登革病毒实验室检测技术

关于登革病毒实验室检测技术登革病毒的概述

黄病毒科黄病毒属单股正链RNA登革病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个血清型形态结构

球形，直径37nm～50nm

含单股正链RNA，长度约11Kb

编码3种结构蛋白，7种非结构蛋白5’-C-PrM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’3’端非编码区含高度保守的核苷酸序列宿主范围

3种自然宿主：伊蚊、人、低等灵长动物登革病毒成熟颗粒模拟图第2页,共40页，2024年2月25日，星期天普通登革热：登革热(denguefever)是由登革热病毒所引起，由伊蚊传播的急性传染病。其临床特征为突起发热，头痛，全身肌肉、骨骼和关节痛，极度疲乏，皮疹，淋巴结肿大及白细胞减少，部分病人有出血倾向，病情较轻，通常可自行恢复。

登革出血热：

病情较重，致死率高。通常发生于过去已感染过登革病毒而再次感染其他型别的人，发病的严重程度与病人血清原来存在的登革病毒抗体密切关系。登革休克综合症：第3页,共40页，2024年2月25日，星期天全球形势DF广泛分布于有媒介伊蚊存在的热带、亚热带地域。在东南亚、西太平洋和加勒比海地区呈现地方性流行。世界卫生组织警告登革热病例正在迅猛增加已威胁到全球三分之一人口的健康安全WHO估计，全球约25亿的人群处于DF的威胁中。全球每年有5000万人感染登革热病毒，其中50万为DHF病例（其中大部份为儿童）。目前全世界还没有有效的疫苗预防登革热。

第4页,共40页，2024年2月25日，星期天埃及伊蚊白纹伊蚊在东南亚及海南省，埃及伊蚊是本病的主要媒介。在广东、广西，白纹伊蚊是主要媒介。白纹伊蚊孳生于房屋内外的浅水及积水中。成蚊白天吸血，嗜人血。传播媒介第5页,共40页，2024年2月25日，星期天流行病学

患者和隐性感染者是主要传染源。在流行期间，隐性感染者的数量可达全体人群的1/3，可能是最重要的传染源。主要发生于市镇人口集中地区，发病与布雷指数有关。雨季为发病高峰季节。广东省5~10月流行。其中8、9月份为高峰。有一定的周期性（4－5年）。人与人之间不会直接经过呼吸道、消化道或接触等传播。人群易感性和免疫力

人对登革病毒普遍易感，但感染后并非人人发病。由于对不同型别毒株感染无交叉免疫力，因此可以发生二次感染。感染一种病毒型产生的免疫对同型病毒免疫力可持续1～4年，而对异型病毒的免疫则短。第6页,共40页，2024年2月25日，星期天登革热流行与预防有利于DF流行的因素登革病毒（带毒蚊、人、兽）输入输入地自然气候输入地伊蚊密度、屋内处积水容器、居民养花、养莲、建筑工地积水、水缸积水预防登革热健康提醒：1.到登革热流行区旅游或生活，应穿着长袖衣服及长裤，并在外露的皮肤及衣服上涂蚊虫驱避药物；2.如果房间没有空调设备，应装置蚊帐或防蚊网；3.使用家用杀虫剂杀灭成蚊，并遵照包装指示使用适当的分量；4.避免在“花斑蚊”出没频繁时段在树荫、草丛、凉亭等户外阴暗处逗留；5.防止积水，清除伊蚊孳生地；6.尽量避免用清水养植植物；7.对于花瓶等容器，每星期至少清洗、换水一次，勿让花盆底盘留有积水。把所有用过的罐子及瓶子放进有盖的垃圾桶内。第7页,共40页，2024年2月25日，星期天实验室确诊病例普通登革热：登革病毒血清特异性IgM抗体阳性，结合临床症状恢复期血清特异性IgG抗体比急性期有4倍以上增长从急性病人血清、脑脊液或尸解脏器中分离到病毒或检测到病毒序列或检测到病毒抗原登革出血热：多器官大量出血肝肿大血容比增加20％以上登革休克综合症：伴休克第8页,共40页，2024年2月25日，星期天登革热实验室检测常规方法C6/36细胞培养技术登革病毒的分离和鉴定血凝抑制试验（HI）补体结合试验（CF）中和试验（NT）间接免疫荧光试验（IFA）酶联免疫吸附试验（ELISA）胶体金免疫层析快速诊断试验免疫斑点试验

(DIBA)RT-PCR荧光PCR

第9页,共40页，2024年2月25日，星期天标本的采集与保存采集对象主要为登革热疑似病例、临床诊断病例等，必要时采集疑似病例的密切接触者标本。根据采样时间确定检测目的病原学检测初次感染：出现登革热症状的前1～2和发病后的3～5天

再次感染：出现登革热症状的前后1～2天血清学检测

初次感染：出现登革热症状1周后可检测到IgM;2周后可检测到IgG

再次感染：出现登革热症状后1～2天可检测到IgM和IgG

第10页,共40页，2024年2月25日，星期天标本的采集与保存蚊媒标本主要为埃及伊蚊、白纹伊蚊或其它可疑蚊种，检测抗原，常用于登革病毒监测。采集回来的蚊子置－20℃冻死后，按蚊种及捕获地点分组，以每组20～50只分装于螺口冻存管，－70ºC冰箱或液氮保存。蚊媒标本的检测目的是登革病毒分离或登革病毒核酸检测，因此标本采集后应确保存于超低温条件下。第11页,共40页，2024年2月25日，星期天蚊虫标本研磨程序一组标本（50只蚊子）转入1.5ml的eppendorf离心管加入100µl标本处理液用小型电动研磨器将蚊子磨匀补加900µl标本处理液4ºC，10000rpm，离心10min标本处理液:MEM

90ml小牛血清2ml庆大霉素（50µg/ml)100µl两性霉素B（1000µg/ml）1ml青链霉素（1000U/ml）1ml用7.5%碳酸氢钠溶液调至PH7.2。用于：登革病毒分离登革病毒核酸检测剩余的研磨液需保存在-70ºC冰箱中以备复查。注意：研磨过程最好在冰上操作；低温离心机4℃第12页,共40页，2024年2月25日，星期天标本的采集与保存血液标本是登革病毒检测的主要标本，采集5ml为宜，血清、血浆都可，可检测抗原或抗体。用于抗体检测的血清标本最多可在2～8℃保存一周，长期保存应在－20℃以下。用于抗原检测的血清标本应保存于－70℃。全血冰冻溶解后会产生溶血，未分离血清的标本应避免冰冻保存。第13页,共40页，2024年2月25日，星期天感染登革病毒后的免疫反应第14页,共40页，2024年2月25日，星期天采集第二份血的重要性1～7天，70～80％核酸阳性，晚恢复期血清（14－30天）抗体检测可进一步确认可分辨初次和二次感染对于初次感染，晚恢复期血清可用以型别鉴定第15页,共40页，2024年2月25日，星期天检测方法的选择≤5天急性期，3种方法8～13天早恢复期14～30天晚恢复期病毒分离7天抗体检测3小时病毒核酸检验2-3小时血清抗体检测第16页,共40页，2024年2月25日，星期天登革病毒的分离和鉴定所用样本急性期血清、血浆、淋巴细胞尸体组织：尤其是肝、脾、淋巴结、胸腺蚊子样本的保存48小时内进行病毒分离，可放于4－8℃存放时间较长，应把血清分离出来，－70℃保存，避免冻融淋巴细胞，抗凝血应在几小时内送实验室分离方法：敏感细胞分离、乳鼠接种分离、蚊虫接种分离。常用C6/36细胞进行登革病毒分离。鉴定方法：中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、单克隆抗体免疫荧光技术、PCR技术。

第17页,共40页，2024年2月25日，星期天病毒分离1.接种到蚊头(最敏感)2.接种敏感细胞：C6/36，BHK21（成本效益最高）3.接种乳鼠鉴定方法：中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、单克隆抗体免疫荧光技术、PCR技术。第18页,共40页，2024年2月25日，星期天C6/36细胞分离登革病毒单层C6/36细胞的准备（C6/36细胞通常28℃培养2～3天后可长成单层，7～10天传下一代。

C6/36细胞形态为类圆形，易于贴壁生长，但贴壁不牢。

C6/36细胞是传代细胞，理论上可以无限传代。）

细胞管法、细胞板法标本的处理

血清标本、蚊虫标本和组织标本

标本接种

接种、吸附、细胞毒性的处理结果观察

每天观察细胞生长情况第19页,共40页，2024年2月25日，星期天正常C6/36细胞（100X）C6/36细胞接种病人血清第二天时出现的血清毒性现象（100X）细胞培养分离登革病毒第20页,共40页，2024年2月25日，星期天登革1型病毒在C6/36细胞上病变情况（100X）登革2型病毒在C6/36细胞上病变情况（100X）登革3型病毒在C6/36细胞上病变情况（100X）登革4型病毒在C6/36细胞上病变情况（100X）第21页,共40页，2024年2月25日，星期天血凝抑制试验血凝试验血凝抑制试验有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合，使原有的血凝反应被抑制。过去最常规的方法，优点：敏感容易操作，需要的仪器少，结果可靠，HI抗体可存在30～45年；缺点：样本要预处理，必须双份血，难以区分登革病毒感染和其他黄病毒感染（如乙脑病毒、西尼罗病毒等）。第22页,共40页，2024年2月25日，星期天补体结合试验抗体与抗原反应形成复合物，通过激活补体而介导溶血反应，可作为反应强度的指示系统。没有广泛应用，操作较难，可用于检测现感染，不适用于血清流行病学研究。第23页,共40页，2024年2月25日，星期天中和试验（NT）优点：最特异和敏感的方法缺点：昂贵，耗时长，技术复杂，不常用第24页,共40页，2024年2月25日，星期天间接免疫荧光试验抗原抗体荧光标记抗抗体原理：缺点：需要荧光显微镜，和富有经验的试验人员第25页,共40页，2024年2月25日，星期天快速检测试剂全血、血清、血浆含所有检测所需物品储存温度(2-30°C)>90%敏感性和特异性15分钟出结果可鉴别初次和二次感染25tests第26页,共40页，2024年2月25日，星期天酶联免疫吸附试验酶标记登革病毒单抗与登革病毒复合物人IgM抗体抗人IgM单克隆抗体捕捉法（检测登革病毒抗体IgM）IgM抗体出现的比IgG早一点,约5天后可以查到。初次感染的IgM比二次感染高的多，IgM可持续2～3个月诊断意义：IgM阳性不表明现感染，有可能是2～3个月前感染，在登革尚未地方性流行地区，可用于临床检测和人群监测第27页,共40页，2024年2月25日，星期天酶联免疫吸附试验间接法(检测登革病毒抗体IgM或IgG)1.酶标板孔上包被登革病毒抗原2.每孔中加血清标本稀释液（如果含登革病毒抗体IgM或IgG即可结合）3.加HRP标记的二抗（抗人IgM或抗人IgG），在适当的底物作用下呈现颜色反应4.肉眼判断颜色深浅或加终止液后用酶标仪读取每孔不同的吸光值，初步判断标本中抗体的含量IgG非特异，与其它黄病毒有交叉反应，不能用于分型，敏感性比HI好，正取代HI第28页,共40页，2024年2月25日，星期天登革病毒的核酸检测：PCR检测与鉴定登革病毒处理流程

血清（细胞上清或组织研磨液）病毒RNA提取cDNA的合成登革病毒型特异引物PCR扩增凝胶电泳，结果判断用QIAampViralRNAKit或者RocheViralRNAKit提取病毒RNA

根据PCR特异性产物片段大小进行判断

第29页,共40页，2024年2月25日，星期天RT-PCR检测登革病毒基因与分型

登革热诊断标准（WS216-2008）型别引物名称引物序列（5’－3’）扩增片段通用引物D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCGD2TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC511bp1型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG482bpTS1CGTCTCAGTGATCCGGGGG2型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG119bpTS2CGCCAGAAGGGCCATGAACAG3型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG290bpTS3TAACATCATCATGAGACAGAGC4型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG392bpTS4CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA第30页,共40页，2024年2月25日，星期天500bp500bp通用引物PCR结果分型引物PCR结果

MIⅡⅢⅣ

MIⅡⅢⅣ通用产物：511bp分型产物：

Ⅰ：482bp，

Ⅱ：119bp，

Ⅲ：290bp，

Ⅳ：392bp第31页,共40页，2024年2月25日，星期天RealtimePCR检测登革病毒处理流程血清（细胞上清或组织研磨液）病毒RNA提取cDNA的合成RealtimePCR结果判断用QIAampViralRNAKit或RocheViralRNAKit提取病毒RNA

登革病毒是RNA病毒，PCR前先进行RT

根据RealtimePCR后软件分析得到的扩增曲线进行判断

引物与探针的特异性是反应成功与否的关键因素

第32页,共40页，2024年2月25日，星期天登革病毒检测用引物与探针

登革热诊断标准（WS216-2008）登革病毒通用引物

Den-FP：5’GCATATTGACGCTGGGAGAGA

3’Den-RP：5’GGCGTTCTGTGCCTGGAAT

3’登革病毒通用探针Den-Probe：5’

FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB

3’引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成及标记，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。也可用商业化试剂盒（上海之江生产的登革热通用性荧光PCR核酸检测试剂盒）。也可用荧光PCR方法对登革病毒进行基因分型（WS216-2008）。第33页,共40页，2024年2月25日，星期天登革病毒基因组序列测定与分析

DNA序列测定是分析某特定基因的结构和功能的基础。登革病毒基因组的序列分析可反映登革病毒基因变异的遗传信息。通过测定来源于不同时期不同地理区域不同动物宿主登革病毒株的核苷酸序列，可对登革病毒的分子进化史进行系统分析。第34页,共40页，2024年2月25日，星期天E基因：中和抗原表位，型特异表位，在登革病毒的致病和免疫中起着至关重要的作用第35页,共40页，2024年2月25日，星期天历年深圳市登革热病例病毒型别2005年：D2