胞株，然后用具有转移能力的细胞膜蛋白作为抗原，制备出了单抗肿瘤细胞与抗体结合，而不与没有转移能力的细胞结合，经过对这一单抗的序列分析后证实为变异型CD44V基因蛋白。

第36页,共49页，2024年2月25日，星期天将变异型CD44V基因首先用于临床肿瘤标本的研究是英国学者Matsumura和他的同事们，他们检测了乳腺癌和结肠癌，发现转移癌都有高水平的CD44V表达而从非转移癌细胞仅能检出很弱的表达。最近有学者应用流式细胞术和抗人CD44单克隆抗体，对种植于小鼠体内黑色素瘤细胞进行了研究分析，认为CD44在肿瘤的生长和转移机制中具有重要作用。第37页,共49页，2024年2月25日，星期天我们应用流式细胞术分析了膀胱癌，乳腺癌细胞的变异型CD44V基因蛋白产物的表达，发现有淋巴结转移的乳癌均有强的表达量，无淋巴结转移的乳癌仅有较弱的表达量。变异型CD44基因蛋白的表达和肿瘤转移的关系的研究尚处于初步研究阶段。

有许多未知有待更深入的探讨，相信随着CD44基因的研究进一步深入将会为肿瘤的转移和诊断提供新的标志物。

第38页,共49页，2024年2月25日，星期天五、血型糖蛋白A(GlyCopt1orinA.GPA)

人类体细胞突变的发生，及其在癌发生的生物分子机制中的作用研究，越来越引起肿瘤学者的极大关注。当人体遭受到致癌因子的损害后，存在于骨髓中的红系造血干细胞的血型糖蛋白A基因位点发生突变，并产生变异的子代红细胞，这种改变可成为一种标记而长期保留下来，而形成红细胞变异株。变异株红细胞表面所携带有GPA抗原(即

M/N血型决定簇)，这种变异的GPA抗原物质是一种特异性的标志物，它的一对等位基因位于染色体4Q28-31。

第39页,共49页，2024年2月25日，星期天目前，已经分离克隆出抗变异型红细胞GPA的单克隆抗体，用荧光探针标记这些抗体就可用流式细胞术检测这些血液中红细胞的GPA变异株的频率，为研究人类活体细胞突变找到一个简便的新方法。有作者使用流式细胞术并结合抗GPA变异型单克隆抗体，对食管癌前病变患者红细胞膜GPA的表达和变异株频率进行了检测，发现癌前病变患者的M/N血型的变异株GPA表达明显高于正常人，说明GPA变异株的检测频率，对有癌变倾向的个体，可作为一个有重要意义的监测标志物。

第40页,共49页，2024年2月25日，星期天也有学者将FCM-GPA表达的检测应用于放射线损害和肿瘤化疗药物引起人类体细胞突变的检测，发现在日本广岛原子弹爆炸后的幸存者中，其GPA变异红细胞频率与其爆炸时(1945年)的受辐射剂量相关，至今已40多年后的幸存者，其骨髓红系造血干细胞GPA位点上仍有突变点并仍可检出变异的子代细胞。这种FCM检测红细胞膜上GPA变异株的方法，比其他检测体细胞突变的方法(DNA修复试验，微核检测，染色体畸变率检测等，这些方法都需要在体外进行细胞培养，需要几天或几周时间才可得出结果)有很大优点。可直接从活体取少量全血，在1-2小时之内就可检出结果，可应用于大量人群体细胞突变的研究，为肿瘤的早期诊断和防治工作提供新的线索和依据。

第41页,共49页，2024年2月25日，星期天六、肿瘤多药抗药性基因蛋白的流式分析

多抗药性(Multidrugresistant，Mdr)基因蛋白P－糖白是近年来的肿瘤抗药性的分子学基础。肿瘤细胞的抗药性具有极复杂的分子生物机制，是影响肿瘤化疗疗效的主要障碍，肿瘤细胞一旦对一种化疗药物产生抗性，对其他结构和功能不同的化疗药物也会产生抗药现象(即为多抗药性)。因此肿瘤多抗药性的研究尤其引人重视。

第42页,共49页，2024年2月25日，星期天80年代中期已经有人从Mdr细胞株中分离出人类Mdr基因，其基因产物的编码为P-糖蛋白，并将人类多抗药基因转染小鼠NIH3T3细胞，得到了多抗药性的细胞株，用抗P-糖蛋白的特异性单克隆抗体检出了该细胞株有人类Mdr基因蛋白产物的表达，进一步证实了P-糖蛋白是产生多抗药性的物质基础。P-糖蛋白介导多抗药基因，在人类分两型，即Mdr1型、Mdr2型，均位于人的7号染色体上，Mdr1型和Mdr2型基因产物具有80%的同源性，但经过基因转染试验证实Mdr2基因产物与多抗药性无关，但Mdr2的作用和生理功能有待进一步探讨。

第43页,共49页，2024年2月25日，星期天Mdr1型是与肿瘤多抗药性有关的重要基因之一，P-170kd糖蛋白是Mdr1型基因表型的分子基础，它具有ATP依赖性主动转运泵的功能，可将药物从细胞中泵出，从而降低细胞内的药物浓度，P-糖蛋白是一种跨膜蛋白分子，主要分布在胞浆膜内一侧，仅有很少一部分分子在细胞膜表面。近年来，已经对P-糖蛋白与临床肿瘤多抗药性的关系进行了大量的探索，并已克隆产生了抗P-糖蛋白的单克隆抗体，现在已有售出商品的单抗，由Malvern等生产的抗P-170糖蛋白C219单抗、Sc